苏云金芽孢杆菌2,3-丁二醇脱氢酶的研究

论文摘要

海洋细菌被认为是开发新型化合物最有潜力的来源之一,海洋环境的特殊性造就了海洋微生物及其代谢产物的多样性,因而是人们寻找与发现活性物质重要场所。其中,苏云金芽孢杆菌含有大量编码2,3-丁二醇脱氢酶的基因。2,3-丁二醇脱氢酶能够可逆地催化转化2,3-丁二醇和乙偶姻,是生物法制备2,3-丁二醇和乙偶姻的关键酶。目前对于2,3-丁二醇脱氢酶的挖掘研究仅停留在科学研究阶段,且可利用的高效菌株较少,亟待开发更有实际应用价值的菌株及基因。因此,挖掘新型的2,3-丁二醇脱氢酶并研究其催化性质具有非常重要的科研价值和应用价值。本文根据NCBI数据库中收录的2,3-丁二醇脱氢酶的信息,利用生物信息学的方法挖掘出苏云金芽胞杆菌中编码一种尚未表征的2,3-丁二醇脱氢酶基因bdh。利用基因工程技术将编码2,3-丁二醇脱氢酶的基因进行扩增并构建到原核表达载体pET-21a上,随后导入到大肠杆菌中进行诱导表达,利用阴离子交换层析的方法纯化得到2,3-丁二醇脱氢酶,并测定了氧化还原活性,详细研究了其酶学性质,初步探索了其固定化催化特性。研究结果:序列分析表明基因bdh编码的2,3-丁二醇脱氢酶属于中链醇脱氢酶家族,结构和功能分析该酶是一种新型的（2R,3R）-2,3-丁二醇脱氢酶。酶学性质测定其氧化反应最适pH为10.0,还原反应最适pH为7.5,具有广泛的pH值耐受性,在pH值为6-10的范围内显示出较好的酶活性;最适氧化温度和最适还原温度分别为50°C和35°C,在高达70°C的温度下具有较好的热稳定性,同时具有优异的储存稳定性;底物特异性表明该酶对（2R,3R）-2,3-丁二醇,meso-2,3-丁二醇具有较高的氧化活性,对（2S,3S）-2,3-丁二醇没有活性,对乙偶姻和丁二酮具有较高的还原活性,并且氧化活性高于还原活性,证明了其生产乙偶姻的潜在潜力。利用氧化石墨烯固定2,3-丁二醇脱氢酶效率较高,且固定化后保留了游离酶的大部分活性,可循环使用5次仍保留一定的活性,大大降低了经济成本。该研究不仅扩大了（2R,3R）-2,3-丁二醇脱氢酶的研究范围,还为苏云金芽孢杆菌生产对映体纯的2,3-丁二醇的定向进化工程提供依据,为工业化应用奠定了基础。

论文目录

摘要

Abstract

第一章文献综述

1.1 2,3-丁二醇的性质及应用

1.2 乙偶姻的性质及应用

1.3 2,3-丁二醇/乙偶姻的生物代谢途径

1.3.1 生产2,3-丁二醇的菌株

1.3.2 2,3-丁二醇在微生物中的代谢途径

1.4 生物法合成2,3-丁二醇的研究进展

1.4.1 微生物发酵法生产2,3-丁二醇

1.4.2 微生物代谢工程生产2,3-丁二醇

1.5 生物法合成乙偶姻的研究进展

1.5.1 微生物代谢工程生产乙偶姻

1.6 2,3-丁二醇脱氢酶

1.6.1 2,3-丁二醇概述

1.6.2 2,3-丁二醇脱氢酶的研究进展

1.7 固定化酶的研究

1.7.1 酶的固定化载体

1.7.2 酶的固定化方法

1.8 论文的立题依据和研究内容

1.8.1 研究背景、研究目的及意义

1.8.2 技术路线和主要内容

第二章 2,3-丁二醇脱氢酶基因的生物信息学分析与克隆表达

2.1 引言

2.2 实验材料

2.2.1 实验菌株

2.2.2 引物

2.2.3 质粒

2.2.4 培养基

2.2.4.1 分子克隆相关试剂

2.2.4.2 DNA电泳相关试剂

2.2.5 实验仪器

2.3 实验方法

2.3.1 2,3-丁二醇脱氢酶基因bdh生物信息学的分析

2.3.2 Bacillus thuringiensis菌株基因组DNA的提取

2.3.3 2,3-丁二醇脱氢酶基因bdh克隆与表达载体的构建

2.3.3.1 引物设计及目的基因的克隆

2.3.3.2 目的基因与载体质粒的限制性内切酶反应

2.3.3.3 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.3.3.4 目的基因与表达载体的连接及转化

2.3.3.5 菌落PCR及测序鉴定

2.4 结果与讨论

2.4.1 2,3-丁二醇脱氢酶基因BtBDH生物信息学的分析

2.4.2 Bacillus thuringiensis菌株基因组DNA的提取

2.4.3 2,3-丁二醇脱氢酶基因bdh克隆与表达载体的构建

2.4.3.1 2,3-丁二醇脱氢酶基因bdh的克隆

2.4.3.2 2,3-丁二醇脱氢酶基因的转化子菌落PCR验证

2.5 本章小结与讨论

第三章 2,3-丁二醇脱氢酶的表达纯化及酶学性质研究

3.1 引言

3.2 实验材料

3.2.1 主要试剂

3.2.1.1 酶活测定相关试剂

3.2.1.2 蛋白电泳相关试剂

3.2.1.3 蛋白纯化相关试剂

3.2.2 主要仪器

3.3 实验方法

3.3.1 2,3-丁二醇脱氢酶的诱导表达

3.3.2 重组2,3-丁二醇脱氢酶的纯化

3.3.2.1 Ni-NTA亲和纯化重组2,3-丁二醇脱氢酶

3.3.2.2 离子交换层析纯化重组2,3-丁二醇脱氢酶

3.3.2.3 BCA法测定蛋白浓度

3.3.2.4 重组2,3-丁二醇脱氢酶的活性测定

3.3.3 重组2,3-丁二醇脱氢酶酶学性质的研究

3.3.3.1 pH对 BtBDH的影响

3.3.3.2 温度对BtBDH的影响

3.3.3.3 金属离子对BtBDH的影响

3.3.3.4 表面活性剂对BtBDH的影响

3.3.3.5 BtBDH动力学参数的测定

3.4 结果与讨论

3.4.1 重组2,3-丁二醇脱氢酶的纯化

3.4.1.1 重组2,3-丁二醇脱氢酶纯化过程的优化

3.4.2 重组2,3-丁二醇脱氢酶的活性测定

3.4.3 重组2,3-丁二醇脱氢酶酶学性质的研究

3.4.3.1 pH对 BtBDH的影响

3.4.3.2 温度对BtBDH的影响

3.4.3.3 金属离子对BtBDH的影响

3.4.3.4 抑制剂对BtBDH的影响

3.4.3.5 BtBDH动力学参数的测定

3.5 本章小结与讨论

第四章重组BtBDH在固定化酶方面的应用探索

4.1 引言

4.2 实验材料

4.2.1 主要试剂

4.3 实验方法

4.3.0 Hummers法制备氧化石墨烯

4.3.1 红外光谱表征氧化石墨烯

4.3.2 紫外全波长扫描仪表征氧化石墨烯

4.3.3 氧化石墨烯固定BtBDH

4.3.4 考马斯亮蓝染色法测定蛋白浓度

4.3.5 BtBDH@GO的酶活性测定

4.3.6 BtBDH@GO的重复性测定

4.4 结果与讨论

4.4.1 Hummers法制备氧化石墨烯

4.4.2 红外光谱表征氧化石墨烯

4.4.3 紫外全波长扫描仪表征氧化石墨烯

4.4.4 Bradford法测定蛋白浓度

4.4.5 BtBDH@GO的酶活性测定

4.4.6 BtBDH@GO的重复性测定

4.5 小结

第五章总结与展望

5.1 结论

5.2 本论文存在的问题与展望

参考文献

作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果

致谢

附录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 巩凤芹

导师: 谭成玉

关键词: 丁二醇脱氢酶,苏云金芽孢杆菌,丁二醇,固定化酶

来源: 大连海洋大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 大连海洋大学

分类号: Q936

DOI: 10.27821/d.cnki.gdlhy.2019.000141

总页数: 64

文件大小: 2333K

下载量: 73

苏云金芽孢杆菌2,3-丁二醇脱氢酶的研究

论文摘要

论文目录

文章来源

相关论文文献

猜你喜欢