孙彤[1]2003年在《缺铁水稻根转录本微点阵（Microarray）的分析》文中进行了进一步梳理水稻不仅是非常重要的粮食作物，也是用于研究的模式植物之一。缺铁胁迫诱导相关基因的克隆与基因表达调控被列入“973”研究项目，有关的吞噬机理研究被国家自然科学基金项目资助。由于水稻基因组测序的完成，用功能基因组学的现代方法，如转录本图谱分析，蛋白质图谱分析，来研究缺铁相关基因的表达调控是最高效的方法，本论文就是基于此目的来工作的。 在前期工作的基础上，我们精心设计了缺铁和EDTA螯合二价铁诱导3天和5天的水稻根实验，并进行了转录水平的微点阵(microarray)分析。但只获得了第5天的结果。在10531个水稻cDNA芯片图谱中，-Fe与EDTA-Fe比较发现了451个差异点。对缺铁诱导的451个差异cDNA逐一地进行NCBI(美国国家生物技术信息中心)的BLAST(局部定位排列搜索工具)数据库检索、分析、和归类，发现其中缺铁与加铁(-Fe／Fe-EDTA ratio)之间的相对表达水平(REL)在2—9.175之间的缺铁诱导上调基因为203个，包括：质膜蛋白和转运体相关的转录本2个，细胞骨架相关的基因5个，膜泡运输有关的基因8个，物质能量代谢有关的基因15个，调控因子有关的基因10个，细胞周期与调控有关的基因17个，通讯与信息有关的基因16个，未被分类的功能基因23个，其余107个是未知基因。对缺铁诱导的248个下调基因也做了同样的比对和分类。对每一类上调基因都逐一地进行了NCBI-PubMed的文献检索。利用国际网络数据库进行了功能鉴定尝试。可喜的找到了缺铁诱导5天水稻根的信号、信号受体、转录因子及细胞周期中DNA复制执照因子相关的转录本；更令人兴奋的是，几乎找到了一套膜泡流运输质膜蛋白的相关基因转录物，同时证明了中午11:00-2:00之间取样是必要的。不过要寻找与根构型有关的转录本差异，需要做诱导6天、9天乃至更长一些时间的实验设计。要想深入了解信息转导，必须重新补充3天的工作。通过对缺铁诱导5天水稻根的实验中，我们初步发现了信号流、膜泡流、物质能量流以及为适应环境变化而发生的控制根形态变化的细胞周期调控基因转录物之间的联系，最后提出了一个崭新的、具体的缺铁诱导5天的水稻根相关基因转录表达模式。
孙彤, 闫莉婕, 黄勤妮, 印莉萍[2]2004年在《缺铁水稻根转录本微点阵分析》文中指出水稻不仅是非常重要的粮食作物 ,也是用于研究的模式植物之一 .由于水稻基因组测序的完成 ,用功能基因组学的现代方法来研究缺铁相关基因的表达调控是最高效的方法之一。在前期工作的基础上 ,精心设计了缺铁和EDTA鳌合二价铁诱导5天的水稻根实验 ,并进行了转录水平的微点阵 (microarray)分析。但只获得了第 5天的结果。在 10 5 31个水稻cDNA芯片图谱中 ,缺铁和加铁比较发现了 4 5 1个差异点。对缺铁诱导的 4 5 1个差异cDNA逐一地进行NCBI (美国国家生物技术信息中心 )的BLAST(局部定位排列搜索工具 )数据库检索、分析和归类。发现其中缺铁与加铁 ( -Fe/Fe -EDTAratio)之间的相对表达水平(REL)在 2 - 9.175之间的缺铁诱导上调基因为 2 0 3个 ,缺铁诱导的下调基因为 2 4 8个。对每一类上调基因都逐一地进行了NCBI-PubMed的文献检索。利用国际网络数据库进行了功能鉴定。
常正尧[3]2006年在《水稻缺铁胁迫下渗透酶基因的克隆、亚细胞定位及膜泡运输相关基因的分析》文中指出铁在生物体内具有重要的生理功能。但世界范围内约30％的可利用土地为碱性土壤，导致植物缺铁失绿。植物缺铁不仅严重影响了植物的正常生长发育，导致作物减产，还是造成人类缺铁的一个重要原因。 水稻(Oryza sativa L)是人类最重要的粮食作物之一，为全球1／2以上人口提供了主要食物。水稻缺铁的研究对于提高粮食产量，解决人类缺铁有着重要的意义。水稻基因组计划完成后，以功能基因组学方法研究水稻缺铁相关基因的表达调控成为一种有效的方法。在对缺铁水稻根进行10531个cDNA克隆的微点阵分析后，发现与膜泡相关的基因群相对转录表达率最高。利用超薄切片技术，在透射电镜下观察缺铁胁迫下水稻根尖细胞的结构变化，发现缺铁培养的水稻根尖细胞中膜泡的个数较多且明显，表明缺铁可能诱导了膜泡相关基因的高效表达。 对经FeCl_3和缺铁处理的植物凝胶培养基中培养的水稻根进行微点阵分析后，获得309个差异cDNA。通过NCBI的BLAST对其进行了初步的功能分析。 对转运体、膜泡运输相关的基因(IRT、Nramp、YSL、渗透酶基因)和Ferritin进行的Real-Time PCR分析证明缺铁诱导的IRT、Nramp、YSL、渗透酶基因等转录本在缺铁时增多。Ferritin转录本在EDTA-Fe和FeCl_3培养时增多。 通过RT-PCR的方法从缺铁培养5天水稻根中扩增得到渗透酶基因的全长cDNA，1973bp。分别构建了植物正义、反义表达载体pCAMBIA1302-permease(S／A)-GFP，使渗透酶基因与GFP基因构成融合基因，测序结果证明其序列正确。将pCAMBIA1302-permease(S／A)-GFP转入农杆菌EHA105，通过农杆菌侵染洋葱表皮和基因枪轰击洋葱表皮的方法对渗透酶进行了亚细胞定位，结果表明渗透酶定位在质膜上。利用蛋白质分析软件(ConPredⅡ softwear)和NCBI比对，对渗透酶进行了功能、疏水性和跨膜域分析，进一步证明它是一个具有12个跨膜域的质膜蛋白。可能参与黄嘌呤(xanthine)、尿嘧啶(uracil)的转运。 通过叶盘法转化烟草，初步获得MS培养基培养的具有潮霉素抗性芽。最后，初步建立了水稻悬浮系，为研究水稻细胞定位和转基因水稻提供了受体。
闫莉婕, 孙彤, 印莉萍[4]2004年在《缺铁水稻根转录本组及与膜泡运输相关基因的分析》文中提出随着大规模芯片技术(即cDNA微点阵)的开展,这一技术已用于胁迫基因表达的转录本组分析。本论文重点阐述转录 本图谱分析的方法,以及缺铁胁迫下,水稻的基因组表达差异,其中重点是与膜泡运输相关的几个基因。
汪星[5]2008年在《水稻OsNAT7基因启动子的克隆与分析》文中研究指明本实验室前期水稻根基因芯片的研究得到了一个缺铁条件下上调比率最高的基因(OsNAT7)。为进一步研究其转录调控机理,本论文以OsNAT7启动子为研究对象,克隆了该启动子并对其序列进行了生物信息学分析,随后在烟草BY-2悬浮细胞中对OsNAT7启动子的活性进行了分析,为解析该基因的功能提供了参考。生物信息学分析预测到OsNAT7启动子区域含有与铁缺乏响应的顺式作用元件IDE1和IDE2具有同源性的序列。为验证其功能,首先采用巢式PCR获得1.5 kb的启动子片段,并构建OsNAT7p::GUS融合基因。通过基因枪轰击将OsNAT7p::GUS转入到水稻愈伤中,OsNAT7p能够驱动GUS基因顺利表达,表明其具有活性。为进一步确定响应缺铁胁迫的启动子区段,将不同长度OsNAT7启动子5'端缺失片段与报告基因GUS融合构建成系列缺失体,用PEG介导转化烟草BY-2悬浮系原尘质体进行瞬时表达,结果显示含铁和缺铁条件下该启动子活性差异不显着,预测的铁缺乏响应元件不具备功能,表明烟草BY-2细胞中OsNAT7启动子在转录水平不能响应缺铁胁迫。为了获得该启动子的组织器官表达模式,通过农杆菌介导将植物表达载体OsNAT7p::GUS分别转化烟草、水稻和烟草BY-2细胞悬浮系。现已得到转基因的T_0代烟草苗、水稻愈伤和烟草BY-2细胞悬浮系。选用转基因的烟草BY-2细胞悬浮系对OsNAT7p::GUS融合基因的诱导表达模式进行了分析,结果显示在转基因烟草BY-2细胞中OsNAT7启动子的活性与铁＼锰＼铜＼锌浓度的变化没有直接的相关性。添加小分子金属螯合剂柠檬酸可以提高OsNAT7p::GUS的表达水平,推测柠檬酸促进了转基因BY-2悬浮系对铁的吸收和转运,是否直接影响OsNAT7启动子的活性尚不清楚。对OsNAT7启动子顺式作用元件进行了全面的预测,并结合之前基因芯片的结果进行分析,发现启动子区域存在与芯片结果中缺铁上调表达基因相对应的顺式作用元件。暗示OsNAT7基因的表达可能受到其它缺铁诱导基因的调控,植物激素和缺铁所致生理状态的变化同样可能对OsNAT7基因的表达产生影响。
马峰[6]2007年在《OsSEC27p的功能分析及OsYSL1的基因克隆、亚细胞定位》文中进行了进一步梳理本论文针对我实验室前期的基因芯片研究结果，对缺铁胁迫下水稻根中两个上调表达基因OsSec27p和OsYSL1分别进行了克隆、亚细胞定位及功能分析。在对缺铁5天处理的水稻根进行cDNA芯片和realtime-PCR分析时均检测到OsSec27P高表达。在比对芯片中原始的EST序列时发现该基因与酵母中的Sec27P略有同源故命名为OsSec27P。OsSec27p的全长eDNA已被克隆并提交至GenBank，并获得登陆号DQ434847。用报告基因gfp和分子探针FM4-64对其进行亚细胞定位，发现pCAMBIA1302-OsSEC27p∶∶GFP定位于细胞质膜和内膜系统上的小膜泡中。随后，用农杆菌介导将其转入烟草中，并对T_1和T_2代植株进行了分子检测和生理指标检测。应用非损伤性离子扫描技术对转基因烟草幼根进行H~+流动情况的检测，发现OsSec27p基因与氢质子的外向分泌有关。另一方面，克隆OsYSL1并构建植物表达载体pCAMBIA1302-OsYSL1-gfp和表达载体pGPTV-AGPp-BAR-OsYSL1。将重组质粒pCAMBIA1302-OsYSL1-gfp分别转入洋葱表皮细胞和BY-2烟草悬浮细胞中，并进行了细胞定位研究，结果显示OsYSL1定位于细胞质膜上。同时，将重组质粒pGPTV-AGPp-BAR-OsYSL1转入水稻愈伤中进行转基因实验。对OsYSL1进行序列分析发现其与玉米中的ZmYS1有43.43％同源性。因此初步推断它可能和ZmYS1一样是一个高铁载体转运蛋白。
闫莉婕[7]2005年在《水稻缺铁上调基因中与膜泡运输相关基因Sec27p、ARHI的克隆、亚细胞定位与功能分析》文中研究指明水稻作为重要的粮食作物,其对铁相对低效吸收将会导致粮食作物缺铁,因此而导致的与缺铁有关的疾病成为威胁着人类健康的棘手问题之一。随着水稻基因组计划的完成,用功能基因组学来研究水稻缺铁相关基因的表达调控成为解决该问题的有效方法。 本论文针对我实验室前期的基因芯片的研究结果,对水稻缺铁胁迫下相对表达量最高——与膜泡运输相关的一组基因进行了分析。 通过水稻根尖细胞超薄切片的透射电镜观察,发现细胞质膜附近有突起的小泡,且缺铁(-Fe)处理水稻根尖细胞的小泡比加铁(+Fe)处理的小泡大,内含物更多,同时-Fe处理水稻根尖细胞的小泡呈现向胞内、胞外两个方向发生,+Fe处理的样品仅见向胞外发生的小泡。 对水稻缺铁胁迫下上调表达基因中与膜泡运输等相关的16个基因进行比对、分析。通过RT-PCR及REAL-TIME PCR的方法,对其中的ARHI、Sec27p、Tuftelin-interacting、pV72四个基因缺铁胁迫下上调表达进行了进一步的鉴定。 获得Sec27p、ARHI两个基因的全长cDNA;分别构建植物表达载体pCAMBIA1302-Sec27p、pCAMBIA1302-ARHI,通过侵染洋葱表皮细胞观察Sec27p-GFP、ARHI-GFP融合蛋白的瞬时表达,对目的基因进行了亚细胞定位,结果表明Sec27p蛋白定位于细胞质中靠近细胞质膜附近的小泡上;ARHI蛋白位于细胞核及核周边膜状结构上。通过叶盘法转化获得Sec27p、ARHI的转基因烟草,结合NCBI序列比对及蛋白质分析软件的结果,对Sec27p、ARHI进行了功能预测。初步认为Sec27p可能为一内质网到高尔基体转运小泡衣被蛋白的亚基,为水稻在适应缺铁胁迫下根部细胞内膜泡运输增强提供了证据;ARHI可能是一种新的小G蛋白,与核孔对蛋白和RNA的运输等有关,从而调控相关基因的表达。
李宝珍[8]2007年在《水稻吸收和利用不同形态氮素的生理特征和相关基因的表达调控分析》文中指出水稻是中国乃至世界的主要粮食作物之一，而氮(N)是其生产的重要限制因子。水稻在淹水的条件下，以铵(NH_4~+)作为主要的N源，但由于其根系的泌氧作用产生的根际硝化作用导致有相当数量的N以硝态氮(NO_3~--N)的形式吸收。前人已有报道，NH_4~+和NO_3~-混合营养更有利于水稻的生长和N肥的利用。因此，深入认识水稻吸收和利用NH_4~+、NO_3~-的生理机制，特别是从分子水平鉴定和分析调控NH_4~+、NO_3~-吸收和利用相关基因的功能，将对水稻的生产和提高N肥利用率产生积极的作用。本论文以华东地区广泛种植的粳稻品种“武运粳7#”为供试品种，研究了N饥饿7天(d)后，恢复供应不同形态N源(NH_4~+、NO_3~-、NH_4NO_3)在0．5小时(h)到4d对水稻N的吸收和积累及N还原同化中关键酶的生理差异和相关基因的调控，同时利用基因芯片对水稻恢复供应不同形态N素4d后所调控表达的基因进行了分析。另外，以粳稻模式种“日本晴(Nipponbare)”为材料，将基因启动子与GUS报告基因融合，研究了水稻高亲和力NO_3~-转运系统的4个编码基因(OsNRT2；3、OsNRT2；4、OsNAR2；1和OsNAR2；2)的启动子的时空表达特异性，以进一步推测它们的功能。主要研究结果如下：1)通过水培试验，研究了N饥饿7d后，恢复供应不同形态N源对水稻(“武运粳7#”)N的吸收和积累及N同化中关键酶活性的影响。结果表明，缺N刺激根系的生长，增加了根冠比，供应NH_4~+营养抑制根系的生长，降低根冠比。与单一NO_3~-营养相比，供应NH_4~+营养显着地增加地上部生物量和体内的N积累。与单一NH_4~+或NO_3~-营养相比，NH_4NO_3营养促进了水稻对N的吸收和转运，叶片和根系中全N及叶片中NH_4~+-N的含量以NH_4NO_3处理最高，而且增强了根系的谷氨酰胺合成酶和叶片中硝酸还原酶的活性，提高了水稻同化和利用N的能力。另外，与单一NH_4~+营养相比，供应单一NO_3~-或NH_4NO_3混合营养显着增加了根系活力，从而提高了根系吸收N的能力。2)利用半定量RTPCR分析水稻根系的NH_4~+、NO_3~-吸收和还原同化相关基因在恢复供应不同形态N素的表达模式。水稻高亲和力铵转运蛋白编码基因AMT1家属中OsAMT1；1是组成型表达，基本上不受N供应形态和状态的影响；而在N饥饿胁迫下OsAMT1；2和OsAMT1；3的表达很弱，恢复供应2．5 mM的NH_4~+和1．25 mM NH_4NO_3分别增强了OsAMT1；2和OsAMT1；3的表达，NO_3~-营养对OsAMT1；2的表达有明显的抑制作用；单一供NH_4~+或短时间供NO_3~-(恢复供应N2h内)增强了OsAMT1；3表达。说明OsAMTls基因不仅受NH_4~+浓度的调控，而且也受NO_3~-或体内外NH_4~+和NO_3~-平衡的影响。水稻高亲和的硝酸盐转运蛋白编码基因OsNRT2；3，在N饥饿时有较高的表达，而在高N供应时无论是单一NH_4~+、单一NO_3~-还是NH_4NO_3营养均减弱其表达。在水稻N饥饿后供应NO_3~-营养(NO_3~-或NH_4NO_3)迅速诱导了硝酸还原酶编码基因OsNiRl的表达，其中供NH_4NO_3比供单一NO_3~-更能促使OsNiR1的强烈而稳定的表达。相反，在氮同化中起重要作用的谷氨酰胺合成酶(GS酶)编码基因OsGS1；1的表达几乎不受N供应形态和缺N胁迫的影响。3)利用包含水稻21，495寡核苷酸cDNA芯片(代表大约22，000个基因)，以NH_4NO_3营养的水稻根系和叶片样品为对照，分析和鉴定了恢复供应NH_4~+-N、NO_3~--N和继续缺N4d后所调控的水稻的基因。结果表明，不同N营养处理下，根系比叶片响应更敏感。相比较NH_4 NO_3营养，当恢复供应单一的NH_4~+、NO_3~-，在根系显着被调控达2倍以上的基因分别是445和324个，而地上部仅分别为32和58个。这些受调控的基因不仅包含了可能直接参与N的吸收和代谢途径的基因，而且与叶绿素代谢及碳的固定和代谢密切相关。通过对这些被显着调控的基因上游500bp的启动子区域中顺式调控元件分析，鉴定到可能分别与NH_4~+、NO_3~-特异诱导的上游调控基因相结合的顺式调控元件分别是6个和8个。其中ARECOREZMGAPC4的顺式调控元件是包含在几乎所有的NO_3~-特异性诱导表达基因的启动子区，生物信息学分析表明它可能是MYB类型转录因子的结合位点。另外，鉴定到受单一NH_4~+、单一NO_3~-或N饥饿胁迫显着(2倍以上)响应的水稻18个转录因子基因，其中在根系表达的有16个，而在地上部表达的仅有2个。4)将编码水稻高亲和硝酸盐转运蛋白基因的启动子片段与GUS报告基因相融合，再转入到水稻模式种“日本晴”的中，通过检测GUS报告基因的表达，分析了OsNRT2；3、OsNRT2；4、OsNAR2；1和OsNAR2；2的时空表达特异性和它们可能的生理功能。OsNRT2；3在根的中柱和叶脉表达，其功能可能不是主要承担对外部介质中NO_3~-的吸收，而是负责在体内对NO_3~--N的长距离运输或再利用。OsNAR2；1在整个根系特别是根冠强烈表达，说明它可能不仅与NO_3~-的吸收和转运等关系密切，也可能包含在NO_3~-的信号转导途径中作为NO_3~-或其它N营养的信号接收者，调控着根系对营养的吸收。OsNRt2；4和OsNAR2；2在根系和叶片叶脉中均有微弱的表达，其功能有待进一步深入研究。
张文娟[9]2007年在《对分别转有MxIRT1及OsNramp1的转基因酵母进行的蛋白质组及转录本组分析》文中提出MxIRT1和OsNramp1分别是从小金海棠和水稻根中克隆得到的金属转运蛋白。异源功能互补实验证明两种基因均可以互补酵母双突变体fet3fet4中铁的吸收。本研究从蛋白质组和转录本组两个水平对基因及其引起的变化进行研究。研究的第一部分利用蛋白质双向电泳及肽质量指纹谱技术分别对过铁及缺铁条件下的转IRT菌株、正常铁处理条件下的转Nramp及转空载体菌株、正常铁处理及缺铁处理条件下分别转有空载体、IRT及Nramp的酵母菌株进行了蛋白质组分析。通过蛋白质双向电泳技术每种处理条件下的酵母菌株均可分离得到1500个左右的蛋白点。其中对过铁及缺铁条件下的转IRT菌株检索得到8个差异蛋白，分别与细胞骨架、分子伴侣、氨基酸合成，甘油合成等相关；正常铁处理条件下的转Nramp及转空载体菌株中检索得到9个差异蛋白，分别与分子伴侣、糖代谢、亚精胺合成、抗氧化作用等相关；对正常铁处理及缺铁处理条件下分别转有空载体、IRT及Nramp的酵母菌株检索得到11个差异蛋白，除1个为功能未知蛋白外，其它10个差异分别是与糖代谢、蛋白质的生物合成、细胞抗毒害、膜泡运输及信号转导相关的蛋白。研究的第二部分利用基因芯片技术对正常铁处理条件下分别转有空载体、IRT及Nramp的酵母菌株进行了转录本组分析。提取酵母总RNA，通过反转录标记生物素，进行酵母10928个cDNA的芯片杂交。其中，转IRT菌株相对于转空载体菌株上调表达的基因为1200个，下调表达的基因为1140个；转Nramp菌株相对于转空载体菌株上调表达的基因为290个，下调表达的基因为108个。对转Nramp菌株中差异性较为显着的27个上调表达基因和45个下调表达基因进行分析发现，上调表达基因多为与锌指结构相关、与RNA结合、调节子或抑制子和高渗诱导表达基因，下调表达基因多为与膜泡运输、细胞通讯、细胞周期和蛋白质的合成相关。推测在转基因酵母中，由于IRT或是Nramp的转入，单基因多效作用比较明显。除了DNA复制、RNA转录、蛋白质合成、氧化呼吸作用等效应有明显的变化外，转录因子、分子伴侣有特异的分子构型变化，膜泡运输相关的基因变化也诱导转基因酵母菌株对铁浓度变化的响应。
参考文献：
[1]. 缺铁水稻根转录本微点阵（Microarray）的分析[D]. 孙彤. 首都师范大学. 2003
[2]. 缺铁水稻根转录本微点阵分析[J]. 孙彤, 闫莉婕, 黄勤妮, 印莉萍. 生物信息学. 2004
[3]. 水稻缺铁胁迫下渗透酶基因的克隆、亚细胞定位及膜泡运输相关基因的分析[D]. 常正尧. 首都师范大学. 2006
[4]. 缺铁水稻根转录本组及与膜泡运输相关基因的分析[J]. 闫莉婕, 孙彤, 印莉萍. 生物信息学. 2004
[5]. 水稻OsNAT7基因启动子的克隆与分析[D]. 汪星. 首都师范大学. 2008
[6]. OsSEC27p的功能分析及OsYSL1的基因克隆、亚细胞定位[D]. 马峰. 首都师范大学. 2007
[7]. 水稻缺铁上调基因中与膜泡运输相关基因Sec27p、ARHI的克隆、亚细胞定位与功能分析[D]. 闫莉婕. 首都师范大学. 2005
[8]. 水稻吸收和利用不同形态氮素的生理特征和相关基因的表达调控分析[D]. 李宝珍. 南京农业大学. 2007
[9]. 对分别转有MxIRT1及OsNramp1的转基因酵母进行的蛋白质组及转录本组分析[D]. 张文娟. 首都师范大学. 2007