铜绿假单胞菌XN-1随机重组子文库的构建及其在疫苗抗原筛选中的应用研究

论文摘要

目的旨在克服现有抗原筛选方法的不足,构建我国铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）临床分离株XN-1的全基因组文库,从中筛选PA疫苗的候选抗原,为防控PA感染打下基础。方法1.全基因组文库的构建:提取PA XN-1全基因组DNA,内切酶Sau3A I酶切DNA,内切酶BamH I酶切的载体pMal-c5x。通过连接酶将其与随机基因组片段连接,构建随机重组子质粒。转化随机重组子至大肠杆菌感受态细胞X-Blue中。挑选出随机重组子克隆,通过PCR反应和酶切鉴定等方法,对随机重组子进行初步鉴定,评价插入基因组片段的特点。IPTG诱导溶菌酶上清液的阳性重组子的MBP融合蛋白表达,SDS-PAGE检测其表达情况,从而构建PA XN-1全基因组文库。2.PA候选抗原的筛选及保护效果评价:为了进一步从随机重组子文库中筛选到PA疫苗候选抗原,本研究制备了抗MBP多克隆抗体,将其包被于ELISA板上,以捕获随机重组子表达的MBP融合蛋白。以PA感染患者恢复期血清作为一抗,检测随机重组子携带的未知抗原的反应性。测定强反应性抗原的编码序列,通过BLAST序列比对,获得强反应性抗原的基因信息。通过基因工程手段在大肠杆菌中制备候选抗原免疫Balb/c小鼠。ELISA方法检测抗原特异性IgG抗体效价。气管插管攻毒致死剂量PA XN-1,并统计小鼠生存率。综合评价候选抗原的免疫反应性、免疫原性和免疫保护效果,筛选出新的铜绿假单胞菌疫苗候选抗原。结果1.提取PA XN-1的全基因组,经过Sau3A I酶切处理后,DNA条带弥散分布在100-1000bp之间。这些基因组片段与pMal-c5x载体连接,获得随机重组子克隆若干。随机挑选3个重组子克隆,酶切鉴定发现其中2个有基因组片段的插入;PCR方法检测插入片段大小,发现其插入片段位于100-1000bp之间,具有良好的随机性;IPTG诱导随机重组子表达,SDS-PAGE检测重组子蛋白表达情况,发现随机挑选的6个重组子中,有4个成功表达出MBP融合蛋白。这些结果表明,构建PA全基因组文库成功,可用于下一步强反应性抗原的筛选。2.通过13轮试验,筛选获得随机重组子2392个,得到反应性重组子115个,其中,有13个强反应性抗原（相对于PcrV反应强度大于10%的抗原）。这13个抗原分别为:PpiA、PtsP、OprP、CAZ1034235、HmuU2、PcaK、CarAd、RecG、YjiR5、LigD、KinB、RtcA、PscF。3.通过MBP亲和层析法,成功制备了这13个带有MBP标签的强反应性抗原。动物实验发现以上13个抗原免疫,可分别诱导小鼠产生抗原特异性IgG抗体,其效价与MBP诱导的抗体效价有显著统计学差异（P<0.05）。同时,动物攻毒保护实验发现,候选抗原保护率最高的前五名抗原分别是:PscF、LigD、RecG、OprP和PtsP。其中,抗原PscF的保护率最高达95%,抗原LigD和RecG的保护率达80%,抗原OprP和PtsP的保护率达65%。以上结果提示,抗原PscF的免疫保护效果最优。结论本研究成功建立了我国铜绿假单胞菌临床菌株XN-1的全基因组文库,并从中筛选到13个强反应性抗原。进一步通过动物实验证实,强反应性抗原PscF在小鼠上具有良好的免疫原性,且攻毒保护率为95%,提示其是良好的PA候选抗原。这些结果为下一步成功研制PA新型疫苗提供了新的实验依据,对PA感染的防控具有积极的意义。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 许婉婷

导师: 王兴勇

关键词: 铜绿假单胞菌,全基因组文库,抗原筛选

来源: 重庆医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 重庆医科大学

分类号: R392

总页数: 59

文件大小: 1557K

下载量: 24

相关论文文献

• [1].铜绿假单胞菌医院感染分布及耐药性分析[J]. 中国水电医学 2008(06)
• [2].2014～2018年某三甲医院产生物膜铜绿假单胞菌耐药性及患者临床特征分析[J]. 医学信息 2020(02)
• [3].铜绿假单胞菌注射液在防治甲状腺癌颈部淋巴结清扫术后淋巴漏的临床研究[J]. 临床医药文献电子杂志 2020(43)
• [4].铜绿假单胞菌在水体的生长特性研究及其在不同温度下生长预测模型的建立[J]. 广东化工 2018(22)
• [5].铜绿假单胞菌分布及耐药情况分析[J]. 临床合理用药杂志 2018(35)
• [6].某院铜绿假单胞菌获得性肺炎病原菌分析及院感防控[J]. 中国微生态学杂志 2019(05)
• [7].北京市某医院354株铜绿假单胞菌分布及耐药情况分析[J]. 检验医学 2019(06)
• [8].云南省三甲医院3411株铜绿假单胞菌的耐药分析[J]. 中国合理用药探索 2019(09)
• [9].铜绿假单胞菌致一起“假暴发、真聚集”疫情的调查报告[J]. 中国老年保健医学 2017(06)
• [10].不同标本来源铜绿假单胞菌对β-内酰胺酶耐药表型的差异性分析[J]. 现代检验医学杂志 2017(03)
• [11].815例铜绿假单胞菌分布及药敏分析[J]. 按摩与康复医学 2018(02)
• [12].铜绿假单胞菌检测方法的比较与优化[J]. 生物技术通报 2018(03)
• [13].我院2012—2016年铜绿假单胞菌耐药分析[J]. 中国乡村医药 2018(06)
• [14].纺织品中铜绿假单胞菌快速检测方法研究[J]. 棉纺织技术 2018(06)
• [15].左氧氟沙星联合头孢哌酮舒巴坦对铜绿假单胞菌突变选择窗的影响[J]. 海峡药学 2016(12)
• [16].响应面法优化铜绿假单胞菌产鼠李糖脂发酵培养基的研究[J]. 中国酿造 2017(09)
• [17].2012～2014年901株呼吸道铜绿假单胞菌药敏试验分析[J]. 临床肺科杂志 2015(12)
• [18].临床分离铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药性研究[J]. 中国药物与临床 2016(07)
• [19].2014-2016年铜绿假单胞菌的分布及耐药性监测[J]. 家庭医药.就医选药 2017(07)
• [20].瓶(桶)装水要严防铜绿假单胞菌超标[J]. 中国食品 2016(17)
• [21].安罗替尼联合铜绿假单胞菌注射液治疗食管癌的疗效及安全性分析[J]. 肿瘤药学 2019(06)
• [22].铜绿假单胞菌致呼吸机相关性肺炎的危险因素分析[J]. 当代医学 2020(15)
• [23].铜绿假单胞菌注射液对直肠癌患者免疫功能的影响[J]. 中国病原生物学杂志 2020(04)
• [24].包装饮用水中铜绿假单胞菌污染情况分析[J]. 食品安全导刊 2020(20)
• [25].不同疾病标本中铜绿假单胞菌分离鉴定与多重耐药性分析[J]. 中国人兽共患病学报 2019(03)
• [26].铜绿假单胞菌致呼吸机相关性肺炎的危险因素及耐药性研究[J]. 中国现代医药杂志 2019(04)
• [27].铜绿假单胞菌280株基因分型及耐药性分析[J]. 安徽医药 2019(05)
• [28].貂源铜绿假单胞菌耐药性及生物学特性[J]. 河南农业科学 2019(05)
• [29].某部队医院铜绿假单胞菌的分布和耐药性调查[J]. 武警医学 2019(08)
• [30].该院5年来铜绿假单胞菌耐药率变迁分析[J]. 中外医疗 2017(30)

标签：铜绿假单胞菌论文;  全基因组文库论文;  抗原筛选论文;