论文摘要
氨基酸通透酶（AAP）在植物吸收和转运氨基酸的过程中发挥至关重要的作用。拟南芥AtAAP1是植物中发现的第一个氨基酸转运蛋白,在水稻、玉米、马铃薯、豌豆、蚕豆、菜豆等农作物中也有较多报道。目前,关于大豆GmAAP的研究却较为少见,AAP能提高豆科植物对外源氮的吸收与利用率,增加种子内贮藏蛋白含量,进而提升大豆品质。本研究从大豆中成功克隆出GmAAP基因,对其进行生物信息学分析和亚细胞定位,明确该基因行使功能的区域;同时分别在大豆和转基因拟南芥中对该基因的表达模式进行研究;通过20种编码氨基酸亲和试验,结合转GmAAP基因拟南芥种子中20种编码氨基酸含量的试验结果,明确GmAAP蛋白对氨基酸的吸收特性;通过单一氨基酸培养试验,测定转基因大豆发根GmAAP基因表达和氮代谢关键酶活性,旨在解析GmAAP基因与氮代谢的关系。试验结果可为GmAAP功能的研究奠定基础,同时也为大豆氮素的高效利用提供候选基因。主要结果如下:1.以大豆Williams 82为试验材料,通过RT-PCR同源克隆到GmAAP基因,其开放阅读框长度为1440 bp,编码479个氨基酸。生物信息学分析表明,GmAAP蛋白分子量为53.286 kD,理论等电点为8.93,不稳定指数为34.04,蛋白结构稳定;各二级结构占据比例为α-螺旋（47.18%）、β-转角（2.71%）、β-折叠（15.66%）、无规卷曲（34.45%）;跨膜区与疏水性分析显示其含有10个跨膜区,且构成跨膜区的氨基酸多为疏水性氨基酸;GmAAP与野生大豆GsAAP亲缘关系最为相近,且序列比对一致性为100%,与绿豆、木豆、蒺藜苜蓿一致性依次为91.93%、90.55%、82.78%,且其10个跨膜区序列较为保守。构建融合表达载体,利用PEG-Ca2+介导法转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位分析,明确了GmAAP定位在质膜上。2.通过荧光定量PCR分析GmAAP基因在大豆中的表达模式,发现其主要表达部位是根和叶,其次是果荚和种子,在茎和花中表达量最低。获得了转GmAAP拟南芥T3代阳性植株,并通过qPCR测定GmAAP在转基因拟南芥中的表达量,发现其在拟南芥整个生长周期以及各组织部位均有表达,在叶和根中最高,果荚、茎和种子次之,在花中最低。通过缺氮胁迫转基因拟南芥发现GmAAP在叶中相对表达量显著高于根部。3.GmAAP对多数氨基酸都具有一定的亲和力,但其主要负责吸收和转运中性氨基酸,尤其是对芳香族氨基酸、酰胺、脯氨酸以及亮氨酸显现出较强的亲和力。同时其对碱性氨基酸也有一定的亲和力,但不参与酸性氨基酸的摄取。相对于野生型拟南芥,转GmAAP拟南芥种子中20种氨基酸含量多数处于不同程度的增加,其中Ala、Asn、Pro以及芳香族氨基酸增加最为明显,而Asp、Lys、Gly、以及Cys的含量有所降低。过表达GmAAP的大豆发状根在以芳香族氨基酸作为氮源的培养过程中,硝酸还原酶和谷氨酸脱氢酶的活性以及总游离氨基酸含量较对照组有不同程度的增强。相关性分析表明,GmAAP的相对表达量与谷氨酸脱氢酶酶活和总游离氨基酸含量的变化呈显著相关。说明GmAAP能够吸收特定的氨基酸,可用于大豆氮素利用育种研究。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 王俊皓
导师: 崔喜艳
关键词: 大豆,氨基酸通透酶,生物信息学分析,亚细胞定位,基因表达
来源: 吉林农业大学
年度: 2019
分类: 基础科学,农业科技
专业: 生物学,生物学,农作物
单位: 吉林农业大学
分类号: Q943.2;S565.1
DOI: 10.27163/d.cnki.gjlnu.2019.000262
总页数: 58
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相关论文文献
- [1].大豆GmAAP基因的克隆、生物信息学分析及亚细胞定位[J]. 中国油料作物学报 2019(05)