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干旱胁迫下蒺藜苜蓿的转录组分析及醛脱氢酶基因MtALDH7A1初步功能研究

2020-12-08阅读(594)

干旱胁迫下蒺藜苜蓿的转录组分析及醛脱氢酶基因MtALDH7A1初步功能研究

论文摘要

蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）是一年生豆科苜蓿属植物,因其具有基因组小,遗传转化效率高等特点,是继拟南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa）之后的第三个完成全基因组完整测序的模式植物。由于其与紫花苜蓿等豆科植物的亲缘关系较近,相关基因的研究也可以为紫花苜蓿及其它豆科植物提供参考和借鉴。本研究对蒺藜苜蓿A17叶片进行不同时长（0、3、8 h）的干旱处理,取样后进行转录组测序,每次处理重复3次,共计9个样品。通过对转录组测序数据的挖掘及加权共表达网络分析,构建加权共表达网络,探究蒺藜苜蓿干旱逆境胁迫下脯氨酸的积累机制,试验共计找到三个关键模块,其中LightCyan模块相关性最高（cor=-1）,并在LightCyan模块中确定一个模块身份值（MM）较高的醛脱氢酶基因家族基因Medtr2g042330,通过鉴定蒺藜苜蓿全基因组下的醛脱氢酶基因家族:将Medtr2g042330命名为MtALDH7A1,并对其进行试验验证:首先采用实时荧光定量qPCR技术检测不同干旱胁迫处理下地上和地下部位MtALDH7A1基因的表达模式,验证转录组数据的准确性;构建1300-2*35S-GFP植物过表达载体以获得过表达MtALDH7A1转基因拟南芥纯合植株,并进行转基因植株的初步功能研究。取得如下结果:1.两两比较不同干旱时长处理下的基因表达量,分别发现了5747、9096、4059个差异基因（Fold change≥2,FDR<0.05）,将所有的差异基因进行聚类,共聚为8类,其中三个阶段均上调的基因为948个基因,均下调的基因为1306个基因。将所有的差异基因进行韦恩分析显示共有969个差异表达基因是三个阶段共有的差异基因。将以上3223个基因,作为研究的后续基因。2.为了进一步筛选与脯氨酸代谢关系密切的基因,构建具有高度拓扑性质的加权共表达网络,得到10个基因共表达模块,三个关键模块,其中LightCyan模块相关性最高,在LightCyan模块确定一个模块身份值（MM）较高的醛脱氢酶基因家族（ALDH）基因Medtr2g042330。3.基于拟南芥（Arabidopsis thaliana）的14个ALDH基因,利用BLAST方法在蒺藜苜蓿基因组鉴定到28个蒺藜苜蓿中ALDH基因家族成员,并根据醛脱氢酶命名委员会（AGNC）建立的标准,将Medtr2g042330命名为MtALDH7A1。4.将MtALDH7A1转入拟南芥获得转基因植株,对其进行盐和干旱处理,进行初步功能验证,结果表明MtALDH7A1的过表达,通过影响根的生长及侧根数量的增多来增加对盐胁迫和干旱胁迫的胁迫抗性。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 植物抗旱性研究进展
  •     1.1.1 干旱胁迫处理对植物表型的影响
  •     1.1.2 干旱胁迫处理对植物生理的影响
  •     1.1.3 干旱胁迫处理对植物基因表达的影响
  •   1.2 脯氨酸的积累机制
  •     1.2.1 脯氨酸的合成与降解
  •     1.2.2 脯氨酸的转运
  •   1.3 转录组研究
  •     1.3.1 利用基因芯片及转录组测序（RNA-seq）的方法进行转录组分析
  •   1.4 加权共表达网络分析（WGCNA）理论基础
  •   1.5 醛脱氢酶基因
  •     1.5.1 醛脱氢酶基因在植物应对非生物胁迫中的功能
  •     1.5.2 醛脱氢酶基因在植物生长发育中的功能
  •   1.6 研究目的及意义
  •   1.7 研究内容
  • 第二章 转录组测序及数据分析
  •   2.1 试验材料
  •     2.1.1 植物材料及胁迫处理
  •     2.1.2 酶及试剂
  •     2.1.3 主要仪器
  •   2.2 试验方法
  •     2.2.1 蒺藜苜蓿RNA的提取
  •     2.2.2 cDNA文库的构建及上机测序
  •   2.3 转录组数据分析
  •     2.3.1 测序原始数据质控及过滤
  •     2.3.2 序列比对到参考基因组
  •     2.3.3 基因表达定量
  •     2.3.4 差异表达基因的筛选及韦恩分析与趋势分析
  •     2.3.5 候选目标基因Gene Ontology（GO）富集分析
  •     2.3.6 候选目标基因pathway富集分析
  •   2.4 结果与分析
  •     2.4.1 测序结果统计
  •     2.4.2 与参考基因组比对分析
  •     2.4.3 基因表达定量分析
  •     2.4.4 差异表达基因分析
  •     2.4.5 差异表达基因GO富集分析
  •     2.4.6 差异表达基因KEGG pathway富集分析
  •   2.5 小结
  • 第三章 加权共表达网络分析脯氨酸代谢相关基因
  •   3.1 试验材料
  •     3.1.1 植物材料（同2.1.1）
  •     3.1.2 仪器设备
  •     3.1.3 试验试剂
  •   3.2 脯氨酸含量的测定
  •   3.3 加权共表达网络的构建
  •     3.3.1 表达数据的导入、过滤及转置
  •     3.3.2 构建加权共表达网络
  •     3.3.3 加权共表达网络与脯氨酸含量进行关联分析
  •     3.3.4 选定模块枢纽基因进行可视化
  •   3.4 结果与分析
  •     3.4.1 蒺藜苜蓿不同干旱时期脯氨酸含量测定
  •     3.4.2 数据预处理及软阈值的选择
  •     3.4.3 基因模块的确定
  •     3.4.4 脯氨酸含量与模块关联分析
  •     3.4.5 核心基因筛选及kegg富集分析
  •     3.4.6 核心基因可视化分析
  •   3.5 小结
  • 第四章 蒺藜苜蓿醛脱氢酶基因家族的全基因组鉴定
  •   4.1 试验材料
  •   4.2 试验方法
  •     4.2.1 蒺藜苜蓿ALDH基因家族的全基因组鉴定与染色体定位
  •     4.2.2 蒺藜苜蓿ALDH基因家族的系统进化树分析
  •     4.2.3 基因外显子-内含子结构和蛋白质保守基序分析
  •     4.2.4 MTALDH启动子中的顺式元件分析
  •     4.2.5 靶向MtALDH基因的miRNA的预测
  •     4.2.6 基因表达谱和基因本体富集分析
  •   4.3 结果与分析
  •     4.3.1 MtALDH基因的全基因组鉴定
  •     4.3.2 蒺藜苜蓿ALDH基因的系统发育分析和分类
  •     4.3.3 蒺藜苜蓿ALDH基因的结构与功能域分析
  •     4.3.4 保守基序的分析
  •     4.3.5 家族内部基因的重复事件分析
  •     4.3.6 miRNA分析
  •     4.3.7 顺式作用元件分析
  •     4.3.8 基因表达模式分析
  •     4.3.9 基因GO及 KEGG pathway富集分析
  •   4.4 小结
  • 第五章 蒺藜苜蓿MTALDH7A1 基因的克隆及构建载体
  •   5.1 植物材料与仪器试剂
  •     5.1.1 植物材料（同2.1.1）
  •     5.1.2 载体、试剂、仪器
  •     5.1.3 培养基及相关抗生素的配制
  •   5.2 MTALDH7A1 基因的表达分析
  •     5.2.1 qRT-PCR引物设计
  •     5.2.2 实时荧光定量检测MtALDH7A1 基因
  •   5.3 MTALDH7A1 基因的克隆
  •     5.3.1 引物设计
  •     5.3.2 蒺藜苜蓿RNA的提取
  •     5.3.3 cDNA的合成
  •     5.3.4 MtALDH7A1 基因的扩增
  •     5.3.5 PCR产物的回收
  •   5.4 MTALDH7A1 基因过表达载体的构建
  •     5.4.1 载体片段的酶切
  •     5.4.2 目的片段与载体连接
  •     5.4.3 重组质粒的转化及阳性克隆的筛选
  •     5.4.4 质粒提取
  •   5.5 结果与分析
  •     5.5.1 MtALDH7A1 基因的克隆
  •     5.5.2 MtALDH7A1 基因过表达载体的构建
  •   5.6 小结
  • 第六章 蒺藜苜蓿MTALDHA1 基因的拟南芥转化及初步功能验证
  •   6.1 试验材料
  •     6.1.1 植物材料及菌株
  •     6.1.2 培养基及抗生素的配制
  •   6.2 试验方法
  •     6.2.1 农杆菌感受态的制备
  •     6.2.2 农杆菌的电转化
  •     6.2.3 蘸花法转染拟南芥
  •     6.2.4 MtALDH7A1 转基因拟南芥的逐代筛选
  •     6.2.5 MtALDH7A1 基因对拟南芥抗旱、耐盐性的影响
  •   6.3 结果与分析
  •     6.3.1 转基因拟南芥的草铵膦抗性筛选及PCR鉴定
  •     6.3.2 转基因拟南芥的草铵膦抗性筛选及PCR鉴定
  •   6.4 小结
  • 第七章 讨论与结论
  •   7.1 讨论
  •   7.2 结论
  •   7.3 本研究创新点
  •   7.4 展望
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢
  • 作者简介

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 黄思源

    导师: 杨培志

    关键词: 蒺藜苜蓿,拟南芥转化

    来源: 西北农林科技大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,生物学,农作物

    单位: 西北农林科技大学

    基金: 国家自然基金项目“细胞水平多组学解析根瘤调节苜蓿抗旱性的分子机制”(编号:31772600),国家牧草产业技术体系-榆林综合试验站(编号:CARS-34),根瘤提高苜蓿气孔对ABA敏感性的抗旱分子机制研究(编号:31572456)

    分类号: S541;Q943.2

    总页数: 88

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