YY1锌指结构对其转录活性及细胞增殖功能的影响

论文摘要

YY1作为一个多功能的转录因子,根据其招募的辅助因子激活或抑制基因表达。YY1的C-末端由四个锌指结构组成,并负责其与DNA结合。然而,YY1四个锌指各自对其功能的影响尚未完全阐明。在本研究中,利用丙氨酸取代YY1中锌指与DNA结合所必需的半胱氨酸,研究半胱氨酸突变对YY1与DNA结合能力和转录活性的影响,以及对YY1在促进MDA-MB-231细胞增殖中的作用。得出如下结果:1.在原核表达系统中表达并纯化野生型（wt）和突变体YY1蛋白,在这些YY1突变体中,每个锌指中的两个半胱氨酸被丙氨酸单独或同时取代。设计并合成带有YY1结合位点的wt探针和带有突变序列的探针,利用凝胶电泳迁移率实验检测YY1 wt和突变体蛋白与探针的结合亲和力。锌指2和3中半胱氨酸被丙氨酸取代的YY1突变体蛋白完全丧失了与wt探针的结合能力。与wt YY1蛋白相比,YY1锌指1和4突变所产生的YY1突变体蛋白与wt探针结合显著降低。2.YY1 wt和突变体表达质粒分别与构建的CDC6启动子启动Gaussia荧光素酶（Gluc）的表达报告载体共同转染到HeLa细胞中,然后对Gluc活性进行检测。与wt YY1相比,锌指1、2和3突变的YY1突变体导致Gluc活性显著性降低,锌指2和3突变的YY1突变体比锌指1突变的YY1突变体导致更多的Gluc活性降低。锌指4中半胱氨酸突变的YY1突变体对Gluc活性影响与wt YY1相比没有显著改变。3.在MDA-MB-231细胞中,wt YY1的表达可以激活CDC6的转录和抑制p21基因的表达。同时,锌指2和3双半胱氨酸突变的YY1突变体显著地丧失了促进CDC6基因和抑制p21基因表达的能力。另一方面,锌指1和4双半胱氨酸突变的YY1突变体在介导CDC6和p21的表达上与wt YY1相似。4.通过WST-1实验确定YY1突变体对MDA-MB-231细胞增殖的影响。以wt YY1作为对照,在敲低了内源性YY1的同时过表达YY1突变体,检测表达每个锌指内双半胱氨酸突变YY1突变体的MDA-MB-231细胞的增殖。与表达wt YY1的细胞相比,表达锌指1、2和3双半胱氨酸突变的YY1都可以显著抑制细胞增殖,但仅有锌指2和3双半胱氨酸突变的YY1显示出与空载体相似的细胞增殖降低。相反,表达锌指4双半胱氨酸突变的YY1和表达wt YY1的MDA-MB-231细胞增殖没有显著差异。

论文目录

摘要

Abstract

1 绪论

1.1 引言

1.2 YY1基因

1.2.1 YY1概述

1.2.2 YY1与癌症

1.2.3 YY1锌指的功能

1.3 论文的研究目的及其研究意义

2 实验材料与方法

2.1 实验材料与实验仪器

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验仪器

2.1.3 实验试剂的配制

2.2 实验方法

2.2.1 载体质粒构建

2.2.2 慢病毒的包装与侵染

2.2.3 细胞培养与瞬时转染

2.2.4 蛋白表达及纯化

2.2.5 圆二色性光谱实验

2.2.6 电泳迁移率实验

2.2.7 Gluc荧光素酶活性检测

2.2.8 Western Blot实验

2.2.9 细胞增殖测定

2.2.10 实时定量PCR

2.2.11 引物设计

3 实验结果

3.1 YY1蛋白与DNA结合分析

3.2 YY1突变体的结构分析

3.3 YY1半胱氨酸突变体对CDC6转录活性的影响

3.4 YY1双半胱氨酸突变体对乳腺癌细胞增殖和基因表达的影响

3.5 本章小结

讨论

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

附件

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 陈奎达

导师: 隋广超

关键词: 锌指,结合,突变,基因表达

来源: 东北林业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 东北林业大学

分类号: Q78

DOI: 10.27009/d.cnki.gdblu.2019.000689

总页数: 58

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YY1锌指结构对其转录活性及细胞增殖功能的影响

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