泰山松花粉多糖抗急性致瘤性ALV-J及相关肿瘤作用机制的初步研究

论文摘要

J亚群禽白血病病毒（Subgroup J avian leucosis virus,ALV-J）是危害养鸡业的重要病毒之一,感染鸡发生免疫抑制、恶性肿瘤等,严重妨碍了养鸡业的健康发展,造成了巨大经济损失。近年来,由携带v-fps肿瘤基因的急性致瘤性ALV-J病毒感染、诱发的急性纤维肉瘤日趋流行,给养鸡业带来了新的挑战。泰山松花粉多糖（Taishan pinus Massoniana pollen polysaccharide,TPPPS）是一种天然植物大分子,前期研究发现TPPPS具有良好的免疫调节和抗病毒活性。本论文对TPPPS抗急性致瘤性ALV-J及相关肿瘤的作用机制进行了研究,以急性致瘤性ALV-J的Fu-J（SDAU1005）株为研究对象,分别建立体外和体内研究模型,检测分析TPPPS对Fu-J（SDAU1005）复制和肿瘤生长的抑制作用,以及对脾脏淋巴细胞的免疫调节活性,探讨TPPPS免疫调节及抗病毒和抗肿瘤作用机制。1.TPPPS体外抗病毒活性研究本研究首先分别将50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL的TPPPS作用于接种Fu-J（SDAU1005）的DF-1细胞,采用ELISA和qRT-PCR方法检测病毒含量,分析TPPPS对Fu-J（SDAU1005）的抑制作用。结果表明,不同浓度TPPPS均具有抑病毒作用,且具有剂量依赖性,200μg/mL作用效果最为显著,但与100μg/mL差异不显著。进一步,将100μg/mL的TPPPS作用于接种Fu-J（SDAU1005）的DF-1细胞,采用qRT-PCR和IFA检测细胞中Fu-J和SDAU1005病毒的含量,分析TPPPS在Fu-J（SDAU1005）感染DF-1细胞不同时期的抑病毒作用,探讨TPPPS对病毒感染DF-1细胞生长和迁移的作用。结果表明,TPPPS可以通过影响病毒的吸附与释放而发挥抑病毒作用,并且抑制病毒感染的DF-1细胞生长和迁移。2.TPPPS对脾脏淋巴细胞免疫调节活性研究为研究TPPPS对脾脏淋巴细胞的免疫调节活性,选取不同浓度TPPPS和Fu-J（SDAU1005）同时作用于脾脏淋巴细胞,采用MTT法、流式细胞术和ELISA方法,检测分析脾脏淋巴增殖、细胞亚群以及细胞内第二信使Ca2+、cAMP、cGMP、PKC、PKA、Calcineurin和NFAT等细胞内转导信号含量。结果显示,与病毒组和对照组相比,TPPPS能促进脾脏T、B淋巴细胞增殖,CD4+/CD8+比值升高,CD3+、CD4+、CD8+、IL-2、IL-4、IFN-γ、IgG、Ca2+、cAMP、cGMP、PKC、PKA、Calcineurin和NFAT的含量增加。结果表明,TPPPS能够激活脾脏淋巴细胞NO-cGMP、cAMP-PKA、Ca2+-PKC-Calcineurin-NFAT等信号转导通路,对脾脏淋巴细胞具有良好的免疫调节活性。3.TPPPS体内抗病毒和抗肿瘤活性研究为研究TPPPS对病毒复制和肿瘤生长的抑制作用,首先将100只1日龄SPF雏鸡随机分为5组,每组20只鸡,1-4组在每天分别口服1mg、3 mg、5 mg和10 mg TPPPS,5组作为对照组每天口服200μL的PBS,7日龄时各组腿部皮下接种104TCID50病毒液。接毒后每天观察、检测实验动物的临床症状和组织病理变化,持续观察检测20 d。结果表明,不同浓度的TPPPS在体内均具有抗肿瘤作用,且成剂量依赖性,10 mg TPPPS对肿瘤抑制效果最佳,但与5 mg差异不显著。进一步研究,将90只1日龄SPF鸡随机分为3组,V-TPPPS组、V-PBS组和PBS组,每组30只。V-TPPPS组每天口服5 mg TPPPS,V-PBS组和对照组每天口服200μL PBS,V-TPPPS组和V组在7日龄时分别经腿部皮下注射接种104TCID50 Fu-J（SDAU1005）,PBS组接种等体积的PBS。攻毒后每隔5 d采集肿瘤组织、肝脏、胸腺、法氏囊、脾脏和血液,采用qRT-PCR,检测肿瘤组织和血浆中Fu-J和SDAU1005病毒含量,HE染色检测各器官的病理组织学变化。结果显示,与V-PBS组相比V-TPPPS组肿瘤组织和血浆中的病毒含量显著降低,病理组织损伤程度减轻。结果表明,TPPPS体内具有显著的抗病毒和抗肿瘤作用,并可以减轻病毒对组织器官的损伤。4.TPPPS体内抗病毒和抗肿瘤作用转录组学分析采用高通量测序技术,对攻毒后第10 d V-TPPPS组和V-PBS组的腿部肿瘤组织和PBS组实验动物的腿部肌肉组织进行转录组测序,分析比较差异表达mRNA和miRNA及相关信号通路。分析结果,与PBS组相比V-PBS组有6201个DEGs发生了2倍以上的差异表达,其中3183个上调表达,3018个下调表达,DEGs主要富集在P13K-AKT信号通路、MAPK信号通路、P53信号通路、Rap1信号通路、NF-κB信号通路催产素信号通路和粘着斑信号通路等病毒的致病性有关通路。与V-PBS组相比V-TPPPS组有560个DEGs差异倍数在1.5倍以上,其中321个上调表达,239个下调表达,免疫相关基因主要为上调表达,肿瘤相关基因主要为下调表达。DEGs参与调节的信号通路包括T细胞受体信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路、MAPK信号通路、雌激素信号通路、P13K-Akt信号通路、Ras信号通路、JAK-STAT信号通路、NF-κB信号通路和内质网中的蛋白质加工等免疫调节和肿瘤调节相关通路。与V-PBS组相比V-TPPPS组只有2个差异miRNA,1个上调表达和1个下调表达。V-PBS组与PBS组相比有149个差异miRNA,其中82个上调表达,49个下调表达。差异miRNA靶基因预测与mRNA富集通路结果基本一致。结果表明,TPPPS在体内可以升高免疫相关基因的表达,下调肿瘤相关基因的表达,参与免疫调节相关和肿瘤相关信号通路的调节。miRNA参与了病毒的致病性调节,但是TPPPS在体内几乎不参与miRNA调控。选取13个免疫调节相关和9肿瘤调节相关的DEGs在肿瘤组织和细胞上进行进一步的验证。结果表明,TPPPS在体内和体外均可促进TLR2、TLR3、TLR4和CLEC2D受体基因以及PRF1、GZMA和CCL5等免疫相关基因的表达,下调HSP2、BAG3和DNAJN4等肿瘤基因的表达。通过以上研究分析,初步确定TPPPS在体内通过与受体结合激活免疫相关信号通路,抑制肿瘤相关的信号通路,从而发挥抗病毒和抗肿瘤作用。但是,对于他们之间的具体调控关系和相互作用机制还需要通过基因敲除、小RNA干扰、过表达和免疫共沉淀等进行进一步的验证。

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Abstract

1 前言

1.1 禽白血病研究

1.2 ALV病原学特性

1.2.1 ALV抗原分型

1.2.2 ALV基因组结构及组成

1.2.3 ALV蛋白组成

1.2.4 ALV的产生和复制

1.2.5 ALV的流行病学特点

1.3 ALV的防制措施

1.3.1 疫苗接种

1.3.2 抗病育种

1.3.3 药物应用

1.3.4 净化措施

1.4 多糖研究概况

1.5 多糖生物活性

1.5.1 多糖免疫调节活性

1.5.2 多糖抗病毒活性

1.5.3 多糖抗肿瘤活性

1.5.4 多糖其他生物学活性

1.6 松花粉多糖研究概况及生物活性

1.7 高通量测序概述

1.7.1 高通量测序在动物病毒学研究中的应用

1.7.2 高通量测序在肿瘤研究中的应用

1.8 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 试验材料

2.1.2 主要试剂和试剂盒

2.1.3 主要仪器

2.1.4 主要配制试剂

2.2 常规试验操作

2.2.1 ELISA检测p27 抗原

2.2.2 细胞RNA提取

2.2.3 细胞上清或血浆中病毒RNA提取

2.2.4 组织RNA提取

2.2.5 cDNA合成

2.2.6 qRT-PCR扩增

2.2.7 细胞间接免疫荧光

2.2.8 细胞内IL-2、IL-4和IFN-γ检测

2.2.9 B淋巴细胞分泌IgG检测

2.3 TPPPS体外抗病毒活性检测

2.3.1 不同浓度TPPPS对病毒在DF-1细胞上复制的抑制作用

2.3.2 不同作用时期TPPPS对病毒在DF-1细胞上复制的抑制作用

2.3.3 TPPPS对 Fu-J（SDAU1005）释放的影响

2.3.4 TPPPS抑制Fu-J（SDAU1005）感染DF-1细胞的生长

2.4 TPPPS对脾淋巴细胞免疫调节活性

2.4.1 脾脏淋巴细胞分离纯化

2.4.2 流式细胞术检测细胞亚群

2.4.3 MTT法检测脾脏淋巴细胞增殖

2.4.4 细胞因子和IgG含量以及细胞内NO分泌检测

2.4.5 细胞内信号分子检测

2.4.6 细胞转染和萤光报告基因检测

2.5 TPPPS体内抗病毒和抗肿瘤活性研究

2.5.1 不同浓度TPPPS体内抗病毒和抗肿瘤筛选

2.5.2 qRT-PCR检测肿瘤组织和血浆中病毒含量

2.5.3 组织器官HE染色

2.6 TPPPS体内抗病毒和抗肿瘤作用转录组学分析

2.6.1 样品总RNA提取及质量检测

2.6.2 mRNA测序及数据分析

2.6.3 miRNA测序及数据分析

2.6.4 差异表达miRNA与 mRNA的整合分析

2.6.5 qRT-PCR验证DEGs在肿瘤组织的表达

2.6.6 qRT-PCR验证DEGs在细胞中的表达

2.7 统计分析

3 结果与分析

3.1 TPPPS体外抗病毒活性研究

3.1.1 不同浓度TPPPS对 Fu-J（SDAU1005）在DF-1细胞上复制的影响

3.1.2 TPPPS在不同作用时期对Fu-J（SDAU1005）在DF-1细胞上复制的影响

3.1.3 TPPPS对病毒释放的影响

3.1.4 TPPPS抑制病毒感染DF-1 细胞的生长和迁移

3.2 TPPPS对脾淋巴细胞免疫调节活性

3.2.1 TPPPS对脾脏淋巴细胞增殖的影响

3.2.2 TPPPS对脾脏淋巴细胞亚群的影响

3.2.3 TPPPS对脾脏T淋巴细胞分泌细胞因子的影响

3.2.4 TPPPS对脾脏B淋巴细胞分泌免疫球蛋白的影响

3.2.5 TPPPS对脾脏淋巴细胞内NO分泌的影响

3.2.6 TPPPS对脾脏淋巴细胞cAMP和cGMP含量的影响

3.2.7 TPPPS对脾脏淋巴细胞内PKA和 PKC活性的影响

2+的影响'> 3.2.8 TPPPS对脾脏淋巴细胞内Ca²⁺的影响

3.2.9 TPPPS对脾脏淋巴细胞内Calcineurin的影响

3.2.10 TPPPS对脾淋巴细胞核转录因子（NFAT）的影响

3.3 TPPPS体内抗病毒和抗肿瘤活性研究

3.3.1 不同浓度多糖对肿瘤生长的抑制作用

3.3.2 TPPPS降低肿瘤组织和血浆中Fu-J（SDAU1005）含量

3.3.3 TPPPS减少病毒对组织器官的损伤

3.4 TPPPS体内抗病毒和抗肿瘤作用转录组学分析

3.4.1 测序数据与参考序列比对结果

3.4.2 皮尔逊相关系数统计结果

3.4.3 DEGs的鉴定和分析

3.4.4 DEGs的GO和 KEGG通路富集分析

3.4.5 免疫以及肿瘤相关的DEGs鉴定

3.4.6 可变剪切事件分析

3.4.7 差异表达mRNA qRT-PCR验证

3.4.8 miRNA测序分析及测序数据质量

3.4.9 miRNA差异表达鉴定和分析

3.4.10 miRNA靶基因的GO和 KEGG通路富集分析

3.4.11 差异表达miRNA的 qRT-PCR验证

3.4.12 miRNA-mRNA调控网络分析

3.4.13 qRT-PCR验证DEGs在肿瘤组织中的表达

3.4.14 qRT-PCR验证DEGs在细胞中的表达

4 讨论

4.1 TPPPS体外抗病毒活性研究

4.2 TPPPS对脾脏淋巴细胞免疫调节活性研究

4.3 TPPPS体内抗病毒和抗肿瘤活性研究

4.4 TPPPS体内抗病毒和抗肿瘤作用转录组学分析

5 结论

附录

致谢

参考文献

博士期间发表文章

文章来源

类型: 博士论文

作者: 王秋菊

导师: 朱瑞良

关键词: 多糖,转录组,免疫调节,信号通路,抗肿瘤

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 山东农业大学

基金: 本研究由国家自然科学基金项目(3177130834),国家重点研究开发项目 (2017YFD0500706),山东省“双一流”项目(SYL2017YSTD11)

分类号: S852.65

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