不同产地类型罗汉果的品质比较及罗汉果β-香树素合酶基因的克隆与表达分析

论文摘要

罗汉果（Siraitia grosvenorii）是我国特有的传统保健药材,也是国家卫生部首批公布的药食两用植物之一。随着罗汉果在各领域应用的不断拓宽,国内外市场需求量的不断增加,种植区域也越来越大。因此,对不同产地同一品种收获期罗汉果总皂苷、甜苷V和硒的含量进行比较,为其开发利用提供科学依据具有重要意义。三萜皂苷是一组葫芦烷类化合物,被认为是罗汉果主要的活性成分,β-香树素合酶在众多以三萜皂苷为关键活性成分的药用植物中,发挥至关重要的引流作用。对β-香树素合酶基因的研究不但可以揭示其在罗汉果三萜皂苷合成中的作用机制,而且为其次生代谢的调控和遗传改良提供理论指导,为罗汉果更好的开发利用提供科学依据。采用香草醛-浓硫酸分光光度比色法测量各罗汉果果实样品中总皂苷的含量,采用高效液相色谱法测量甜苷V的含量,采用氢化物原子荧光光谱法测量其中硒的含量,并对各指标进行差异显著性分析。在转录组unigene序列基础上,结合cDNA末端快速克隆技术,克隆罗汉果三萜皂苷生物合成途径关键酶β-香树素合成酶（β-amyrin synthase）基因及其负链（minus strandβ-amyrin synthase-like）基因全长cDNA,分别命名为SgβAS（GenBank登录号:MK580640）与SgmβAS（GenBank登录号:MK605687）。通过实时荧光定量PCR检测、SgβAS与SgmβAS基因分别在罗汉果不同时期、不同器官组织中的时空表达。结果如下:1.各样品总皂苷含量在2.42%-3.34%之间,甜苷V含量在0.68%-1.41%之间,硒含量在5.634-41.462μg/kg之间。来源于不同产地的罗汉果样品,其总皂苷含量差异不显著,但甜苷V和硒含量分别表现出显著性差异。广西、湖南和四川,罗汉果果实总皂苷和甜苷V含量均可达到药典指标要求,因此,罗汉果具有较广的种植区域,但不同产地甜苷V含量存在显著性差异,果实中甜苷V的转化效率或成熟度具有一定差异,可能与产地果期有效积温有关,宜根据产地及年度气候条件适当调整收获期,以满足不同加工利用的需要。2.获得SgβAS基因cDNA全长序列2 547 bp,最长开放阅读框为2250bp,编码749个氨基酸,编码蛋白理论分子量为85.94 kD,等电点6.17,平均总亲水性-0.330,脂肪系数76.73,编码蛋白不稳定系数42.86,该蛋白为非跨膜蛋白,属非分泌蛋白,蛋白质中α螺旋占46.52%,β折叠占3.74%,无规则卷曲占49.73%;分子进化分析表明,罗汉果β-香树素合成酶与近缘同属物种苦瓜相应蛋白的亲缘关系最近。SgmβAS基因cDNA全长序列2219 bp,最长开放阅读框为1926bp,编码641个氨基酸,编码蛋白理论分子量为73.36kD,等电点6.27,平均总亲水性-0.158,脂肪系数87.21,编码蛋白不稳定系数49.84,拥有1段跨膜结构,729 aa处于跨膜螺旋结构,细胞质膜定位系数为2（plas:2）,细胞质定位系数为7（cyto:7）,细胞核的定位系数为4（nucl:4）;分子进化分析表明,SgmβAS与近缘同属物种南瓜相应蛋白的亲缘关系最近。3.实时荧光定量PCR分析发现,SgβAS基因与SgmβAS基因在茎、叶、果实中均有表达,SgβAS基因以结实后的叶片中相对表达量最高,其次在50天的果实表达量较高,而果实中SgβAS基因的表达量,在50天以前不断升高,约50天时达到最高值,随后逐渐降低;SgmβAS基因在果期为40天果实表达量最高,其次在主蔓上棚期的叶片中表达较高,在果实中的表达也为先升后降,在叶片中上棚时期含量最高,随时间的推移逐渐降低,SgβAS与SgmβAS可能分别同时参与早期的萜类骨架代谢及三萜合成分流控制过程。本研究的成果可为进一步深入研究罗汉果的遗传转化等功能提供一定的数据支持和理论基础。

论文目录

摘要

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1 绪论

1.1 罗汉果的品质研究进展

1.1.1 罗汉果研究利用概况

1.1.2 罗汉果药理与毒理

1.1.3 罗汉果有效成分的测定

1.2 罗汉果次生代谢研究进展

1.2.1 次生代谢的合成路径

1.2.2 罗汉果次生代谢相关基因的研究

1.2.3 βAS基因的研究概况

1.3 研究内容与目的意义

1.3.1 研究内容

1.3.2 研究创新点

1.3.3 研究目的与意义

2 不同产地罗汉果的品质比较分析

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 材料

2.2.2 试剂与仪器

2.2.3 方法

2.3 结果与分析

2.3.1 不同产地罗汉果甜苷V与总皂苷含量

2.3.2 不同产地罗汉果硒含量

2.4 小结

3 罗汉果中SgβAS与 SgmβAS基因的克隆与分析

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 材料

3.2.2 方法

3.3 结果与分析

3.3.1 cDNA的克隆

3.3.2 SgβAS基因的生物信息学分析

3.3.3 SgmβAS基因的生物信息学分析

3.4 小结

4 罗汉果中SgβAS与 SgmβAS基因的表达

4.1 引言

4.2 材料和方法

4.2.1 材料

4.2.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.3.1 SgβAS基因差异表达

4.3.2 SgmβAS基因差异表达

4.4 小结

5 总结与展望

5.1 研究总结

5.2 问题与展望

参考文献

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨凤轩

导师: 袁汉文

关键词: 罗汉果,三萜皂苷,香树素合成酶,克隆,荧光定量

来源: 广西民族大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,农作物

单位: 广西民族大学

分类号: Q943.2;S567.239

DOI: 10.27035/d.cnki.ggxmc.2019.000314

总页数: 69

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不同产地类型罗汉果的品质比较及罗汉果β-香树素合酶基因的克隆与表达分析

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