导读:本文包含了杂合酶论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:层析,蛋白质,肝素,空间结构,聚糖,大肠杆菌,超氧化物。
杂合酶论文文献综述
张群,吴秀芸,蒋绪恺,赵越,王禄山[1]（2018）在《大数据时代杂合酶的设计及其新趋势》一文中研究指出酶分子的高效性和稳定性是工业广泛应用的物质基础。利用分子生物学技术可以将不同酶分子通过串联、插入、翻译后融合等方式构建成符合工业需求的杂合酶,但应用中多结构域杂合酶在表达量与酶活等方面仍存在弊端,而基于特定蛋白质结构域的多功能设计成为新趋势。高通量测序技术的发展,使得生物学家正面临着爆炸式增长的大数据集。近年来"蛋白质功能区"概念的提出,拓宽了人们对蛋白质结构与功能组织层次的认知,功能区残基聚簇的协同演化可导致同一家族不同蛋白质功能的差异。基于海量大数据分析可以快速定位特定功能区以及协同进化的关键位点,再利用合成生物学技术就可实现多种功能残基在同一蛋白质中的精准嫁接,完成天然酶分子的再设计。这将是杂合酶技术发展的新阶段,也会成为生物大数据时代下蛋白质设计的新趋势。(本文来源于《生物工程学报》期刊2018年07期）
贺丹丹[2]（2016）在《CTX-M型杂合酶生化特性及遗传特征研究》一文中研究指出近年来,CTX-M型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的出现给临床治疗带来了极大的挑战,叁种CTX-M杂合酶(CTX-M-64、-123和-132)已经在我国动物源大肠杆菌中检测到,它们对大多数头孢菌素类表现出增强的水解活性,其基因序列暗示了这些杂合基因可能是通过bla_(CTX-M-14)和blaCTX-M-15的重组形成。本文旨在比较杂合酶及其母体酶的动力学参数,结合蛋白空间结构分析其催化作用机制,并探索杂合基因的可能形成途径,为CTX-M酶的进一步研究提供科学依据及参考数据。本研究通过PCR方法扩增出杂合酶(CTX-M-132、-123和-64)及其母体酶(CTX-M-55、-15和-14)的编码基因完整序列(876bp)及不含信号肽的序列,并将其插入p ET-28b表达载体。重组质粒转入E.coli BL21(DE3),分别用于MIC值的测定及蛋白表达。在蛋白表达水平一致的情况下,测定携带blaCTX-Ms全长的六株重组菌对各种β-内酰胺类抗生素的MIC值。结果显示,产CTX-M-14的菌株对除了氨苄西林外的所有受试抗生素的MIC值最低,产CTX-M-64、CTX-M-132、CTX-M-123和CTX-M-55的菌株对头孢噻肟和头孢他啶的MIC值高于CTX-M-15,其中CTX-M-64对头孢噻肟的MIC值最高。整体来看,六种blaCTX-Ms基因的耐药性水平从低到高的顺序为:bla_(CTX-M-14)、bla_(CTX-M-15)、bla_(CTX-M-55)、bla_(CTX-M-132)、bla_(CTX-M-123)和bla_(CTX-M-64)。β-内酰胺类抑制剂(克拉维酸、他唑巴坦和舒巴坦)对六种酶都有较好的抑制作用,其中克拉维酸和他唑巴坦的抑制作用较强,与头孢噻肟联用后的MIC比单独使用头孢噻肟时减小高达近70000倍。SDS-PAGE结果显示,六个目的蛋白的大小均约为28k Da,最佳表达条件是IPTG1.0mmol/L,30℃诱导培养5h。通过亲和层析和凝胶过滤层析方法得到纯度大于99%的目的蛋白,用于酶动力学参数的测定。结果显示,这些酶的催化活性(kcat/Km)与MIC结果相似,CTX-M-14对除了头孢噻吩外的所有β-内酰胺类抗生素的催化活性最低,而CTX-M-64对头孢硝基噻吩、头孢呋辛、头孢噻呋、头孢曲松和头孢噻肟的催化活性最高。CTX-M-15对除了氨苄西林外的β-内酰胺类抗生素的催化活性均低于CTX-M-55及叁个杂合酶CTX-M-64、-132和-123的催化活性。另外,叁种抑制剂对六种CTX-Ms酶的抑制水平均在纳摩级,其中舒巴坦的IC50和Ki值高于克拉维酸,而克拉维酸略高于他唑巴坦。结合酶动力学参数,对六种CTX-Ms酶的氨基酸序列及空间结构进行比较分析。结果发现,CTX-M-55与CTX-M-15相差仅一个氨基酸残基A77V,但CTX-M-55对超广谱头孢菌素类药物表现出相对较强的催化活性。结构分析显示,第77位氨基酸位于活性位点远端,CTX-M-55更可能是通过V77与不同α螺旋上的关键氨基酸形成疏水键,从而稳定蛋白空间结构中螺旋群的核心架构并促成更加稳定的活性部位构象。稳定构象的形成促成了CTX-M-55的较高结构稳定性,进而表现出了较高的催化效率和对温度变化的耐受性。从CTX-M-15、CTX-M-132、CTX-M-123到CTX-M-64的演变是通过向CTX-M-15中逐渐引入活性中心远端残基的过程,并且在演变过程中它们对超广谱头孢菌素类药物的催化活性也在逐渐增强。与CTX-M-14相比,CTX-M-64对头孢菌素类增强的催化活性及对β-内酰胺酶抑制剂增强的敏感性大部分也是由于活性中心远端残基的引入。这些结果表明,活性中心远端的氨基酸残基增强了CTX-M酶对超广谱头孢菌素类药物的催化活性。通过PCR测序的方法,对实验室保存的分离自2010~2013年的大肠杆菌检测blaCTX-M杂合体基因,并对阳性大肠杆菌进行多位点序列分型。通过接合转移或化学转化的方法获得携带杂合酶基因和其可能来源基因bla_(CTX-M-15)和bla_(CTX-M-55)单一质粒的接合子或转化子,S1-PFGE鉴定质粒大小,并对质粒进行复制子分型。对分别携带bla_(CTX-M-15)、bla_(CTX-M-64)、bla_(CTX-M-123)和bla_(CTX-M-132)的四个质粒p HNY2-1、p HNAH46-1、p HNAH4-1和p HNLDH19进行高通量测序并分析其结构。结果发现,携带bla_(CTX-M-15)的Inc I2质粒p HNY2-1、携带bla_(CTX-M-55)的质粒p HN1122-1、携带bla_(CTX-M-64)的质粒p HNAH46-1和携带bla_(CTX-M-132)的质粒p HNLDH19都含有相同的插入序列ISEcp1-blaCTX-M-Inc A/C,并且质粒骨架几乎一致,说明杂合基因可能起源于bla_(CTX-M-15)。携带bla_(CTX-M-123)的质粒p HNAH4-1为Inc I1型(ST108),含有ISEcp1-bla_(CTX-M)-Inc A/C-Inc I2片段,提示ISEcp1介导blaCTX-M-Inc A/C-Inc I2转移到Inc I1型质粒上。采用PCR测序及限制性内切酶片段长度多态性分析(RFLP)等方法进一步研究p HNAH46-1和p HNAH4-1的相似质粒在动物源大肠杆菌中的扩散情况。结果从不同省份、不同农场和不同动物中分别检测出5株携带有与p HNAH46-1相似的Inc I2质粒和9株携带有与p HNAH4-1相似的Inc I1(ST108)质粒,这表明携带杂合基因bla_(CTX-M-64)和bla_(CTX-M-123)的质粒已经在动物源大肠杆菌中广泛传播。(本文来源于《华南农业大学》期刊2016-06-01）
王燕[3]（2013）在《内切型纤维素酶辕木聚糖酶杂合酶的构建及其酶学特性的分析》一文中研究指出本研究中我们以来源于草菇中的纤维素酶(EGI)以及木聚糖酶（Xyn）基因为融合对象，选取纤维素酶(EGI)基因中的连接肽（Linker）作为两个功能域之间的连接肽，采用酶连法，成功构建了含有纤维素酶（EGI）基因催化域（EGICD）以及木聚糖酶(Xyn)基因的两种不同结构的双功能杂合酶重组质粒。其中木聚糖酶基因在前的记作：pPICZαB-Xyn-EGICD；纤维素酶催化域在前的则记作：pPICZαB-EGICD-Xyn，两者分别转入毕赤酵母KM71H中成功表达。表达的杂合酶经纯化后分别做了底物特异性，酶学性质，以及水解天然底物等实验。结果显示，2种结构的杂合酶都保留了原亲本酶的活性，其中EGICD-Xyn对2%CMC以及1%beechwood的酶活力较亲本酶都降低了10%；而Xyn-EGICD对1%beechwood的酶活力较亲本提高了14.3%，对2%CMC酶活力有少许降低。在最适温度，最适pH、温度耐受、pH耐受等方面，杂合酶的性质较亲本酶有一定的改变，但变化不大。其中在温度耐受方面，杂合酶Xyn-EGICD的纤维素部分50℃时的温度耐受比原酶Xyn有一定的提高，而杂合酶EGICD-Xyn的温度耐受不如亲本酶。可见，2个功能域在融合时，前后位置的变化对融合酶的一系列酶学性质存在一定的影响。最后，还对酶活力较高的融合酶Xyn-EGICD进一步做了水解天然底物小麦麸皮与甘蔗渣的实验。比较发现，在相同分子数的条件下，杂合酶Xyn-EGICD水解天然底物的效果较Xyn、EGICD2种亲本酶都有明显提高。可见杂合酶在处理天然底物方面更经济有效。(本文来源于《南京林业大学》期刊2013-06-01）
韩镇[4]（2013）在《嗜热杂合酶的设计、克隆表达与性质表征》一文中研究指出近年来，酶在工业生产中发挥着越来越重要的作用。但有些天然酶达不到工业生产的要求，这时候就需要借助蛋白质分子设计对天然酶进行改造。按照改造部位的多寡可以把蛋白质分子设计分为小改、中改和大改。小改可以通过点突变或化学修饰来完成；中改是对来源于不同蛋白质的结构域进行拼接或组装，即产生杂合酶；大改就是从头设计全新的蛋白质。本论文中利用结构域的互换构建了两个杂合酶。本课题组在之前的工作中，已经分别开展了对来自于嗜热古菌Aeropyrum pernix K1的嗜热酰基肽水解酶APE1547和来自于Sulfolobus Tokodaiistrain7T(JCM10545)的嗜热酰基肽释放酶ST0779的研究。通过序列比对及结构分析之后，我们发现APE1547和ST0779的序列相似度不高，催化结构域的序列相似性更高达41.7%，但是APE1547与ST0779的推进器结构域的差别较大，而且它们的底物特异性差距更大。因此我们将ST0779的推进器结构域转移至APE1547的催化结构域以得到杂合酶SA，期望杂合酶有新的酶学性质。本课题组解桂秋博士的博士论文已经证明，N端的第一个α螺旋对APE1547整个分子的稳定发挥着很重要的作用。因此为了验证该α螺旋是否影响杂合酶分子的稳定性，同时我们也构建了去掉N端第一个α螺旋的杂合酶NO-SA。我们首先通过计算机软件辅助的手段确认了我们关于设计方案中杂合酶的稳定性。初步确定嵌合点所在的合理区域，然后通过分子动力学模拟确定了最佳嵌合方案。实验证明，杂合酶SA与NO-SA在酶学性质上表现跟我们之前设想的一样，不仅在酶活力上发生较大的改变，而且在酶底物特异性和热稳定性也存在明显差异。而去掉N端第一个α螺旋的杂合酶NO-SA与杂合酶SA在酶学性质上也有较大不同。两杂合酶与嗜热酰基肽释放酶ST0779的最适酯酶底物不同，且对于长链底物(多于8个碳)两杂合酶具有比其更高的催化活力。两杂合酶的最适反应温度均介于两亲本酶的最适反应之间。在最适反应温度下，杂合酶SA酶活可达1501.59U/mg。但在相同温度条件下，杂合酶SA具有比杂合酶NO-SA更高的催化活力。最适反应pH方面，APE1547与ST0779均在pH8.0时获得了最大活力；但缓冲体系不同。两杂合酶的最适反应pH也均为8.0，且最适缓冲体系与APE1547的相同。热稳定性方面，从Tm值来看，嗜热酯酶APE1547的热稳定性最好，杂合酶SA高于嗜热酰基肽释放酶ST0779，而杂合酶NO-SA的Tm值低于两双亲酶。大部分金属离子对酶活力影响不大，而金属螯合剂EDTA对四个酶的活性有不同程度的抑制作用。从动力学参数看，两杂合酶与双亲酶存在很大差异，且两杂合酶之间也有很大不同。与亲本酶相比，两杂合酶在有机溶剂中的稳定性相对差了些，24h后只在二甲基亚砜中检测到了活性。去掉N端第一个α螺旋的杂合酶NO-SA在催化能力和热稳定性等方面与杂合酶SA有明显差距，说明该α螺旋不仅帮助底物水解，还对整个酶分子的稳定有一定作用。杂合酶技术在改变酶的特性、研究结构与功能的关系上起着重要作用，而且杂合酶的产生也扩大了天然酶的应用范围。杂合酶可以用酶或酶片段构建新催化剂去催化天然酶无法催化的反应；能创造自然界不存在的具有新反应活性的新酶品种。杂合酶技术将传统酶学活性筛选方法同简便的DNA重组技术有机结合起来。这将会使分子生物学家更加得心应手地设计和剪裁酶(或蛋白质)分子，也会让蛋白质工程学显示出更加强大的威力和诱人的前景。(本文来源于《吉林大学》期刊2013-05-01）
韩镇,解桂秋,高仁钧[5]（2013）在《杂合酶的研究现状与发展前景》一文中研究指出近年来,随着人们对环境和能源问题的关注,以酶为催化剂的绿色生物催化技术越来越受到重视,而酶的催化能力是影响酶能否进行工业化应用的重要因素,同时,因催化不同反应的需要,新酶开发显得十分迫切。杂合酶技术是基于已有酶资源来进行新酶的设计和开发的技术,其具有独特的优点,尤其是目前酶的表达克隆、分子筛选、人工进化、DNA序列改组和体外突变等技术已成为常规技术,为杂合酶的开发及生产奠定了基础。本文对杂合酶的构建策略、构建方法及发展前景作一综述,为其应用和开发提供参考。(本文来源于《中国生物制品学杂志》期刊2013年04期）
程安阳,范立强,赵健,李小灵,王刚[6]（2011）在《重组人SOD2/3杂合酶的制备及其生物活性初探》一文中研究指出为获得重组SOD2/3杂合酶,以及观察SOD2/3能否转导入宫颈癌细胞,抑制肿瘤细胞的增殖,构建了原核表达载体pET-SOD2/3,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达获得N端带有6个组氨酸标签的SOD2/3杂合酶;用Ni柱金属螯合亲和层析纯化重组SOD2/3;利用肝素柱层析验证SOD2/3的肝素靶向性;将纯化后的融合蛋白加入体外培养的宫颈癌细胞,通过FITC和MTT实验观察杂合酶SOD2/3的转导能力及其在细胞内的活性。成功构建了SOD2/3杂合酶的表达载体,重组SOD2/3表达量占菌体总蛋白30%左右;金属螯合亲和层析一步纯化,回收率在70%以上,纯度达90%左右;重组酶能与肝素亲和层析结合,说明杂合酶SOD2/3有肝素靶向性;细胞实验证实SOD2/3较SOD2能更好地抑制Hela细胞生长。获得了较纯的重组SOD2/3杂合酶,该酶能直接以天然有活性的形式转导人宫颈癌细胞内并抑制其细胞增殖,具有很好的作为肿瘤治疗、抗氧化损伤药物的潜力。(本文来源于《华东理工大学学报(自然科学版)》期刊2011年06期）
周大海,范立强,赵健,程安阳[7]（2011）在《重组人SOD2/3杂合酶原核表达及纯化方法的研究》一文中研究指出目的摸索工程菌的表达条件并分离纯化,获得高活性的重组人SOD2/3杂合酶(rhSOD2/3)。方法利用含有质粒pET-28a-SOD2/3的工程菌诱导表达rhSOD2/3,考察诱导温度、诱导剂浓度、Mn2+浓度与加入时机对重组酶表达量与活性的影响;利用金属螯合亲和层析纯化rhSOD2/3。结果重组酶的表达量占菌体总蛋白40%~50%,最佳表达温度15℃、诱导剂浓度0.5 mmol/L,Mn2+浓度2.5 mmol/L,表达时间16 h,亲和层析能较好的纯化rhSOD2/3,比活从粗酶液220 U/mgpr提高到930 U/mgpr以上。结论成功获得了rh SOD2/3最适的表达条件及纯化方法。(本文来源于《食品与药品》期刊2011年11期）
张玲玲,巴丽娜,林章凛,朱玉山[8]（2010）在《P450酶特性研究与新型杂合酶的构建》一文中研究指出细胞色素P450酶是一类在自然界中广泛存在的含有亚铁血红素的酶系,能够催化以小分子有机物单加氧反应为主的多种生物化学反应,在药物生产和人类健康等领域发挥着重要的作用。细胞色素P450酶催化过程的核心是辅基血红素HEME中铁离子与氧气分子的反应,涉及2个电子转移的步骤。经由氧化还原辅酶的电子传递成为P450酶催化循环的前提,该酶也因和氧化还原辅酶耦合方式的不同而分为3类。作为1个电子自给自足的多域细胞色素P450,P450BM3能够将NAD(P)H产生的电子100%用于产物生成,其高效的催化性能为研究P450酶结构功能关系和电子传递机制提供了优良模板。仿照P450BM3构建P450杂合酶是近年来细胞色素P450酶研究领域的热点之一。本文总结了细胞色素P450酶的催化过程和分类,以及P450BM3酶的界面、连接肽、电子传递和活性位点的相关研究成果,并简要介绍了细胞色素P450杂合酶的人工构建。我们依据蛋白质系统优化的方法,将理性设计与实验验证相结合,从事构建和改善细胞色素P450sca-2杂合酶,以期通过酶法转变调血脂药物普伐他汀生产过程中转化效率低且成本高的现状,具有重要的应用价值。(本文来源于《计算机与应用化学》期刊2010年01期）
周大海[9]（2009）在《重组人SOD2/3杂合酶的原核表达、分离纯化及其生物活性研究》一文中研究指出超氧化物歧化酶(superoxide dismutase简称SOD)是一类催化超氧化物阴离子(O2-)歧化反应的金属酶；在人和哺乳动物中有3种：细胞内的Cu,Zn-SOD(SOD1)、线粒体中的Mn-SOD(SOD2)和胞外液含Cu和Zn的EC-SOD (SOD3)。SOD,尤其Cu,Zn-SOD,已广泛应用在防辐射、抗衰老、防治肿瘤等方面,但Cu, Zn-SOD和Mn-SOD体内半衰期短,不能与内皮细胞特异结合性,大大限制了它们的应用潜力。胞外超氧化歧化酶(SOD3),能利用其C端肝素结合区定位在富含肝素的细胞表面或胞外基质上,在体内的半衰期较长,正好弥补了Cu,Zn-SOD和Mn-SOD的缺陷,除超氧化物歧化酶活性外,还有调节NO的活性,是一种较SOD1及SOD2更好的药物。但迄今,重组SOD3在原核生物和酵母中的表达都不甚理想。因此构建具有SOD活性、SOD3长半衰期、靶向性能的SOD替代品具有重要意义。本论文利用基因重组技术将人SOD2基因与SOD3 C端肝素结合区基因融合获得SOD2/3杂合酶基因,成功构建该融合基因的大肠杆菌表达质粒MnSOD-ECSOD3-pET28a,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了该融合蛋白的表达、优化；其最优表达条件为：15℃终浓度0.5mM IPTG和2.5mM Mn2+诱导16小时,重组杂合酶的表达量占菌体总蛋白30-40%；使用镍柱、肝素柱和DEAE-52离子交换叁种方法对杂合酶进行了纯化,均获得比活力提高5倍左右、电泳纯的杂合酶；体外抗肿瘤实验表明纯化后的杂合酶对Hela细胞有明显的生长抑制作用。(本文来源于《华东理工大学》期刊2009-12-30）
范立强[10]（2009）在《SOD2/3杂合酶在大肠杆菌中的克隆、表达与纯化》一文中研究指出超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是一类催化超氧化物阴离子(O_2~(-~·))歧化反应的金属酶。人和哺乳动物中的SOD有3种:细胞内的Cu,Zn-SOD(SOD1)、线粒体中的Mn-SOD(SOD2)和胞外液含Cu和Zn的EC-SOD(SOD3)。作为O_2~(-~·)清除剂,SOD在防辐射、抗衰老、防治肿瘤等方面得到广泛应用,且以Cu,Zn-SOD的研究更加深入全面,但由于Cu,Zn-SOD在体内半衰期短(仅6min),不能与内皮细胞特异结合,大大限制了其应用潜力(本文来源于《第六届全国SOD学术研讨会论文集》期刊2009-09-26）
杂合酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
近年来,CTX-M型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的出现给临床治疗带来了极大的挑战,叁种CTX-M杂合酶(CTX-M-64、-123和-132)已经在我国动物源大肠杆菌中检测到,它们对大多数头孢菌素类表现出增强的水解活性,其基因序列暗示了这些杂合基因可能是通过bla_(CTX-M-14)和blaCTX-M-15的重组形成。本文旨在比较杂合酶及其母体酶的动力学参数,结合蛋白空间结构分析其催化作用机制,并探索杂合基因的可能形成途径,为CTX-M酶的进一步研究提供科学依据及参考数据。本研究通过PCR方法扩增出杂合酶(CTX-M-132、-123和-64)及其母体酶(CTX-M-55、-15和-14)的编码基因完整序列(876bp)及不含信号肽的序列,并将其插入p ET-28b表达载体。重组质粒转入E.coli BL21(DE3),分别用于MIC值的测定及蛋白表达。在蛋白表达水平一致的情况下,测定携带blaCTX-Ms全长的六株重组菌对各种β-内酰胺类抗生素的MIC值。结果显示,产CTX-M-14的菌株对除了氨苄西林外的所有受试抗生素的MIC值最低,产CTX-M-64、CTX-M-132、CTX-M-123和CTX-M-55的菌株对头孢噻肟和头孢他啶的MIC值高于CTX-M-15,其中CTX-M-64对头孢噻肟的MIC值最高。整体来看,六种blaCTX-Ms基因的耐药性水平从低到高的顺序为:bla_(CTX-M-14)、bla_(CTX-M-15)、bla_(CTX-M-55)、bla_(CTX-M-132)、bla_(CTX-M-123)和bla_(CTX-M-64)。β-内酰胺类抑制剂(克拉维酸、他唑巴坦和舒巴坦)对六种酶都有较好的抑制作用,其中克拉维酸和他唑巴坦的抑制作用较强,与头孢噻肟联用后的MIC比单独使用头孢噻肟时减小高达近70000倍。SDS-PAGE结果显示,六个目的蛋白的大小均约为28k Da,最佳表达条件是IPTG1.0mmol/L,30℃诱导培养5h。通过亲和层析和凝胶过滤层析方法得到纯度大于99%的目的蛋白,用于酶动力学参数的测定。结果显示,这些酶的催化活性(kcat/Km)与MIC结果相似,CTX-M-14对除了头孢噻吩外的所有β-内酰胺类抗生素的催化活性最低,而CTX-M-64对头孢硝基噻吩、头孢呋辛、头孢噻呋、头孢曲松和头孢噻肟的催化活性最高。CTX-M-15对除了氨苄西林外的β-内酰胺类抗生素的催化活性均低于CTX-M-55及叁个杂合酶CTX-M-64、-132和-123的催化活性。另外,叁种抑制剂对六种CTX-Ms酶的抑制水平均在纳摩级,其中舒巴坦的IC50和Ki值高于克拉维酸,而克拉维酸略高于他唑巴坦。结合酶动力学参数,对六种CTX-Ms酶的氨基酸序列及空间结构进行比较分析。结果发现,CTX-M-55与CTX-M-15相差仅一个氨基酸残基A77V,但CTX-M-55对超广谱头孢菌素类药物表现出相对较强的催化活性。结构分析显示,第77位氨基酸位于活性位点远端,CTX-M-55更可能是通过V77与不同α螺旋上的关键氨基酸形成疏水键,从而稳定蛋白空间结构中螺旋群的核心架构并促成更加稳定的活性部位构象。稳定构象的形成促成了CTX-M-55的较高结构稳定性,进而表现出了较高的催化效率和对温度变化的耐受性。从CTX-M-15、CTX-M-132、CTX-M-123到CTX-M-64的演变是通过向CTX-M-15中逐渐引入活性中心远端残基的过程,并且在演变过程中它们对超广谱头孢菌素类药物的催化活性也在逐渐增强。与CTX-M-14相比,CTX-M-64对头孢菌素类增强的催化活性及对β-内酰胺酶抑制剂增强的敏感性大部分也是由于活性中心远端残基的引入。这些结果表明,活性中心远端的氨基酸残基增强了CTX-M酶对超广谱头孢菌素类药物的催化活性。通过PCR测序的方法,对实验室保存的分离自2010~2013年的大肠杆菌检测blaCTX-M杂合体基因,并对阳性大肠杆菌进行多位点序列分型。通过接合转移或化学转化的方法获得携带杂合酶基因和其可能来源基因bla_(CTX-M-15)和bla_(CTX-M-55)单一质粒的接合子或转化子,S1-PFGE鉴定质粒大小,并对质粒进行复制子分型。对分别携带bla_(CTX-M-15)、bla_(CTX-M-64)、bla_(CTX-M-123)和bla_(CTX-M-132)的四个质粒p HNY2-1、p HNAH46-1、p HNAH4-1和p HNLDH19进行高通量测序并分析其结构。结果发现,携带bla_(CTX-M-15)的Inc I2质粒p HNY2-1、携带bla_(CTX-M-55)的质粒p HN1122-1、携带bla_(CTX-M-64)的质粒p HNAH46-1和携带bla_(CTX-M-132)的质粒p HNLDH19都含有相同的插入序列ISEcp1-blaCTX-M-Inc A/C,并且质粒骨架几乎一致,说明杂合基因可能起源于bla_(CTX-M-15)。携带bla_(CTX-M-123)的质粒p HNAH4-1为Inc I1型(ST108),含有ISEcp1-bla_(CTX-M)-Inc A/C-Inc I2片段,提示ISEcp1介导blaCTX-M-Inc A/C-Inc I2转移到Inc I1型质粒上。采用PCR测序及限制性内切酶片段长度多态性分析(RFLP)等方法进一步研究p HNAH46-1和p HNAH4-1的相似质粒在动物源大肠杆菌中的扩散情况。结果从不同省份、不同农场和不同动物中分别检测出5株携带有与p HNAH46-1相似的Inc I2质粒和9株携带有与p HNAH4-1相似的Inc I1(ST108)质粒,这表明携带杂合基因bla_(CTX-M-64)和bla_(CTX-M-123)的质粒已经在动物源大肠杆菌中广泛传播。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
杂合酶论文参考文献
[1].张群,吴秀芸,蒋绪恺,赵越,王禄山.大数据时代杂合酶的设计及其新趋势[J].生物工程学报.2018
[2].贺丹丹.CTX-M型杂合酶生化特性及遗传特征研究[D].华南农业大学.2016
[3].王燕.内切型纤维素酶辕木聚糖酶杂合酶的构建及其酶学特性的分析[D].南京林业大学.2013
[4].韩镇.嗜热杂合酶的设计、克隆表达与性质表征[D].吉林大学.2013
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