CRISPR/Cas9介导的水稻网格蛋白突变体的制备及其功能分析

论文摘要

网格蛋白是由三条重链（CHC）和三条轻链（CLC）组成的三脚架复合体。网格蛋白介导的内吞（clathrin-mediated endocytosis;CME）是一种进化保守的内吞途径,也是真核细胞质膜蛋白内吞的主要途径之一。研究表明,网格蛋白在双子叶模式植物拟南芥的生长发育中起着关键性的调控作用,例如器官发育、生长素极性运输、向性生长和营养物质吸收等。然而,网格蛋白对单子叶植物的生长发育的生物学功能至今没有被报道。CRISPR技术是一种新兴的基因编辑技术,具有成本低、操作简单、高效等优点,成为功能缺失突变体制备的首选方法,对深入剖析基因功能具有重要意义。为探究单子叶模式植物水稻网格蛋白的生物学功能,本研究利用CRISPR/C as9技术制备水稻网格蛋白重链、轻链敲除突变体,运用细胞生物学、分子遗传学、水稻杂交技术、水稻转基因技术及生理生化等方法与策略,初步分析了水稻网格蛋白的遗传学功能。具体研究结果如下:（1）制备了chc、clc和Hub转基因突变体,经人工杂交和测序分析,成功获得chc单突变体和双突变体及clc单突变体、双突变体和三突变体。Hub转基因植株已获得但待鉴定。此外,已将相关荧光信号分子标记转育到chc、clc突变体中,为水稻网格蛋白的细胞生物学分析打下基础。（2）水稻农艺性状分析鉴定结果表明,与野生型相比,chc和clc突变体的多个农艺性状（包括初生根根长、根系大小、株高、分蘖、剑叶长、叶宽、主穗长、一次枝梗、二次枝梗、结实率和千粒重等）均呈显著性降低。这些结果揭示了水稻网格蛋白对水稻产量性状形成具有重要调控作用。（3）因chc突变体表现出叶早衰表型,本研究测定了多个衰老指标（包括叶片暗培养、叶绿素含量、过氧化物的含量、衰老相关基因表达量和光合作用指标等）。结果表明,与野生型相比,突变体衰老速度慢、过氧化物含量和衰老相关基因表达量上调、叶绿素含量和光合速率下降。这些结果表明CHC在叶衰老过程中具有重要调控作用。（4）植株剑叶角度定量分析结果表明,与野生型相比,chc和clc突变体叶角均显著性增大。qRT-PCR定量结果表明,与野生型相比,chc和clc突变体B R相关基因的表达量上升,暗示网格蛋白参与调控水稻叶角的形成。（5）水稻花器官和种子表型分析结果表明,与野生型相比,chc1 chc2/+和clc1/+clc2 clc3花粉活力均降低,chc1 chc2/+突变体含有多个柱头,clc1/+clc2 clc3种子变小。这些结果暗示网格蛋白对水稻育性和种子发育具有调控作用。（6）活细胞成像分析表明,与野生型相比,chc1 chc2/+根尖伸长区表皮细胞DR5-GFP荧光强度明显降低,暗示网格蛋白重链调控水稻生长素的合成或运输;chc1 chc2/+根尖表皮细胞CLC1-GFP荧光强度降低,说明水稻网格蛋白重链对CLC的招募是必需的。综上所述,本研究初步获得以下结论:网格蛋白参与调控水稻产量相关的农艺性状（包括叶角、花器官和种子大小等）、叶衰老和生长素合成或运输,最终调控水稻产量。本研究结果为揭示水稻网格蛋白分子作用机理提供了新的见解,对水稻遗传育种具有重要的参考价值。

论文目录

摘要

ABSTRACT

缩略词

第一章文献综述

1 网格蛋白复合体

1.1 网格蛋白结构与功能概述

1.2 网格蛋白重链结构与功能分析

1.2.1 网格蛋白重链结构

1.2.2 网格蛋白重链的生物学功能

1.3 网格蛋白轻链结构与功能分析

2 网格蛋白介导的内吞及其功能

3 CRISPR基因编辑技术、作用原理及在作物中的应用

3.1 CRISPR/Cas系统基本结构及其功能

3.2 CRISPR/Cas系统的类型

3.3 CRISPR/Cas9 系统的作用原理与应用

3.3.1 CRISPR/Cas9 系统的构成

3.3.2 CRISPR/Cas9 系统的作用原理

3.3.3 CRISPR/Cas9 技术在作物中的应用

4 总结与展望

5 本研究的主要研究内容、目的和意义

第二章水稻网格蛋白突变体的制备和鉴定

1 前言

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验试剂与仪器

2.3 实验方法

2.3.1 水稻DNA提取

2.3.2 切胶回收

2.3.3 大肠杆菌JM109 感受态制备

2.3.4 片段纯化

2.3.5 目的片段与pMD19-T Vector载体连接与转化

2.3.6 农杆菌的转化

2.3.7 分子鉴定基本步骤

2.3.8 水稻遗传转化的基本步骤

2.3.9 水稻人工杂交技术

3 结果与分析

3.1 重链或轻链同时敲除载体质谱图

3.2 水稻网格蛋白敲除突变体和Hub过表达载体的遗传转化

3.3 突变体植株基因型的鉴定筛选

3.4 网格蛋白突变体背景下荧光信号分子标记植株的获取

4 讨论

第三章水稻网格蛋白突变体表型观察及功能分析

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验试剂和仪器

2.3 实验方法

2.3.1 主要农艺性状测量

2.3.2 叶片的叶绿素相对含量（SPAD）测定

2.3.3 实时荧光定量Real-Time PCR（qRT-RCR）

2.3.4 叶片叶绿素含量测定

2.3.5 叶片光合速率的测定

2.3.6 黑暗诱导

2.3.7 组织染色

2.3.8 气孔观察

2.3.9 花粉活力检测

3 结果与分析

3.1 水稻网格蛋白轻链调控种子的大小

3.2 水稻网格蛋白突变体影响植株根系的生长发育

3.3 水稻网格蛋白重链敲除突变体的表型及农艺性状分析

3.4 水稻网格蛋白轻链敲除突变体的表型及农艺性状分析

3.5 水稻网格蛋白敲除突变体叶片的叶绿素含量降低

3.6 叶片黑暗诱导

3.7 叶片组织染色

3.8 水稻网格蛋白突变体叶夹角变大

3.9 重链敲除突变体植株的光合效率降低

3.10 重链敲除突变体植株的气孔变化

3.11 网格蛋白突变体花器官和育性分析

4 讨论

第四章水稻网格蛋白重链的生物学作用

1 前言

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验仪器

2.3 实验方法

3 结果与分析

4 讨论

参考文献

附录

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 舒心媛

导师: 潘建伟

关键词: 网格蛋白,水稻,功能分析,内吞

来源: 浙江师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 浙江师范大学

基金: 国家自然科学基金重大研究计划-培育项目(91754104)

分类号: Q943.2

DOI: 10.27464/d.cnki.gzsfu.2019.000146

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CRISPR/Cas9介导的水稻网格蛋白突变体的制备及其功能分析

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