基于split-GFP体内重组高通量筛选系统提高嗜热酯酶的可溶性表达及催化活力

论文摘要

嗜热酯酶是最具有应用潜力的绿色生物催化剂之一,因其具有耐热性、pH稳定性和有机溶剂耐受性等特点广泛应用于各个行业。前期从超嗜热菌Aquiex aeolicus VF5（风产液菌）基因组中筛选得到一种嗜热酯酶基因Aaeo1,实现了其在大肠杆菌系统（Escherichia coli）中的异源表达,发现其存在包涵体及催化活力低的问题。为了得到高效的嗜热酯酶,利用定向进化对其进行分子改造,通过两步高通量筛选法得到可溶性表达和催化活力同时提高的突变株并进行酶学性质研究。具体包括:（1）建立了易错PCR（error-prone PCR,epPCR）突变反应体系。确定最优条件:Mg2+7 mmol·L-1,Mn2+0.2 mmol·L-1,平均突变率为0.31%,满足构建文库要求;（2）建立了灵敏、快速、高效的两步高通量筛选法。以split-GFP为报告基因结合定向进化手段构建突变文库,与以全长增强型GFP（EGFP）为报告基因相比,有效地降低了筛选过程中的荧光背景和假阳性程度,阳性突变率从88%提高至95%。根据荧光强度与酶活力/蛋白浓度之间良好的线性关系,通过流式细胞分选仪从库容量不小于104的突变文库中初筛得到可溶性表达提高的突变株,对初筛目的菌株进行酶活力复筛;（3）筛选获得了可溶性表达和酶活力同时提高的突变株。通过两步高通量筛选得到了2株优势突变菌株EP1和EP2,分别含有4个氨基酸突变位点:I8V/I51V/F127I/E170D、V17G/H22R/K92N/I158K。可溶性蛋白含量是野生型的2倍左右,纯化后的突变酶EP1和EP2的比活力分别是野生型的3.14、3.2倍左右。通过定点突变筛选得到突变株I51V、E170D和I51V/E170D的粗酶活分别是野生型的2.35、2.46、4.5倍。对两个位点分别构建小型饱和突变文库,筛选后进行组合得到突变株I51L/E170D的酶活力是野生型的4.8倍左右。纯化后突变酶I51V、E170D和I51L/E170D的比活力分别是野生型的6.86、10.01、14.86倍;（4）研究突变酶的一系列酶学性质。突变酶均在70oC时测定最大酶活性,突变后仍保持嗜热性,且在高温条件下更稳定。突变酶的最适pH值均为8.0,且在微碱性环境下催化效果更佳。突变酶EP1和EP2的Km值降低,说明突变酶对底物的亲和力增强,kcat/Km值分别是原始酶的2.42、2.35倍,因此催化活性增强。突变酶I51V、E170D和I51L/E170D的Km值提高,kcat/Km值分别是野生型Aaeo1的5.65、4.79、10.7倍,催化效率提高的主要原因可能是由于底物结合口袋的变化导致突变酶的催化能力的提高;（5）通过同源建模分析了Aaeo1突变体酶活提高的机制。蛋白质分子空间结构模拟显示,推测E170D突变改变了Aaeo1的口袋。第170位点与活性位点Asp163的距离约为8.9?,第51位点与Ser62之间仅由一个β-sheet连接,可能会通过长距离或短距离影响酶活力的变化。

论文目录

摘要

Abstract

第一章绪论

1.1 立题背景

1.2 国内外研究进展

1.2.1 嗜热酯酶简介

1.2.2 嗜热酯酶的分子改造

1.2.3 嗜热酯酶的高通量筛选方法

1.2.4 在大肠杆菌中提高蛋白可溶性表达策略

1.2.5 提高嗜热酯酶的催化活力策略

1.3 本论文研究思路和研究内容

1.3.1 研究思路

1.3.2 研究内容

1.3.3 课题来源

第二章实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 基因、菌株和质粒

2.1.2 主要试剂与仪器

2.1.3 培养基及溶液

2.2 实验方法

2.2.1 重组Aaeo1 基因表达菌株的构建

2.2.2 易错PCR条件的优化

2.2.3 重叠延伸、重组Aaeo1 融合表达质粒的构建

2.2.4 Split-GFP共表达质粒的构建

2.2.5 突变文库的构建

2.2.6 可溶性表达提高突变株的高通量初筛及酶活力提高突变株的复筛

2.2.7 重组蛋白的诱导表达及分离纯化

2.2.8 突变酶位点分析

2.2.9 突变嗜热酯酶的酶学性质研究

2.2.10 同源建模

第三章结果与讨论

3.1 嗜热酯酶在大肠杆菌系统中的异源表达

3.2 易错PCR条件的确定

3.3 基于全长EGFP的高通量筛选方法的建立

3.3.1 嗜热酯酶Aaeo1 在大肠杆菌系统中的融合表达

3.3.2 以全长EGFP为报告基因的突变文库的构建

3.3.3 突变文库的高通量筛选

3.4 基于GFP片段自组装的两步高通量新筛选方法的建立

3.4.1 Split-GFP共表达菌株的异源表达

3.4.2 以split-GFP为报告基因的突变文库的构建

3.4.3 可溶性蛋白表达提高突变株的高通量初筛

3.4.4 酶活力提高突变株的复筛

3.5 两种高通量筛选方法的比较

3.6 突变酶位点分析及分离纯化

3.6.1 重组Aaeo1 突变质粒的构建及异源表达

3.6.2 饱和突变文库的筛选

3.6.3 突变酶分离纯化

3.7 突变酶的酶学性质测定

3.7.1 温度对突变嗜热酯酶活性及稳定性的影响

3.7.2 pH对突变嗜热酯酶活性及稳定性的影响

3.7.3 突变酶动力学参数测定

3.8 同源建模

主要结论与展望

主要结论

展望

致谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 莫红梅

导师: 喻晓蔚

关键词: 嗜热酯酶,定向进化,可溶性表达,催化活力

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 江南大学

基金: 国家“863”课题(2012AA022207)

分类号: Q55

总页数: 54

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基于split-GFP体内重组高通量筛选系统提高嗜热酯酶的可溶性表达及催化活力

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