林京玉[1]2003年在《芥子气皮肤损伤小鼠耳廓模型的建立与相关毒理学研究》文中研究表明芥子气是经典的糜烂性毒剂，历次战争证明，芥子气具有强大的杀伤效应，素有“毒剂王”之称。目前芥子气仍然是各国军队装备的毒剂，美、俄有大量储存。迄今为止芥子气尚无特效的抗毒剂，也无特殊的预防和治疗措施，对其损伤则以对症治疗为主。咎其原因，主要是芥子气的作用机理、细胞毒性、致癌性、起疱机制等重要的理论尚未得到攻克和系统阐明，也无法采取具有针对性的防治措施。目前有关芥子气的研究倍受各国的关注，研究集中在动物模型的建立，皮肤起疱机制的研究，细胞毒作用的研究，抗毒药物的筛选，毒代动力学特点等方面。其中起疱机制方面的研究是一个热点。我们通过本实验，了解芥子气皮肤毒理的特点，探索芥子气皮肤起疱的可能机制，以期能够为进一步研究和筛选抗毒药物奠定理论基础。 1．芥子气致小鼠耳廓皮肤损伤模型的建立 3种不同浓度(16mg／mL、32mg／mL、64mg／mL)芥子气各5μL染毒于小鼠耳廓内侧皮肤，并于染毒后6、12、16、20、24、30、48、72、96h通过耳廓称重观察耳廓皮肤水肿情况，结果显示芥子气所致皮肤水肿，具有剂量、时间效应，随染毒剂量增大和染毒时间延长，可加重皮肤水肿程度。其中前24h为急性发展期。以32mg／mL芥子气5μL染毒后3、6、12、16、20、24、30、48、72、96h，通过光镜观察小鼠耳廓皮肤病理改变。芥子气引起的皮肤病理变化很多，在损伤不同时期可见组织水肿、炎症细胞浸润、微疱、表皮细胞坏死、血管扩张充血，出血、表皮细胞角化不全等病理变化。其中着重观察了炎症、微疱、坏死3个指中大筑冬标的变化情况。随染毒时间的延长，3种病理变化的程度越来越严重，染毒早期为急性发展期。炎症发生最早，坏死发生最晚。透射电镜下可见皮肤较深部的水疙，表皮真皮连接处结构紊乱。因此，小鼠耳廓皮肤以32mg/mL芥子气5，L染毒后，可构建出小鼠耳廓皮肤起疙模型，该模型适合于芥子气皮肤起疙机制及抗毒药物筛选等研究。 2.药物对芥子气所致小鼠耳廓皮肤损伤的治疗效果 芥子气染毒后10min分别单次给予5%聚维酮碘水溶液、美宝膏、恩肤霜，通过耳廓称重和病理改变程度观察了12、16、20、24、48、72h的治疗效果，结果显示，在24h内美宝膏轻度减轻耳廓水肿情况，明显减轻表皮细胞坏死和微疙的发生;聚维酮碘对耳廓和病理变化没有改善作用;恩肤霜在24h内有所缓解皮肤炎症，而对其他病理变化无改善作用。表明美宝膏在单次给药后24h内明显改善芥子气引起的病理变化。 3.芥子气致小鼠耳廓皮肤起疙机制初探 本实验于32mg/mL芥子气5 pL皮肤染毒后12、24、48h，利用间接免疫荧光法标记了与皮肤起疤相关的基底细胞表面受体pl整合素、p4整合素，基底膜蛋白成分层粘连蛋白、IV型胶原，以激光共聚焦显微镜来观察荧光强度以及荧光分布特征。实验结果显示在染毒后48h p4整合素荧光强度显着下降并荧光分布不均，染毒后24h层粘连蛋白的荧光强度显着下降并荧光分布不均，pl整合素以及IV型胶原无明显改变。结果提示芥子气染毒后可降低旦4整合素以及层粘连蛋白水平，致使表皮真皮连接结构稳定性受到破坏，促进水疙发生。
闫慧敏[2]2004年在《芥子气染毒小鼠皮肤基底细胞的增殖动力学行为研究》文中研究表明芥子气是一种糜烂性毒剂，杀伤威力强大，素有“毒剂之王”之称。目前，芥子气仍是外军装备的主要毒剂之一，其具有穿透性强、作用持久、防治困难等特点，既可发挥强大的杀伤效能，又可发挥战时防御效果，受到各国军方的普遍关注。 皮肤是芥子气的主要中毒途径，也是其发挥毒性的重要效应器官之一。芥子气染毒后主要造成皮肤的红斑、水肿、起疱、糜烂、坏死等病理变化。迄今为止，尚无芥子气特效抗毒药物，仅采取对症、抗炎等支持疗法，效果并不十分理想。这除了与芥子气自身的毒理学作用特点如多水平、多靶点的特性有关外，还在于对芥子气引起皮肤损伤的分子机制尚不完全了解。但众所周知，芥子气所引起的皮肤损伤的修复和重建归根结底是通过表皮基底细胞的增殖分化来实现的。那么，在小鼠皮肤芥子气染毒之后，对表皮基底细胞特别是表皮干细胞的增殖动力学行为的影响如何，目前尚未见报道。为此，我们开展了本项研究，以期了解芥子气损伤皮肤基底细胞增殖动力学的变化特点，并为从改善干细胞微环境、促进干细胞的增殖分化角度，探索促进芥子气损伤皮肤愈合的新途径以及干细胞移植疗法的建立奠定了基础，具体工作如下： 1．芥子气对小鼠皮肤基底细胞增殖动力学的影响 摘要 本研究采用胰蛋白酶消化法急性分离小鼠耳廓表皮细胞，通过免疫组化及流式细胞术等方法检测证实分离得到的细胞主要是pl整合素阳性细胞，即表皮基底细胞。 采用Pl染色流式细胞术观察了芥子气染毒后小鼠表皮基底细胞增殖周期的时效及量效关系。当染毒浓度为犯mg/mL芥子气时，48h之前细胞周期未发生明显的改变，而染毒后48h出现S及GZ/M期细胞增多的现象;当染毒剂量增至160m留mL及32omg/mL时，在染毒后72h均出现明显的亚二倍体峰即凋亡峰，并呈现出一定的量效、时效关系。 采用Pl并Hoeehst33342双染，激光扫描共聚焦显微镜(Confocal laser seanningmicrosc叩y，CLSM)观察小鼠表皮基底细胞核形态的变化。cLsM显示320m岁mL芥子气染毒后72h，基底细胞核染色质呈高凝集的点状结构并有核碎裂的发生。透射电镜(Transmission eleetron microseope， TEM)观察了不同剂量组(32mg/mL、160mg/mL、咒omg/mL)芥子气染毒后基底细胞的超微结构改变。32mg/mL芥子气染毒后24h可见有典型的凋亡细胞，即出现染色质边集呈新月状，核碎裂等特征性改变;16omg/mL芥子气染毒后24h镜下可见表皮及真皮均有少量凋亡细胞存在。160m留mL及犯Om留mL芥子气染毒72h后可见表皮细胞坏死发生。可见，芥子气染毒后表皮基底细胞的增殖动力学行为发生了改变，可引起表皮基底细胞凋亡，促进细胞的终末分化。结果提示，促进基底细胞的增殖有可能对芥子气皮肤损伤的治疗起着积极的作用。 2.芥子气对小鼠表皮干细胞的影响 本研究利用表皮干细胞具有慢周期性的特点，采取5一澳脱氧尿嚓咤核营(5一bromedcoxytlndine，BrdU)标记滞留术进行表皮干细胞的分离鉴定。技术路线为:10日龄的新生乳鼠耳廓局部透皮给予Brdu(1 omg/mL X 20 p L X3次/d X Zd)，急性分离细胞，经55%乙醇固定、胃蛋白酶消化核提取法变性之后抗体孵育，流式检测。结果显示，小鼠耳廓透皮给予BrdU30天时，实验组阳性细胞率约为6%，可初步认定为表皮干细胞。而小鼠耳廓单次给予spL芥子气(160m留mL)染毒后24h及48h表皮干细胞的数目明显减少。提示通过药物诱导间充质干细胞分化为表皮干细胞从而促进皮肤损伤的愈合可能是值得探索的一个方向。 3.小鼠表皮基底细胞培养条件的初步探索中国人民解方欠月民军事医学科学卫完不页士学位论文2004 摘要 本研究主要采用以下叁种方法:组织块培养法、有血清培养法(无滋养层)、有血清培养法(有滋养层)。a.组织块培养法在接种后2天可见表皮基底细胞呈膜状移行生长，细胞呈扁平不规则多角形，彼此紧密相连成单层膜。7天表皮细胞成片生长呈典型的“铺路石”状，并在生长过程中形成特异性的“拉网”现象。b.采用有血清培养液，单纯多聚赖氨酸铺被培养皿，以胰蛋白酶消化法获得的小鼠耳廓表皮基底细胞培养7天后细胞逐渐形成小的克隆。。.有滋养层培养法首先要制备滋养层，具体方式为利用组织块培养法培养的成纤维细胞在半融合状态时经过30Gy(2.5m)60co照射后，换新鲜培养基培养48h后备用。“0C。照射后滋养细胞便失去分裂能力，但仍然生存并有同化营养液的能力，当分离的细胞散落在饲细胞上与之接触后，能促进克隆细胞的生长。但相关实验条件还有待于进一步完善。
安文华, 钟玉绪, 应翔宇, 时辉宁, 应莺[3]2006年在《芥子气诱导小鼠耳廓皮肤差异蛋白的鉴定》文中认为目的通过芥子气染毒后小鼠耳廓皮肤蛋白质组的改变,探索芥子气皮肤损伤的分子机制。方法5μL(160g·L-1)芥子气经小鼠耳廓内侧皮肤染毒,于染毒后6和24h制备蛋白样品,采用双向电泳技术分离蛋白样品,ImageMaster5.01软件处理双向电泳图谱,基质辅助激光解吸附飞行时间质谱分析差异蛋白点的肽质量指纹谱。结果正常对照组、染毒后6和24h组分别检测到1442,1451和1158个蛋白质点,各组蛋白质的匹配百分比为64.5%~82.0%。共鉴定了15个差异蛋白,主要与过氧化应激、细胞凋亡及能量代谢等相关。染毒后的表达上升的蛋白有载脂蛋白A-I和前白蛋白;表达下降的蛋白有过氧化物氧还酶6、超氧化物歧化酶、羰基还原酶3、肌动蛋白、谷胱甘肽S-转移酶Mu2和Δ3,5,Δ2,4-二烯酰辅酶A异构酶;6h时表达上升,24h时下降的蛋白有丙糖磷酸异构酶、脂肪酸结合蛋白、微丝结合蛋白-1、肌动蛋白解聚因子和蛋白突触结合蛋白样蛋白-3的剪接同工型4。6h表达下降,24h表达上升的蛋白是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂B。钙粒蛋白B仅出现于染毒后6h组,对照组与染毒后24h组没有出现。结论芥子气染毒能诱导小鼠皮肤蛋白表达谱的改变。
参考文献：
[1]. 芥子气皮肤损伤小鼠耳廓模型的建立与相关毒理学研究[D]. 林京玉. 中国人民解放军军事医学科学院. 2003
[2]. 芥子气染毒小鼠皮肤基底细胞的增殖动力学行为研究[D]. 闫慧敏. 中国人民解放军军事医学科学院. 2004
[3]. 芥子气诱导小鼠耳廓皮肤差异蛋白的鉴定[J]. 安文华, 钟玉绪, 应翔宇, 时辉宁, 应莺. 中国药理学与毒理学杂志. 2006