杨银凤[1]2004年在《骆驼β-防御素-1（caBD-1）的分子克隆和组织表达》文中研究指明内源性抗微生物肽是生物体内先天性免疫的重要组成成分，防御素(defensins)是广泛分布于动物和植物界的一类富含半胱氨酸的阳离子内源性抗微生物肽，是内源性抗微生物肽中的一个大家族。根据防御素分子内半胱氨酸的位置和连接方式、前体性质及表达位置的差异可分为α-防御素、β-防御素、θ-防御素、昆虫防御素和植物防御素五种类型。β-防御素主要分布于哺乳动物的黏膜上皮细胞内，所以，β-防御素被确认为黏膜表面抗微生物屏障的组成成分。已有研究报道在哺乳动物—牛、羊、猪、鼠、猴体内有β-防御素的表达。本研究中我们在骆驼体内又发现了一种新的β-防御素，命名为骆驼β-防御素-1(camelβ-defensin-1，caBD-1)。从骆驼舌黏膜上皮组织中提取总RNA，根据反刍动物—牛和羊β-防御素cDNA的保守序列设计了一对引物，采用RT-PCR技术扩增出caBD-1的cDNA,并重组到pBlueselect T载体，经限制性内切酶图谱分析后进行DNA序列测定, 测序结果证实所克隆的caBD-1的cDNA为β-防御素，因为该cDNA包含一个由192个碱基组成的开放读码框（Open Reading Frame，ORF），该ORF编码64个氨基酸残基的前原防御素肽，该前原防御素肽含有β-防御素的特征性结构，即6个在特定位置上的保守半胱氨酸残基。获得全长cDNA序列是研究基因结构、基因表达和基因功能的重要前提。我们根据已获得的骆驼β-防御素caBD-1 cDNA的已知序列设计了一条序列特异性引物作为上游引物，反转录引物中的部分序列即3ˊ接合器引物作为下游引物，成功地克隆了骆驼β-防御素caBD-1 cDNA的3ˊ末端序列。另外，采用反向嵌套 PCR 5ˊRACE法，根据caBD-1 cDNA 的已知序列，设计了一条5ˊ末端磷酸化的特异性反转录引物和两对特异性反向嵌套PCR 引物，首先进行反转录（Reverse Transcription，RT）, 然后将mRNA反转录成的cDNA进行环化，最后进行反向嵌套巢式PCR，成功地克隆了骆驼β-防御素caBD-1 cDNA的5ˊ末端序列。与锚定PCR法相比，反向嵌套PCR法具有特异性强、扩增效率高等优点，是一种有效扩增cDNA 5ˊ末端序列的方法。caBD-1 cDNA 序列全长322bp，其中192bp组成的ORF编码64个氨基酸残基的前原caBD-1肽，通过计算机软件预测该前原肽包含20个氨基酸残基的信号肽、6个氨基酸残基的前片段和38个氨基酸残基的成熟肽。在预测的38个氨基酸残基的成熟肽中有6个在特定位置上的不变的半胱氨酸残基，9个带正电荷的氨基酸残基（2个精氨酸Arginine－R，7个赖氨酸Lysine－K），没有带负电荷的氨基酸残基，因此caBD-1是一个阳离子肽。其分子量为4007.94Da , 等电点pI为9.71。通过计算机软件将caBD-1和其他哺乳动物、人及禽类的β-防御素进行cDNA碱基序列和前原肽氨基酸序列的同源性比较分析，结果显示：caBD-1与猪的β-防御素pBD-1
唐博[2]2004年在《骆驼β-防御素caBD-1 cDNA的克隆及序列分析》文中研究指明抗菌肽是生物天然免疫系统中的重要组成部分，具有杀灭病菌、保护机体的作用。防御素是其中一大家族，广泛分布于动物、植物体内，具有高效、广谱抗微生物活性。防御素具有不同于抗生素的独特的抗菌机制，这种抗菌机制不会使病菌变异。据分子结构特征和来源不同，防御素又分为α-防御素、β-防御素、θ-防御素、昆虫防御素和植物防御素。我们利用其他反刍动物（牛和羊）cDNA的保守序列设计引物,从骆驼舌黏膜上皮组织中提取总RNA，采用RT-PCR技术扩增出caBD-1(camelβ-defensin-1)的cDNA,并重组到pBlueselect T载体，经限制性内切酶谱分析和DNA序列测定,证实所克隆的caBD-1的cDNA为β-防御素。因为该cDNA包含由192个碱基组成的开放读码框（ORF），该ORF编码64个氨基酸残基的前原防御素，该前原防御素含有β-防御素特征性结构即六个保守的半胱氨酸残基。cDNA末端快速扩增 (Rapid Amplification of cDNA Ends)技术简称RACE技术。我们采用锚式PCR RACE技术和反向嵌套 PCR RACE技术分别扩增出caBD-1的3ˊ末端和5ˊ末端，经克隆和测序得到caBD-1的cDNA全长序列。
参考文献：
[1]. 骆驼β-防御素-1（caBD-1）的分子克隆和组织表达[D]. 杨银凤. 西北农林科技大学. 2004
[2]. 骆驼β-防御素caBD-1 cDNA的克隆及序列分析[D]. 唐博. 内蒙古农业大学. 2004