导读:本文包含了终止密码子论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:密码子,纤毛虫,日本,因子,嵌合体,磷酸化,无义。
终止密码子论文文献综述
王软林,梁爱华[1]（2017）在《终止密码子使用的模糊性及复杂性研究》一文中研究指出遗传密码是一套将核酸叁联体密码与氨基酸一一对应的准则,它决定了mRNA所编码的氨基酸序列。自1966年遗传密码表建立以来,普遍认为核基因的遗传密码是不变的,所有生物共用一套密码子,密码子的通用性也是现代分子生物学的理论基础。然而在某些生物中存在遗传密码重新分配的现象。遗传密码的重新分配现象主要集中在线粒体基因组中,核基因组中的报道较少。核基因(本文来源于《2017第七届泛环渤海生物化学与分子生物学会学术交流会论文集》期刊2017-08-21）
闫静[2]（2017）在《eRF1的C端结构域在终止密码子识别过程中的功能》一文中研究指出在真核生物蛋白质翻译终止过程中,当叁个终止密码子UAA、UAG和UGA中的一个到达核糖体A位点时,被第一类肽链释放因子eRF1识别,翻译过程终止,在第二类肽链释放因子eRF3的协同下完成新生肽链释放。在翻译终止过程中,第一类肽链释放因子eRF1利用其N端结构域识别终止密码子。eRF1的N结构域中的GTS、NIKS和Y×C×××F模体对于终止密码子的识别发挥重要作用。但至目前为止,eRF1识别终止密码子的机制,尤其是对于终止密码子的选择性识别机制仍不清楚。在本实验中,我们首先构建了四膜虫(Tetrahymena thermophilia)eRF1的N结构域与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)eRF1的M和C结构域组成的杂合eRF1(Tt/Sc eRF1,Tt/Sp eRF1)。利用双荧光素酶报告体系检测结果证实,两种杂合的eRF1在细胞中识别终止密码子的活性具有显着差异。Tt/Sc eRF1识别终止密码子UGA,而不识别UAA和UAG终止密码子,与四膜虫eRF1一致,表现出了密码子识别特异性(对UGA、UAG、UAA的通读效率分别是1.98%、3.83%、11.04%);而Tt/Sp eRF1可以识别叁个终止密码子,无密码子识别特异性(对UGA、UAG、UAA的通读效率分别是2.81%、2.01%、1.88%)。由此说明四膜虫eRF1的N结构域不是决定其识别特异性的唯一因子,在eRF1的M和C结构域中可能存在决定eRF1识别性质的元件或细胞中其它因子可能通过M和C结构域参与eRF1识别终止密码子的过程。为解释这一现象,我们将Sp eRF1的C端小结构域中氨基酸进行突变,选择了其中的第357、361、364和367位的氨基酸突变为酿酒酵母eRF1相应的位点,得到一系列的突变体(Tt/Sp eRF1 A364Q、Tt/Sp eRF1 D361A/A364Q、Tt/Sp eRF1 L357A/D361A/A364Q、Tt/Sp eRF1L357A/D361A/A364Q/E367D)。同样也将裂殖酵母eRF1的364、367和371位氨基酸引入酿酒酵母eRF1,得到突变体Tt/Sc eRF1 Q364A、Tt/Sc eRF1 Q364A/D367E、Tt/Sc eRF1 Q364A/D367E/E371S。结果显示,所有的突变体对UGA的识别效率没有明显的变化,但是Tt/Sp eRF1的突变体对UAG和UAA的通读效率显着提高,说明其对这两个密码子的识别效率降低。而Tt/Sc eRF1的突变体,对终止密码子识别活性的影响不显着,其对UAG的识别活性稍有提高,通读效率从5.77%降至2.98%,以上结果表明C端小结构域影响到eRF1对UAG和UAA密码子的识别活性。为了进一步分析小结构域对识别活性的影响,通过对小结构域的蛋白结构分析发现在其结构域中存在关键的、多变的Loop(357~367aa)结构,因此我们将裂殖酵母和四膜虫eRF1小结构域中的Loop结构引入到杂合的Tt/Sc eRF1中。分析结果显示,引入两种不同Loop结构到Tt/Sc eRF1嵌合体中,均可识别叁个终止密码子,说明Loop结构显着的影响终止密码子的识别活性。由此表明,四膜虫eRF1的N端结构域识别终止密码子的活性受到C端结构域的影响,也说明eRF1的C端结构域参与了终止密码子的识别过程。从以上实验结果我们推测,是否酿酒酵母第二类肽链释放因子与两种酵母的嵌合体eRF1相互作用的效率不同,导致两个嵌合体识别终止密码子的效率和功能发生了改变呢?因此,在本实验中,我们将克隆得到的四膜虫eRF1嵌合体和裂殖酵母Sp eRF1以及酿酒酵母两类肽链释放因子Sc eRF1和Sc eRF3的基因,分别连接到酵母表达载体pGADT7和pGBKT7中,得到的重组质粒共转化到酵母菌株AH109。酵母双杂交结果证实四膜虫eRF1嵌合体(Tt/Sc eRF1/Tt/Sp eRF1)、功能Sp eRF1、Sc eRF1和Sc eRF3均存在相互作用关系,说明无论在何种细胞中,蛋白质翻译终止过程都需要两类肽链释放因子的协同作用来完成。排除了酿酒酵母细胞中嵌合体eRF1识别终止密码子的性质和活性的差异是由于Sc eRF3与嵌合体eRF1相互作用的效率不同而引起的。为了进一步验证N端结构域识别终止密码子的活性受到C端结构域的影响,我们通过双荧光分子互补实验(Bi FC)证实eRF1功能的主要调控因素是其N端结构域与C端结构域在分子内发生的相互作用引起的。通过克隆得到四膜虫eRF1的N结构域,C结构域、酿酒酵母eRF1的C结构域和裂殖酵母eRF1的C结构域及其突变体(Sp-C A364Q、Sp-C D364A/A364Q、Sp-C L357A/D364A/A364Q)的基因,分别连接到表达载体pQE-30和pET-28a中。结果表明四膜虫eRF1的N结构域与不同的C结构域以及突变体在体内都可发生相互作用,说明C端结构域通过与N端结构域的分子内相互作用,影响终止密码子的识别活性;也进一步证实了C端结构域参与了密码子的识别过程。综合以上结果表明,四膜虫eRF1的N端结构域不是其识别终止密码子的唯一因子,C端结构域在一定程度上影响并决定了eRF1对终止密码子是别的特异性。本研究结果,旨在为揭示肽链释放因子识别终止密码子的分子机制提供数据支持。(本文来源于《山西大学》期刊2017-06-01）
陈刚[3]（2017）在《栽培一粒小麦C末端区域带有提前终止密码子的高分子量谷蛋白亚基1Ay的表达鉴定》一文中研究指出小麦属及其近缘物种中蕴藏着丰富且可利用的优良基因,这些基因不仅可以改进小麦遗传基础还能在提高小麦品质中发挥重要作用。栽培一粒小麦(Triticum monococcum L.ssp.monococcum,AmAm,2n = 2x = 14)是普通小麦的二级基因源,是小麦的重要基础物种。高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)是小麦重要的储藏蛋白,其组成和数量在小麦加工品质中起着重要的作用。然而1Ay亚基在普通小麦中通常是沉默的,但是在四倍体小麦和二倍体小麦中通常是表达的。提前终止密码子在沉默的1Ay亚基中扮演着重要的角色。本研究通过SDS-PAGE分析、目的基因克隆、3'-RACE、原核表达、MALDI-TOF质谱分析、原生质体瞬时表达等方法对栽培一粒小麦10-1可表达的1Ay8.3亚基的表达进行了研究,主要结果如下:1.SDS-PAGE分析结果表明,栽培一粒小麦10-1的y-型高分子量谷蛋白亚基的电泳迁移率介于普通小麦地方品种“中国春”的1Bx7和1By8之间,依据电泳迁移率的大小将该亚基命名1Ay8.3。2.栽培一粒小麦10-1的y-型高分子量谷蛋白亚基1Ay8.3的编码基因(GenBank No.KU207221)与之前报道的有活性的1Ay亚基不同,该亚基在其氨基酸序列627aa位置处有一个提前终止密码子TAG,并且位于少见报道的C末端区域。对1Ay8.3基因相应cDNA克隆发现,提前终止密码子也出现在相同位置。转录水平分析表明,提前终止密码子的位置与在1Ay8.3基因的DNA及相应cDNA中的位置完全相同。并且未发现在该位置处有其他未知氨基酸替代的转录本,证明1Ay8.3基因在种子胚乳中正常转录。3.根据1Ay8.3基因的提前终止密码子在编码序列的位置设计了 2对表达引物对其基因进行体外表达。SDS-PAGE分析表明,1Ay8.3基因体外表达所得产物快于栽培一粒小麦10-1种子蛋白的1Ay8.3亚基迁移率,但与只到提前终止密码子结束的1Ay8.3基因部分序列的表达产物在迁移率上保持一致。进一步,通过定点突变将位于1Ay8.3基因序列的提前终止密码子TAG突变成CAG进行体外表达,1Ay8.3基因突变体的表达产物与种子中的1Ay8.3亚基迁移率基本一致,但稍慢于含有提前终止密码子的1Ay8.3基因全序列表达产物的迁移率。4.对10-1种子蛋白1Ay8.3亚基,1Ay8.3基因体外表达产物以及1Ay8.3基因突变体的表达产物分别进行质谱鉴定,检测出的部分肽段为Glu-Aly蛋白特异的。质谱鉴定结果表明,种子中1Ay8.3亚基和1Ay8.3基因序列及其突变体的体外表达产物均被鉴定为1Ay蛋白。MALDI-TOF/MS分析结果也表明,种子蛋白1Ay8.3亚基的分子量与1Ay8.3基因突变体的体外表达蛋白分子量相近,约为70kDa,但均高于1Ay8.3基因体外表达蛋白的分子量(约为68kDa)。证明带有提前终止密码子的1Ay8.3基因体外表达一个截断的Glu-Aly蛋白。5.为了研究1Ay8.3基因体内表达情况,将已克隆的1Ay8.3基因序列去除最后两个连续的终止密码子(TGATAG),连入一个绿色荧光蛋白(YFP)与1Ay8.3构建成融合序列(1Ay649-YFP)并转入10-1叶片原生质体细胞进行表达。原生质体瞬时表达结果显示,通过镜检观察叶片原生质体细胞可观察到绿色荧光信号,1Ay8.3融合蛋白(1Ay649-YFP)在10-1体内成功表达。结果表明,栽培一粒小麦10-1体内可能存在一种能在翻译过程中抑制终止密码子终止效应的现象。(本文来源于《四川农业大学》期刊2017-05-01）
高宁[4]（2016）在《ArfA、RF2介导的终止密码子缺失的mRNA翻译终止机制》一文中研究指出核糖体上的蛋白翻译是一个非常复杂的过程,包括翻译起始、延伸和终止等多步严密调控的步骤。在细菌中,当蛋白翻译进行到mRNA上的终止密码子(stopcodon)时,翻译终止因子RF1或RF2可以直接识别终止密码子,结合到核糖体上的活性中心,催化释放共价偶联在肽酰tRNA3’末端上的新生肽链。在细胞中,转录提前终止、mRNA错误加工、药物或者物(本文来源于《中国晶体学会第六届学术年会暨会员代表大会（电子晶体学分会）论文摘要集》期刊2016-12-19）
黄红英[5]（2016）在《纤毛虫肽链释放因子识别终止密码子特异性的功能位点分析》一文中研究指出当叁个终止密码子UAA、UAG和UGA中的任何一个进入核糖体的A位点时,蛋白质翻译终止发生。在使用标准遗传密码子的生物中,真核生物第一类肽链释放因子(eukaryotic polypeptide release factor,eRF1)可以完全识别叁个终止密码子,但是密码子变异的物种或细胞器中终止密码子发生了重新分配。纤毛虫eRF1只能识别UAA、UAG和UGA中的一个或两个。在高等真核细胞中,eRF1的N端结构域(domain 1)已被证明在蛋白质合成的终止过程中负责识别mRNA上的终止密码子,其中3个高度保守的模体结构域GT区,TASNIKS区和YCF区,对eRF1识别终止密码子的活性有较大影响。但具体哪些氨基酸或者模体负责叁个终止密码子的识别仍然没有一致的结论。关于第一类肽链释放因子的识别机制目前尽管建立了几种模型,但几种模型之间仍然有诸多矛盾,各种模型也不够完善,还需要更为确定的数据来证实哪些序列参与终止密码子的识别以及识别的方式。为了鉴定第一类肽链释放因子中识别终止密码子的关键的氨基酸位点,我们选用通用密码子物种(standard code species)的eRF1,如酵母(Saccharomyces cerevisae)和肠肾虫(Nycototherus ovalis)的eRF1,以及变异密码子物种(variant code species)的eRF1,如八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)和四膜虫(Tetrahymena thermophilia)作为研究材料。其中八肋游仆虫将UGA编码为半胱氨酸,而四膜虫只将UGA作为终止密码子。我们设计了两种实验方案。第一是将纤毛虫八肋游仆虫eRF1的N端结构域中的关键的氨基酸位点逐一突变为肠肾虫、四膜虫和酵母eRF1的对应位点的氨基酸。第二个方案是将酵母的eRF1的N端结构域的关键的氨基酸位点分别突变为肠肾虫、四膜虫和游仆虫eRF1对应位点的氨基酸。分析这些氨基酸位点的改变对eRF1性质和功能的影响。研究的氨基酸位点有第57位、60位、61位、70位和126位(以人氨基酸序列计数)。研究方法主要是5氟乳清酸平板法和双荧光素酶(萤火虫和海肾荧光素酶基因)报告系统。前者用以分析突变体eRF1支持细胞生存的活性,后者分析突变体eRF1对于叁个终止密码子的通读效率。使用酵母菌株YDB447(eRF1基因敲除型)为工具菌。研究结果显示,这些突变体eRF1的识别活性发生了显着变化。当游仆虫eRF1(Eo/Sc eRF1)中引入A70S时,不能支持酵母细胞的生长,对UGA的通读效率达到了23.4%,是野生型的两倍左右,当继续引入I126L、E60S与S61N之后,得到的组合突变体Eo/Sc eRF1(E60S/S61N/A70S/I126L)(对应于酵母氨基酸位点)可以支持酵母的生长,和野生型的生长情况相当,并且Eo/Sc eRF1可以识别叁个终止密码子UAA、UAG和UGA,通读效率分别为0.16%、0.16%、0.05%。结果表明,就细胞的生长而言,eRF1上两个模体TASNIKS(第55-61氨基酸)与Y×C××F(第122-128位氨基酸)对终止密码子的识别是起协同作用的。向Eo/Sc eRF1中引入A70S和I126F(类似于四膜虫eRF1氨基酸)后,突变体识别UGA的活性明显降低,通读效率达到35.8%。当酵母eRF1(Sc eRF1)中引入G57S和L126F(类似于四膜虫氨基酸位点)后,得到的eRF1突变体对UAA,UAG和UGA的通读效率都有所提高,分别达到0.99%,0.83%和3.22%,是野生型Sc eRF1的4-8倍:当引入S70A与L126I后(类似于游仆虫氨基酸位点),Sc eRF1突变体对UGA表现出了15.96%的通读效率,是野生型的35倍,对UAA和UAG的通读却没有表现出明显的变化,产生了类似于游仆虫的密码子识别模式,进一步说明S70A/L126I在决定肽链释放因子识别活性中的关键作用。由此可见,eRF1的N端结构域中的关键的氨基酸位点对于eRF1的性质和功能具有决定性的作用,尤其是第70位和第126位的氨基酸。在NIKS模体中的氨基酸位点对eRF1的功能也具有一定的影响。该结果支持了cavity模型,为进一步研究肽链释放因子识别终止密码子的机制提供大量数据。其次,本研究进一步分析了蛋白质的翻译后修饰对第一类肽链释放因子功能的影响。利用赭纤虫(Blepharisma japonicum)eRF1(Bj-eRF1)为材料,预测发现,赭纤虫eRF1和酵母eRF1的N端的一些与密码子识别有关的氨基酸被磷酸化修饰的几率很高,且二者磷酸化修饰的氨基酸位点有所差异。用基因突变方法向Bj-eRF1中引入磷酸化激酶识别位点,或者删除其自身可能的怜酸化激酶识别位点,分析了磷酸化修饰对BJ-eRF1识别密码子特异性的影响。当向赭纤虫eRF1的N端引入与酵母eRF1一致的磷酸化位点时(N23S/D25E/A70S/Q115E),其识别终止密码子的特异性发生了显着的改变,对UGA识别的通读效率显着降低,对UGA、UAG、UAA通读效率分别为5.71%、1.59%和0.20%,由UAA/UAG识别特异性转变为UAA/UAG/UGA叁个密码子全识别。说明这些位点磷酸化可能参与调节eRF1识别终止密码子的过程。(本文来源于《山西大学》期刊2016-06-01）
黄红英,郭萍,柴宝峰[6]（2016）在《赭纤虫eRF1识别终止密码子特异性功能位点分析》一文中研究指出蛋白质翻译终止过程中第一类肽链释放因子(eukaryotic polypeptide release factor,eRF1)识别终止密码子,水解肽酰-tRNA酯键,释放新生肽链,但eRF1识别终止密码子的机制尚不清楚。纤毛虫eRF1识别密码子的特异性为研究该机制提供了理想的材料。分析了赭纤虫(Blepharisma japonicum)eRF1的N端结构域中与密码子识别有关的关键的氨基酸。预测发现赭纤虫和酵母eRF1的一些与密码子识别有关的氨基酸被磷酸化修饰的几率很高,且二者磷酸化修饰的氨基酸位点有所差异。利用点突变方法向赭纤虫eRF1的N端引入与酵母eRF1一致的磷酸化位点时(N23S/D25E/A70S/Q115E),其识别终止密码子的特异性发生改变,由UAA/UAG识别特异性转变为UAA/UAG/UGA叁个密码子全识别。说明这些位点磷酸化可能参与调节eRF1识别终止密码子的功能。(本文来源于《山西大学学报(自然科学版)》期刊2016年02期）
闫静,柴宝峰[7]（2015）在《四膜虫eRF1识别终止密码子功能特异性的分析》一文中研究指出在蛋白质生物合成的终止过程中,第一类肽链释放因子识别终止密码子UAA,UAG和UGA,导致肽酰-t RNA酯键的水解,进而介导新生肽链的释放。在高等真核生物中,e RF1能够识别叁个终止密码子,而在纤毛虫中却发生终止密码子重排现象,一个或两个终止密码子编码成为有义密码子,如四膜虫(Tetrahymena thermophilia)中,UAA和UAG编码成为谷氨酰胺;游仆虫(Euplotes octocarinatus)中,UGA编码成为半胱氨酸等。真核生物e RF1的N端结构域决定e RF1终止密码子(本文来源于《第五届泛环渤海生物化学与分子生物学会学术交流会论文集》期刊2015-08-19）
于竞飞[8]（2015）在《纤毛虫eRFl终止密码子识别特异性的功能结构域分析》一文中研究指出当mRNA上的终止密码子UAA,UAG或者UGA到达核糖体的A位点时,被肽链释放因子识别,蛋白质翻译终止。真核生物中,有两类肽链释放因子参与翻译终止过程,分别为eRF1和eRF3,但具体的机制尚不完全确定。大多数高等真核生物eRF1能识别叁个终止密码子,而纤毛虫eRF1却只能识别叁个终止密码子中的一个或两个,称为密码子识别特异性eRF1。研究显示第一类肽链释放因子的N结构域负责终止密码子的识别,其包含3个高度保守的模体结构域：GT区,TASNIKS区和YCF区,对eRF1识别终止密码子的活性有较大影响。纤毛虫eRF1识别终止密码子的特异性是否受到N端叁个保守模体或其中关键氨基酸的调控,以及叁个模体结构之间的关系是值得探讨的问题,结果有助于进一步阐明肽链释放因子识别终止密码子的分子机制。本实验首先构建了嗜热四膜虫(Tetrahymena) eRFlN端结构域与酵母的M、C端结构域组成的嵌合体eRFl(Tt/Sc eRFl)。利用双荧光素酶报告体系,在eRF1基因敲除的酵母细胞株中测定嵌合体Tt/Sc eRFl识别终止密码子的性质和活性,结果显示,Tt/Sc eRFl对终止密码的识别具有一定的特异性,即对UAA和UAG的通读效率明显高于UGA,与四膜虫eRF1的性质一致(对UGA、UAG、UAA的通读效率分别为2.49%、4.07%、10.12%)。为了分析eRF1中影响终止密码子识别性质的关键模体和氨基酸,我们通过定点突变的方法将嵌合体Tt/Sc eRFl的N结构域中保守模体的一些关键氨基酸,突变为酵母eRF1相应的氨基酸。结果显示,TASNIKS模体内的突变K57T/T59S/D63S使嵌合体eRF1对UGA.UAG通读效率比野生型分别提高了13.45%、1.84%,对UAA的通读效率降低了3.48%；YCF模体内的突变F125L/S128N使嵌合体eRF1对UGA的通读效率提高了3.04%,对UAG、UAA通读的效率分别降低了1.89%、6.72%,说明关键模体内氨基酸的改变对四膜虫eRF1识别终止密码子的性质产生了不同程度的影响,说明这些氨基酸可能通过影响模体的结构改变了eRF1对密码子的识别活性。为了分析保守的模体结构或模体间的协同作用对eRF1性质的决定作用。我们进一步利用搭桥PCR的方法将原生动物蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lambiia)和嗜热四膜虫eRF1中保守模体及其相邻区域的氨基酸分别引入酵母eRF1中,构建成由不同模体组合而成的杂合N端嵌合体,以此探究eRF1的N端区域中关键模体对eRF1识别终止密码子特异性的影响。构建的贾第虫与酵母eRF1杂合的N端嵌合体为G1(1-84aa)/Sc(76-149aa)-N 和 Sc(1-75aa)/G1(85-157aa)-N;四膜虫与酵母eRF1的N端嵌合体为Tt(1-77aa)/Sc(76-149aa)-N、Sc(1-75aa)/Tt(78-151aa)-N； Sc(1-38aa)/Tt(41-77aa)/Sc(76-149aa)-N、Tt(1-40aa)/Sc(39-75aa) /Tt(78-151aa)-N。其中1-40aa包含GTx模体,41-77aa包含TASNIKS模体；78-151aa包含Y-C-F模体。同时,对N端结构域嵌合体中的一些关键的氨基酸位点进行突变,构建成N端嵌合体的突变体。将上述N端嵌合体及其突变体基因亚克隆至酵母表达载体pDB0948中。转化第一类肽链释放因子基因敲除的酵母菌株YDB447、利用双荧光素酶报告系统和质粒洗牌技术,分析了这些不同的N端结构域嵌合体eRFl识别终止密码子的性质。结果显示,G1/Sc-N对UGA、UAG通读效率分别提高了12.80%、0.81%,而对UAA的通读效率降低了3.54%；Sc/G1-N对UGA、UAG、UAA的通读效率较野生型分别降低了3.03%、2.92%、5.69%。贾第虫的eRF1的N端结构域中引入TASNIKS模体,Sc/G1-N对于eRF1识别叁个终止密码子的效率都有所提高,而引入Y-C-F模体,G1/Sc-N对于终止密码子中第二位碱基的识别有所影响。引入四膜虫eRF1的模体,Tt/Sc-N eRF1对于叁个终止密码子UGA、UAG和UAA的通读效率很高,分别达到了26.39%、8.02%、10.75%,不能识别终止密码子；Sc/Tt-N eRF1对叁个终止密码子的通读效率都相对较低,分别为3.97%、2.09%、3.20%,即能够同时识别叁个终止密码子,由此推测GTx和NIKS模体可能决定eRF1对UAG和UAA的识别。综上结果表明,四膜虫N端结构域中GTx和NIKS模体一定程度决定eRF1识别终止密码子第一位碱基U和第二位碱基A；Y-C-F模体决定eRF1识别终止密码子UGA的第二位碱基G。本研究结果为揭示肽链释放因子识别终止密码子的分子机制提供了重要的数据支持。(本文来源于《山西大学》期刊2015-06-01）
于竞飞,郭萍,柴宝峰[9]（2015）在《四膜虫eRF1识别终止密码子的功能结构域》一文中研究指出原生动物的一些纤毛虫中终止密码子发生重分配现象,将1个或2个终止密码子翻译为氨基酸.目前对这一现象的发生机制仍无合理解释.近年来,对蛋白质合成终止过程中肽链释放因子(eukaryotic polypeptide release factor,eRF)结构和功能的深入研究,为揭示终止密码子的重分配机制提供了重要的线索.本实验以具有终止密码子识别特异性的四膜虫Tt-eRF1为研究对象,将其中与密码子识别有关的GTx、NIKS和Y-C-F关键模体(motif)引入识别通用终止密码子的酵母Sc-eRF1中,构建成各种嵌合体eRF1.利用双荧光素酶报告系统和细胞活性实验,分析关键模体及其周边的氨基酸对eRF1识别终止密码子性质的影响.结果表明,GTx和NIKS模体一定程度上决定eRF1识别终止密码子第1位碱基U和第2位碱基A;Y-C-F模体决定eRF1识别终止密码子UGA的第2位碱基G.模体内及其相邻氨基酸定点突变分析进一步支持以上结果.本研究推测,eRF1在进化过程中一些关键模体结构的改变决定其识别终止密码子的特异性,只能识别3个终止密码子中的1个或2个.随后,由于tRNA基因的突变产生阻抑性tRNA,促成终止密码子在原生动物纤毛虫中的重新分配.(本文来源于《中国生物化学与分子生物学报》期刊2015年03期）
申泉,张丽,柴宝峰[10]（2015）在《终止密码子位点及无义突变介导的mRNA降解途径抑制对抗早发性无义突变药物atalruen通读效率的影响》一文中研究指出目的探讨终止密码子上下文结构和无义突变介导的m RNA降解途径(NMD)抑制对抗早发性无义突变(PTC)药物atalruen通读效率的影响。方法利用聚合酶链反应(PCR)定点突变的方法构建双荧光哺乳动物表达载体的早发性无义突变体p Ds Red-EGFPmtag-Y596X和p Ds Red-EGFPmtag-Y653X,转染哺乳动物细胞COS7,抗早发性无义突变药物atalruen,结合si RNA-upf1、放线菌酮(CHX)共同作用转染细胞,采用实时荧光定量PCR反应检测突变体上红色荧光蛋白(Ds Red)和绿色荧光蛋白(EGFP)的表达,测定通读效率。结果PTC突变体p Ds Red-EGFPmtag-Y653X对atalruen的促通读敏感性显着大于p Ds Red-EGFPmtag-Y596X;si RNAupf1和CHX抑制NMD对atalruen的促通读效率没有显着影响。结论 PTC位点的+4位核苷酸对于atalruen的促通读效率十分关键,该位置是胞嘧啶(C)的突变体敏感性要显着大于腺嘌呤(A);atalruen与常见促通读氨基糖苷类药物不同,不能协同NMD途径的抑制来促进早发性无义突变的通读。(本文来源于《中国药物与临床》期刊2015年03期）
终止密码子论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
在真核生物蛋白质翻译终止过程中,当叁个终止密码子UAA、UAG和UGA中的一个到达核糖体A位点时,被第一类肽链释放因子eRF1识别,翻译过程终止,在第二类肽链释放因子eRF3的协同下完成新生肽链释放。在翻译终止过程中,第一类肽链释放因子eRF1利用其N端结构域识别终止密码子。eRF1的N结构域中的GTS、NIKS和Y×C×××F模体对于终止密码子的识别发挥重要作用。但至目前为止,eRF1识别终止密码子的机制,尤其是对于终止密码子的选择性识别机制仍不清楚。在本实验中,我们首先构建了四膜虫(Tetrahymena thermophilia)eRF1的N结构域与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)eRF1的M和C结构域组成的杂合eRF1(Tt/Sc eRF1,Tt/Sp eRF1)。利用双荧光素酶报告体系检测结果证实,两种杂合的eRF1在细胞中识别终止密码子的活性具有显着差异。Tt/Sc eRF1识别终止密码子UGA,而不识别UAA和UAG终止密码子,与四膜虫eRF1一致,表现出了密码子识别特异性(对UGA、UAG、UAA的通读效率分别是1.98%、3.83%、11.04%);而Tt/Sp eRF1可以识别叁个终止密码子,无密码子识别特异性(对UGA、UAG、UAA的通读效率分别是2.81%、2.01%、1.88%)。由此说明四膜虫eRF1的N结构域不是决定其识别特异性的唯一因子,在eRF1的M和C结构域中可能存在决定eRF1识别性质的元件或细胞中其它因子可能通过M和C结构域参与eRF1识别终止密码子的过程。为解释这一现象,我们将Sp eRF1的C端小结构域中氨基酸进行突变,选择了其中的第357、361、364和367位的氨基酸突变为酿酒酵母eRF1相应的位点,得到一系列的突变体(Tt/Sp eRF1 A364Q、Tt/Sp eRF1 D361A/A364Q、Tt/Sp eRF1 L357A/D361A/A364Q、Tt/Sp eRF1L357A/D361A/A364Q/E367D)。同样也将裂殖酵母eRF1的364、367和371位氨基酸引入酿酒酵母eRF1,得到突变体Tt/Sc eRF1 Q364A、Tt/Sc eRF1 Q364A/D367E、Tt/Sc eRF1 Q364A/D367E/E371S。结果显示,所有的突变体对UGA的识别效率没有明显的变化,但是Tt/Sp eRF1的突变体对UAG和UAA的通读效率显着提高,说明其对这两个密码子的识别效率降低。而Tt/Sc eRF1的突变体,对终止密码子识别活性的影响不显着,其对UAG的识别活性稍有提高,通读效率从5.77%降至2.98%,以上结果表明C端小结构域影响到eRF1对UAG和UAA密码子的识别活性。为了进一步分析小结构域对识别活性的影响,通过对小结构域的蛋白结构分析发现在其结构域中存在关键的、多变的Loop(357~367aa)结构,因此我们将裂殖酵母和四膜虫eRF1小结构域中的Loop结构引入到杂合的Tt/Sc eRF1中。分析结果显示,引入两种不同Loop结构到Tt/Sc eRF1嵌合体中,均可识别叁个终止密码子,说明Loop结构显着的影响终止密码子的识别活性。由此表明,四膜虫eRF1的N端结构域识别终止密码子的活性受到C端结构域的影响,也说明eRF1的C端结构域参与了终止密码子的识别过程。从以上实验结果我们推测,是否酿酒酵母第二类肽链释放因子与两种酵母的嵌合体eRF1相互作用的效率不同,导致两个嵌合体识别终止密码子的效率和功能发生了改变呢?因此,在本实验中,我们将克隆得到的四膜虫eRF1嵌合体和裂殖酵母Sp eRF1以及酿酒酵母两类肽链释放因子Sc eRF1和Sc eRF3的基因,分别连接到酵母表达载体pGADT7和pGBKT7中,得到的重组质粒共转化到酵母菌株AH109。酵母双杂交结果证实四膜虫eRF1嵌合体(Tt/Sc eRF1/Tt/Sp eRF1)、功能Sp eRF1、Sc eRF1和Sc eRF3均存在相互作用关系,说明无论在何种细胞中,蛋白质翻译终止过程都需要两类肽链释放因子的协同作用来完成。排除了酿酒酵母细胞中嵌合体eRF1识别终止密码子的性质和活性的差异是由于Sc eRF3与嵌合体eRF1相互作用的效率不同而引起的。为了进一步验证N端结构域识别终止密码子的活性受到C端结构域的影响,我们通过双荧光分子互补实验(Bi FC)证实eRF1功能的主要调控因素是其N端结构域与C端结构域在分子内发生的相互作用引起的。通过克隆得到四膜虫eRF1的N结构域,C结构域、酿酒酵母eRF1的C结构域和裂殖酵母eRF1的C结构域及其突变体(Sp-C A364Q、Sp-C D364A/A364Q、Sp-C L357A/D364A/A364Q)的基因,分别连接到表达载体pQE-30和pET-28a中。结果表明四膜虫eRF1的N结构域与不同的C结构域以及突变体在体内都可发生相互作用,说明C端结构域通过与N端结构域的分子内相互作用,影响终止密码子的识别活性;也进一步证实了C端结构域参与了密码子的识别过程。综合以上结果表明,四膜虫eRF1的N端结构域不是其识别终止密码子的唯一因子,C端结构域在一定程度上影响并决定了eRF1对终止密码子是别的特异性。本研究结果,旨在为揭示肽链释放因子识别终止密码子的分子机制提供数据支持。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
终止密码子论文参考文献
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