丁忠英
（湖州市妇幼保健院浙江湖州313000）
【摘要】单链抗体具有分子量小，免疫原性低，组织穿透力强，特异性强等优点，通过重组DNA技术将单链抗体（singlechainantibodyfragment,scFv）基因与其他效应蛋白基因融合在一起，经表达后可以得到具有scFv特性和所融合的效应蛋白活性的scFv融合蛋白。这种融合蛋白已应用于许多领域的研究中，并已显示出较高的价值。本文就scFv融合蛋白的研究和应用做一综述。
【关键词】单链抗体融合蛋白表达载体
【中图分类号】R96【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）16-0380-02
融合蛋白[1]是指采用重组DNA技术在基因水平上将两种蛋白质或蛋白质的结构域的编码区，依读码框架首尾连接在一起，表达产生的一种新蛋白质,它具有双方蛋白的活性，这种新型的人工蛋白具有极高的应用价值和很好的发展前景，已广泛应用于许多领域的研究中。单链抗体[1]（scFv）是现在研究最多的小分子抗体，它由一段弹性连接链（linker）把抗体重链可变区（Vh）与轻链可变区（Vl）相连而成，是具有亲代抗体全部抗原结合特异性的最小功能结构单位,只有完整抗体分子的1/6，因而具有比完整抗体具有更大的优越性。因此，采用基因融合的方法在scFv的N端或C端，以一段多肽连接链和效应蛋白连接，可得到具有抗体活性和其他生物活性或功能的scFv融合蛋白。这种利用基因工程技术得到的scFv融合蛋白，和scFv一样能在大肠杆菌、酵母、哺乳类细胞、昆虫细胞、植物中得到有效的表达，可以大规模生产抗体融合蛋白，具有很大的应用潜力。
1scFv融合蛋白的研究进展
1.1活性研究
倪剑锋[2]等人将已经突变了稀有密码子的人IL-2(Ala125)基因,与GD2单链抗体基因通过over-lap-PCR法构建成ScFv-IL-2融合基因,并在基因的C端引入histag序列。ScFv-IL-2基因经测序正确后连接到表达载体pSE380上,然后导入大肠杆菌BL21中表达。表达蛋白鉴定和提纯后，通过ELISA试验结果证明该融合蛋白保存了与相应抗原的结合活性和IL-2的生物活性。
1.2抗降解研究
抗人纤维蛋白单链抗体-低分子质量尿激酶（Ⅱn-UK）融合蛋白，兼有单链抗体对纤维蛋白的亲和性和尿激酶的溶栓活性，有望开发成为新型导向溶栓药物，但基于通用连接肽（G4S）3的Ⅱn-lingker-UK融合蛋白在中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）中表达时出现明显的降解。为解决此降解问题，刘志刚[3]等人利用分子生物学方法，对Ⅱn-UK融合蛋白进行了分子改造，并分别研究了改造后的11种Ⅱn-lingker-UK或UK-lingker-Ⅱn突变体在CHO细胞中分泌性表达时的稳定性，最终筛选到了一种抗降解的突变体。
1.3亲和力和稳定性研究
王慧[4]等人以获得的抗A型肉毒毒素单链抗体为模板,进行融合改构,将人IgG1的Fc片段连接到ScFv的C端,在大肠杆菌中实现抗体融合蛋白ScFv-Fc的表达,体外活性检测结果表明,重组抗体融合蛋白ScFv-Fc可以特异结合A型肉毒类毒素抗原,其相对亲和力近似于母本单链抗体,其稳定性高于母本单链抗体。
1.4表达载体的研究
大肠杆菌表达系统因其遗传背景清楚、操作简便、经济快速等优点一直是重组蛋白的首选表达系统。但当重组蛋白的表达需要转录后加工或翻译后修饰时,大肠杆菌表达系统则往往难以胜任，特别是当需要表达的重组蛋白富含二硫键时。但选用胞内还原系统缺陷的菌株Origami(DE3)和共表达DsbC等方法可以促进了胞内二硫键的形成及异构化,实现了人源化单链抗体-低分子量尿激酶融合蛋白在大肠杆菌中的功能性表达[5]。
2scFv融合蛋白的应用
2.1在诊断方面的应用
刘俊霞[6]等人把碱性磷酸酶编码区插入pSTE2-8E5质粒DNA,用scFvC66的重链和轻链可变区DNA取代scFv-8E5的重链和轻链可变区DNA,构成表达载体pSTE2-C66-Ap在大肠杆菌中表达,用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹法分析产物活性。结果获得一个分子量为75kD的scFvC66-Ap融合蛋白,可结合来自KG1a细胞裂解物中的一个分子量约60kD的蛋白质带,其结合功能可通过其碱性磷酸酶活性直接测定。从而建立了一个用大肠杆菌制备单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的方法,它可能取代常规的碱性磷酸酶标记方法而用于免疫检测。
2.2在治疗方面的应用
王凯[7]等人设计引物扩增人抗HER2单链抗体e23scFv基因和轻链恒定区编码序列(Ck),连接成ScFv/Ck片段,人工合成鱼精蛋白截短体（tP）序列,连接于ScFv/Ck末端,构建成ScFv/Ck/tP融合基因,将其克隆入原核表达载体pET32a后,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS中诱导表达,表达产物持了与抗原的结合活性,同时具有结合DNA的能力。为该ScFv用于HER2阳性肿瘤的靶向基因治疗奠定了基础。
卢志贤[8]等人通过扩增构建成含C1与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因的原核表达质粒GFPC1/pET-26b，测序验证后转化大肠杆菌BL21后以IPTG诱导表达,免疫荧光检测表明纯化的GFPC1可与HepG2细胞膜特异结合。这说明了利用GFP作为标记分子,可以观察到去唾液酸糖蛋白受体单链抗体C1与HepG2细胞膜较强的结合能力,为应用C1对肝癌进行靶向生物治疗奠定基础，构建成功的GFP/pET-26b原核表达系统为其他靶分子的研究提供了一个有力的工具。
3scFv融合蛋白存在的问题及展望[8]
目前，基因工程scFv融合蛋白在临床肿瘤影像分析、抗肿瘤、抗病毒以及临床诊断等方面已显示出了巨大潜力[9]。但是由于scFv分子内Vh和Vl间相互作用力较弱，同时scFv功能单一，仅能与一种抗原特异性结合，使得scFv融合蛋白在应用方面受到一定限制。又因为有鼠源抗体的免疫原性的限制，所以为降低免疫原性，采用噬菌体抗体库直接制备人源抗体以及表位印膜选择构建人抗体库，再用抗原进行选择可制备人源单链抗体。同时高活性的scFv融合蛋白的表达还相当困难，产量低，大量生产有活性的可溶性蛋白技术尚不成熟，包涵体的复性困难；因此通过各种表达途径和表达方法提高scFv融合蛋白的表达产量和生物学活性还亟待研究。但是相信随着分子生物学技术的迅速发展，将会解决现在的难题，制备更多、更好的基因工程产品应用于临床。
参考文献
[1]范华英,孟繁平.单链抗体融合蛋白的构建及应用,生物技术通讯,Vol.16No.1Jan2005
[2]倪剑锋，纪剑飞.抗GD2单链抗体-IL-2融合蛋白基因的构建及表达，生物医学工程学杂志，2007;24(1)∶70～175
[3]刘志刚，林建波.重组单链抗体-低分子量尿激酶融合蛋白在CHO细胞中的抗降解研究，生物化学与生物物理进展，2005，32（6）
[4]王慧，史晶.抗A型肉毒毒素人源单链抗体融合蛋白的重组设计，微生物学通报，2005,32(4)
[5]刘志刚,林建波,袁旭东.人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体-尿激酶融合蛋白在大肠杆菌中的功能性表达,生物工程学报,Vol.18No.4July2002
[6]许静，刘俊霞.单链抗体2碱性磷酸酶融合蛋白的制备，中国免疫学杂志2003年第19卷
[7]王凯，温伟红.人源抗HER2单链抗体/轻链恒定区/鱼精蛋白截短体融合蛋白的基因构建、表达及活性鉴定，第四军医大学学报,2007,28(7)
[8]卢志贤,陈江.去唾液酸糖蛋白受体单链抗体与绿色荧光蛋白的融合表达及其靶向性观察，南京医科大学学报，第26卷第12期2006年12月
[9]唐彩华.单链抗体及其融合蛋白在肿瘤诊治中的应用,中国肿瘤2004年第13卷第3期