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摘要：三维荧光光谱具有灵敏度高、信息量大、操作简便等优点，在环境污染检测、石油化工等领域得到了广泛的应用。本文对污水厂活性污泥荧光物质的温度敏感性进行了分析。
关键词：污水厂；荧光物质；敏感性
污泥的三维荧光分析具有简单、直观、信息量大等优点，若能找到一种与污泥密切相关的敏感荧光物质，就可以分析图谱波峰的变化趋势，得到污泥活性的信息。基于此，本文采用三维荧光技术研究了不同污水处理厂活性污泥中荧光物质的温度敏感性。
一、活性污泥简介
活性污泥是微生物群体及它们所依附的有机物质和无机物质的总称，1912年由英国的克拉克(Clark)和盖奇(Gage)发现，活性污泥可分为好氧活性污泥和厌氧颗粒活性污泥，活性污泥主要用来处理污废水。
1、活性污泥的组成。活性污泥中有细菌、真菌、原生动物和后生动物。其中好氧细菌是分解有机物的的主体。1mL曝气池混合液中细菌总数约为1×108个(亿)。真菌中主要是丝状的霉菌，在正常的活性污泥中真菌不占优势。如果丝状菌显著增长，则活性污泥的沉降性能恶化。原生动物和细菌一起在污水净化中起作用。在1mL正常的活性污泥混合液中，一般存活着5×103～2×104个原生动物，其中70%～90%为纤毛虫类。原生动物促进了细菌的凝聚，提高细菌的沉降效率。原生动物以细菌为食饵，可去除游离细菌。活性污泥中的后生动物通常有轮虫和线虫。这些后生动物都摄食细菌、原生动物及活性污泥碎片。
2、活性污泥的物质组成。Ma：具有代谢功能的微生物群体；Me：微生物残留物(主要是细菌内源代谢，自身氧化产物)；Mi：由原污水携入的难为细菌降解的惰性有机物；Mii：由污水携入的无机物。
荧光分析法的优点之一是灵敏度很高，其灵敏度一般要比其他微量分析法高2～3个数量级。荧光分析的灵敏度可达亿分之几，在与其他技术联用时，荧光检测能够接近或达到单分子检测的水平。荧光分析法还有选择性高的优点，尤其体现在对有机物的分析检测方面。因为结构有差异，所以并非所有的有机物都有荧光，能发荧光的物质的激发和发射波长也存在差异。因此，选择适当的激发波长或者发射波长作为检测波长，可以实现选择性检测目的。或者通过考察其他的荧光特性参数，如量子产率、荧光寿命、荧光偏振等来进一步进行分析测定。这些可以借助选择不同的测试技术如同步扫描、导数光谱、三维光谱、相分辨和时间分辨等进一步提高测定的选择性。此外，用量少、方法简单、线性范围宽、重复性好、操作简单也是荧光光谱分析的优点。
二、材料与方法
1、实验材料和样品采集。以某市周边四个污水处理厂曝气池的活性污泥为研究对象，用采样瓶取出后送回实验室，进行连续曝气培养，并对相关数据进行测试分析，根据三维荧光的激发波长和发射波长，将荧光光谱分为五个区域。通过比较四种有机荧光物质LB-EPS、TB-EPS、DOM和IOM的激发波长和发射波长，研究了四种有机荧光物质对环境温度的敏感性。
2、EPS的提取方法。用阳离子交换树脂法分别提取了LB-EPS和TB-EPS。离子交换树脂在提取缓冲液中洗涤1小时，晾干备用。取5mL污泥混合液，加入10mL纯水，在4000r·min-1，4℃下离心5min，去上清液，加10mL磷酸盐缓冲溶液(PBS)后离心去上清液(PBS浓度0.01mol·L-1)，加入10mLPBS，在功率5W超声波细胞破碎仪器中5min冰浴破碎；10000r·min-1，4℃离心15min，取上清液经0.45μm滤膜过滤后，得到为LB-EPS。去除上清液后，向污泥中加入10mLPBS，倒入称好的2.5～2.6g阳离子交换树脂中，在水浴中搅拌2小时；将泥水混合物与树脂分离后在10000r·min-1，4℃离心30min，再取离心后上清液在同等转速下离心15min，此步循环3次；取上清液，经0.45μm滤膜过滤后为TB-EPS。
3、胞内有机物的提取。向5mL污泥中加入一滴浓硫酸后，在12000r·min-1下离心5分钟，加5mLpH7.75的Tris-HCl(溶液浓度0.05mol·L-1)，80℃加热20min，冷却至室温，然后用0.45μm滤膜过滤。
4、数据分析。荧光光谱分析采用FP-6500型荧光分光光度计，其是采用氙弧灯作为激励源，激发波长为Ex=(220～500)nm，发射波长为Em=(280～550)nm，激发和发射波长的狭缝宽度为5nm，激发波长和发射波长的扫描间隔分别为2nm和5nm，扫描速度为2000nm·min-1，响应时间为0.5s，灵敏度为中等。采用三维荧光法直接测定提取的LB-EPS、TB-EPS、DOM和胞内物质。荧光强度为对数，用Matlab编制批量荧光图谱，再用SPSS进行方差分析。
三、结果与讨论
1、温度对四种污水处理厂活性污泥荧光数据的影响。本试验选取某市四个污水处理厂曝气池的活性污泥，平均室外温度为15、8、5℃。通过观察发现，温度的降低对DOM与LB-EPS荧光数据的影响不大。虽然多种因素影响了废水处理厂荧光物质的分布，但LB-EPS中芳香蛋白Ⅱ区和代谢物Ⅳ区的激发和发射波长范围基本稳定，Ⅱ区Ex/Em(230/334nm)、Ⅳ区Ex/Em(285/336nm)。
TB-EPS受温度影响在芳香蛋白I区、芳香蛋白Ⅱ区和腐殖酸V区的激发、发射波长变化明显。TB-EPS代谢产物区的激发波长相对稳定但是发射波长呈现红移趋势，SIW污水厂荧光物质的激发波长346nm、352nm、356nm;
在温度的影响下，TB-EPS在芳香蛋白I区、芳香蛋白Ⅱ区和腐植酸V区的激发和发射波长发生了显著变化。TB-EPS代谢物区的激发波长相对稳定，但发射波长呈红移趋势。另外，温度的降低会改变TB-EPS的结构，降低溶剂体系的相应转变能，从而使光谱发生红移。通过对微生物代谢IV区的比较，发现温度的降低影响了微生物代谢酶的活性，降低了代谢频率，减少了生色基团，从而减弱了荧光强度。
DOM腐植酸区的荧光数据表明：SAW污水处理厂DOM腐植酸的荧光强度高于其他以生活污水为主的污水处理厂，当一些大分子有机废水流入城市污水处理厂时，其中约85%是DOM。相比之下，微生物降解这些物质产生了更多的腐植酸。从DOM腐植酸的荧光强度大小可知，难降解污水厂>县城污水厂>城市污水厂。
2、荧光物质的敏感性分析。活性污泥敏感性排序主要有两方面：①比较同一物质在不同温度下的荧光图谱，以确定荧光物质的敏感性。②计算DOM、IOM、LB-EPS和TB-EPS对应区域的激发波长和发射波长的标准差，并比较标准差的大小，以此来判断荧光物质的敏感性。前一种方法直接生成光谱图，通过比较相应区域波峰数目和位置，达到快速识别荧光物质敏感性的目的。然而，其缺点是不能准确地反映出波峰的细微移动和发射波长的变化规律。后一种方法需要在二维矩阵中找到相应的波峰位置，然后计算激发波长和发射波长的标准差。该方法繁琐、复杂，但能准确反映荧光物质的偏移，定量分析荧光物质的敏感度。
1)荧光图谱波峰的识别。利用Matlab对SIW污水处理厂的荧光数据进行处理，图1、2中的序号TB-EPS-1、2、3；IOM-1、2、3；DOM-1、2、3；LB-EPS-1、2、3分别对应于四类荧光图谱。从图1中对比TB-EPS的3幅图可明显看出波峰的数量不同，TB-EPSd有3个峰分别是：PeakA、PeakB和PeakC。TB-EPS-2有2个峰分别是PeakA、PeakB。TB-EPS-3只有一个峰位于PeakB；观察图1中的IOM3幅图发现波峰的位置不同，IOM-l的是PeakD(Ex/Em=350/418），PeakE(Ex/Em=265/410）腐殖酸V区，与后2张差别较大，IOM-2的是PeakD(Ex/Em=375/478）、PeakE(Ex/Em=285/358），IOM-3的是PeakD(Ex/Em=380/478）、PeakE(Ex/Em=290/374），比较观察，IOM波峰激发、发射波长变化幅度低于TB-EPS。图2、3张LB-EPS荧光图谱腐殖酸区域波峰位置稍微变化，其他波峰位置基本上没变，各峰值的位置接近。图2、3张DOM荧光图谱波峰位置变化不大，DOM-1的PeakE(Ex/Em=355/434）腐殖酸V区、DOM乏的PeakE(Ex/Em=355/436)、DOM-3的PeakE(Ex/Em=360/436）；因此，从图象可知，敏感性：TB-EPS>IOM>LB-EPS>DOM。
2)敏感性量化。计算DOM、IOM、LB-EPS和TB-EPS对应区域的激发波长和发射波长的标准差，经SPSS方差分析表明，TB-EPS的激发波长和发射波长的标准差值较大，且有明显的变化。从胞内到胞外的敏感性排序为：TB-EPS>IOM>LB-EPS>DOM。
DOM与进水有关，通常生活污水是城市污水的主要来源。经过污水环境的长期驯化，污水生态系统中的LB-EPS逐渐稳定。虽然外部环境会对LB-EPS产生影响，但这种影响是长期积累的结果。因光谱图像中的三个峰(PeakA、PeakB、PeakC)值太高，没有发现污泥的微小变化，因此LB-EPS的敏感性和滞后性较差。IOM与微生物细胞的状态密切相关，荧光物质在不同生长阶段和外界条件下的光谱图像也不同。TB-EPS芳香蛋白区的荧光强度反映了微生物的生化降解能力，TB-EPS与污泥中的细胞状态密切相关，该特性可用于建立与微生物活性的关系，从而更好地了解污泥的降解能力。
四、结语
污水厂活性污泥是由内部微生物群落和外部环境共同作用形成的一个高通量复杂体系。DOM相对稳定，其取决于进水成分；LB-EPS是细胞外层和污水之间最先接触；TB-EPS与细胞内部最为密切相关；IOM直接反映污泥微生物的内部构成，四种物质的变化将影响污水处理厂的处理效果。若能找到一种将这些荧光物质综合在一起分析的方法，或通过监测某种具有代表性物质的变化趋势，就可预测污泥的工作状态，及时调整污水处理厂的运行工况，从而避免运行风险。
参考文献：
[1]王伟.污泥内层和外层胞外聚合物的三维荧光光谱特性研究[J].光谱学与光谱分析，2015(29).
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