张博姜家康（黑龙江中医药大学黑龙江哈尔滨150040）
【中图分类号】R285.6【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2010)11-0057-03
【摘要】目的观察润肺消积汤对肺癌小鼠肿瘤生长抑制作用及治疗的作用机制。方法取100只小鼠随机分为空白组，模型对照组，润肺消积汤组，顺铂(DDP)组，联合组（润肺消积汤加顺铂），每组20只，将后四组小鼠移植建立肺癌小鼠模型[1]，治疗期间，观察小鼠肿瘤生长情况，实验后，处死小鼠，称取瘤重，计算抑瘤率，做病理切片，并采用免疫组化法观测组织蛋白酶B（CB）染色阳性率。结果各治疗组抑瘤率均高于模型对照组（P＜0.05），联合组抑瘤率高于其他治疗组（P＜0.05）；各治疗组CB染色阳性率均低于模型对照组（P＜0.05），联合组CB染色阳性率低于其他治疗组（P＜0.05）。结论润肺消积汤联合顺铂对肺癌生长具有协同抑制作用，并可降低肺癌细胞CB表达。
【关键词】肺癌组织蛋白酶B(CB)润肺消积汤实验研究
近年来，肺癌已成为常见的恶性肿瘤之一，实践证明，中医药在综合治疗肺癌方面有独特的优势。本实验通过给予肺癌小鼠润肺消积汤，以观察润肺消积汤对肺癌小鼠治疗增效的作用机制及对肿瘤生长的抑制作用，并为润肺消积汤的临床应用提供实验依据。
1材料与仪器
1.1药物和仪器设备，试剂盒
药物润肺消积汤：西洋参，黄芪，南沙参，黄精，紫苑，款冬花，枇杷叶，半边莲，白花蛇舌草，山慈菇，川贝，地骨皮，甘草等中药，购自黑龙江中医药大学附属第一医院中药局。
仪器医用超净工作台SW-GIF：中国苏州净化设备有限公司；超低温冰箱MDF-328：日本三洋公司；倒置式生物显微镜：日本OLYMPUS公司；高速冷冻离心机：R21日本日立制作所；超薄切片机：日本OLYMPUS公司；电子天平（FA2004型）：上海天平仪器厂；电热恒温水浴箱：北京医疗设备厂；免疫组化试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司。
1.2动物C57BL/6N小鼠100只，6-8周龄,雄性,体重18-22g，购自黑龙江中医药大学实验动物中心。
1.3瘤株Lewis肺癌荷瘤小鼠，购自哈尔滨医科大学附属第三医院实验动物中心。
2方法
2.1Lewis肺癌小鼠动物模型的建立将lewis肺癌荷瘤小鼠处死后，放入75%的酒精中浸泡消毒10分钟，按无菌操作程序，在超净工作台上剥离瘤体，取生长良好、无坏死的肿瘤组织，用生理盐水冲洗，然后将肿瘤组织放于盛有生理盐水的烧杯中剪碎、研磨，用生理盐水以1∶3的比例匀浆制备成细胞悬液，随机取出20只小鼠作为空白对照组，其余80只小鼠肺内接种肺癌瘤细胞悬液0.2ml，按照标准条件进行人工饲养。
2.2分组及给药将未接种肺癌瘤细胞悬液的20只小鼠作为空白对照组，日一次给予生理盐水0.2ml/只，灌胃。将接种瘤细胞悬浊液后一周成瘤的模型小鼠随机分四组，每组20只，分别为模型对照组，日一次给予生理盐水0.2ml/只，灌胃；润肺消积汤组（生药量35.00g·kg-1·d-1），日一次0.2ml/只，灌胃；顺铂组[2]2mg·kg-1·d-1，用生理盐水稀释，日一次0.2ml/只，腹腔内注射；联合（润肺消积汤加顺铂）组，给予润肺消积汤（生药量35.00g·kg-1·d-1），隔日一次，0.2ml/只，灌胃，并以顺铂0.2ml/只，用生理盐水稀释，日一次，腹腔内注射，连续给药30天。
2.3一般检测与观察指标
2.3.1末次给药后24h，将各组小鼠颈椎脱臼处死，用眼科剪分离剥取肿瘤，电子天平称重量，计算各组小鼠平均瘤体质量,计算抑瘤率。
2.3.2瘤组织病理检查及免疫组化肿瘤组织经体积分数10%福尔马林固定24小时后常规石蜡包埋，4μm厚连续切片，苏木素-伊红（HE）染色，肉眼观察肿瘤生长，光镜下观察肿瘤坏死及间质血管增生情况。免疫组化采用SABC法，石蜡切片常规脱蜡、水化，0.3%H2O2去除内源性过氧化物酶，正常羊血清封闭，滴加一抗，滴加后4℃过夜，对照片免去一抗用PBS缓冲液代替一抗进行阴性对照。次日滴加二抗，滴加试剂SABC，DAB显色，苏木素复染。
观察免疫组化分析组织细胞中的CB阳性反应（CB阳性表现为细胞质着成棕色）:小于30%的肿瘤细胞染色阳性为CB阴性反应，大于30%的肿瘤细胞染色阳性为阳性反应，统计染色阳性结果，计算阳性率。
2.4统计学处理实验数据以均数±标准差（x-±S）表示，P＜0.05有显著性差异，所有数据均经SPSS13.0软件处理。
3实验结果
3.1药物对肿瘤的影响接种后前三天各组未见明显肿瘤生长，从第八天开始，除空白组外，其余各组均可见肿瘤生长，模型对照组肿瘤生长明显快于其他治疗组
3.2病理所见（除外空白组）
3.2.1肉眼所见肿瘤呈圆形、椭圆形或分叶状生长，质地硬，大部分与周围组织分界清楚。
3.2.2镜下所见肿瘤细胞形状不规则，可见瘤巨细胞，大小不一，核大，浓染，核异形性明显，可见病理性核分裂相，核质比例明显增大，并可见血管增生，以间质及肿瘤边缘为主。各组内均可见组织坏死区，顺铂组可见大片坏死，模型对照组相对较少。各组间质中均可见血管成分，各治疗组血管成分较模型对照组血管成分减少，联合组血管成分减少明显。
3.3润肺消积汤对小鼠肿瘤细胞CB表达阳性结果及阳性率的影响
4实验结论
4.1润肺消积汤、顺铂组、联合组对肺癌小鼠肿瘤生长均有抑制作用，且联合组抑瘤效果明显优于其他治疗组。
4.2润肺消积汤、顺铂组、联合组均可减少肺癌小鼠瘤细胞间质血管增生，且联合组减少血管增生明显。
4.3润肺消积汤、顺铂组、联合组均可降低肺癌小鼠肿瘤细胞CB的表达，且联合组的CB表达阳性率明显低于其他治疗组。
5讨论
组织蛋白酶B[3](cathepsinB，CB)是肿瘤细胞与其周围的细胞外基质之间发生动态变化过程中释放的多种酶中的主要酶类，其可使细胞外基质成分降解，从而促进肿瘤的侵袭转移，因此CB在肿瘤浸润转移过程中发挥着重要作用。另外，近年研究发现CB可以促进肿瘤血管的增生，而且CB表达水平的高低与肿瘤的预后呈正相关[4、5]。
中药润肺消积汤主要由西洋参、黄芪、南沙参等组成，在中医治疗肿瘤“扶正祛邪”的原则基础上，西洋参、黄芪与南沙参配伍以补气养阴；黄精、紫苑、款冬花、枇杷叶，川贝母配伍以润肺化痰；半边莲、白花蛇舌草、山慈菇配伍以清热解毒，化痰散结；地骨皮以清虚热、凉血；甘草以调和诸药。各药相配伍共奏清热解毒，软坚散结，益气养血之功。且现代药理研究发现半边莲、白花蛇舌草、山慈菇具有抗癌作用。
本研究表明，润肺消积汤联合顺铂治疗肺癌可抑制肿瘤生长，并可良好的降低肺癌小鼠肿瘤细胞CB的表达。因此润肺消积汤为中医治疗肺癌提供了一定的临床依据，并开辟了一条新思路。
参考文献
[1]田雪莲，王莎莉.建立移植型肺癌动物模型的最新方法和进展.重庆医科大学学报，2007,32(12):1337-1338.
[2]张平，贺兼斌，欧立文等.苏拉明联合顺铂对肺腺癌小鼠移植瘤生长和转移的影响.癌症，2006,25(4)：409-413.
[3]李美宁,程牛亮.组织蛋白酶B与肿瘤.国外医学肿瘤学分册，2005，32（6）：429-432.
[4]肖庆，唐深，樊晓晖.组织蛋白酶B及抑制剂与肿瘤.现代肿瘤医学，2008，16(4):674-676.
[5]KruszwskiWJ,RzepkoR,WojtackiJ,etal.OverexpressionofcathepsinBcorrelateswithangiogenesisincolonadenocarcinoma.Neoplasma,2004,51(1):38-43.