导读:本文包含了钙调蛋白基因论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:蛋白,基因,生物,平滑肌,内皮,半夏,桑树。
钙调蛋白基因论文文献综述
梁威,杨铁柱,沈和定,许国绿,顾冰宁[1]（2019）在《瘤背石磺钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅳ(CaMKⅣ)基因的克隆及组织表达》一文中研究指出钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅳ(CaMKⅣ)是一种广泛存在于真核生物中的调控因子,在生物体内具有多种生理功能。为了探究瘤背石磺中Ca MKⅣ的作用和分子机制,为进一步阐述Ca MKⅣ的生理功能提供科学的理论依据。本实验以瘤背石磺神经节为实验材料,利用RACE-PCR技术克隆得到CaMKⅣ基因的cDNA序列,并进行生物信息学分析和q RT-PCR实验。结果显示,瘤背石磺Ca MKⅣ基因的c DNA全长1 603 bp,开放阅读框为1 032bp,5′非编码区315 bp,3′非编码区256 bp,共编码343个氨基酸;预测该基因编码的多肽链原子数量是5 490,分子量约为3.87 ku,理论等电点6.12,分子式为C1741H2768N452O514S15,N端信号肽由1～29个氨基酸组成。氨基酸序列比对及系统进化树结果显示,瘤背石磺CaMKⅣ基因与加州海兔、光滑双脐螺CaMKⅣ基因的亲缘关系最为接近,其系统进化分析与传统的形态学分类相吻合。荧光定量PCR结果显示,CaMKⅣ基因在各个组织均有表达,其中在腹足的相对表达量最高,其次是背部皮肤、口器,而在神经节组织、蛋白腺、肠、肝胰腺等脏器组织的相对表达量较低,初步推测,该基因在瘤背石磺的神经调节中发挥重要作用,或为生物机体感知外界环境变量因素的分子基础。本实验为今后进一步了解瘤背石磺神经结构生理功能的调节以及与CaMKⅣ基因功能研究奠定理论支撑,也为探究海洋动物由海洋向陆地进化过程中对环境的适应机制提供参考。(本文来源于《水产学报》期刊2019年11期）
刘兴,代欢欢,山雨思,杨怡,廖志华[2]（2019）在《半夏钙调蛋白基因的克隆与表达分析》一文中研究指出该研究根据半夏转录组数据,克隆获得2条半夏钙调蛋白基因,分别命名为Pt Ca M1和Pt Ca M2。生物信息学分析表明,Pt Ca M1,Pt Ca M2基因的完整开放阅读框均为450 bp,编码149个氨基酸,两者编码区序列一致性为80%,氨基酸序列一致性为91%,且均含有EF-hand结构域,属于Ca M家族。采用实时荧光定量PCR分析Pt Ca Ms在不同组织和不同处理中的表达模式,结果表明Pt Ca M1,Pt Ca M2基因均在块茎中表达量最高;外源Ca Cl2处理后Pt Ca Ms的表达量与对照相比显着升高,钙离子鳌合剂EGTA、钙离子通道抑制剂La Cl3以及钙调蛋白拮抗剂TFP处理后其表达量逐渐降低。该研究从半夏中成功克隆得到Pt Ca Ms基因,为深入探索Pt Ca Ms基因功能特点和半夏生物碱合成的研究奠定基础。(本文来源于《中国中药杂志》期刊2019年13期）
黄艳[3]（2019）在《桑树中钙调蛋白与类钙调蛋白基因的鉴定与功能分析》一文中研究指出钙离子作为重要的次级信使,广泛参与了植物的生理生化过程。钙调蛋白(Calmodulin,CaM)及类钙调蛋白(Calmodulin-like protein,CML)作为Ca~(2+)重要的受体,在Ca~(2+)信号转导过程中发挥作用。研究表明,CaM及CML在植物的生长发育、抗逆等过程中起着重要的调控作用,而在桑树中的相关研究鲜少报道。本研究基于川桑基因组数据库,利用生物信息学的方法,通过对保守结构域、基因结构及系统进化树进行分析,鉴定得到桑树4个CaMs及42个CMLs基因。在桑树红果二号中克隆了MaCaMs及MaCML1基因,通过肉阜杯盘菌(Ciboria carunculoides)及灰霉菌(Botrytis cinerea)处理的定量结果,筛选得到抗病相关的基因MaCaM2及MaCML1。在烟草中异源过表达MaCaM2及MaCML1,在转基因植株中检测抗病相关基因的表达量,以及植株的感病情况,获得主要的研究结果如下:1、桑树中钙调蛋白及类钙调蛋白基因的鉴定利用生物信息学的方法,在川桑基因组数据库中分别鉴定到4个钙调蛋白(MnCaMs)及42个类钙调蛋白基因(MnCMLs)。其中MnCaMs含有4个EF-hand基序,而MnCMLs含有的EF-hand数目为1-4个不等;基因结构显示,MnCaMs包含一个或叁个内含子,且第一个内含子都在Gly_(26)位处产生,而MnCMLs的内含子数目变化较大,且多数MnCMLs没有内含子。系统进化分析表明,桑树中的CaMs及CMLs与拟南芥亲缘关系更近。2、桑树MaCaMs及MaCML1的克隆及生物胁迫下的表达分析在红果二号中克隆了4个钙调蛋白(MaCaMs)及1个类钙调蛋白(MaCML1),并对其进行组织特异性表达分析。结果表明,5个基因在所有组织中均表达,但其在各个组织中的表达模式不同,其中MaCaM1-1与MaCaM1-2在各个组织中高表达,MaCaM1-1在果中表达量最高,MaCaM1-2在幼叶中表达量最高。亚细胞定位表明,它们在细胞质、细胞膜及细胞核中均有分布。将肉阜状杯盘菌处理红果二号的叁个不同时期(早、中、中后期)的桑葚及相应时期的健康桑葚,进行转录组分析。通过热图分析MaCaMs及MaCMLs的表达情况,大部分基因在病果2期及3期出现上调表达。通过灰霉菌处理桑苗叶片,发现MaCaM2/3及MaCML1显着上调表达,且均在24h后达到峰值,而MaCaM1-1及MaCaM1-2表达差异不显着。结合两种不同的生物胁迫处理,选取MaCaM2及MaCML1两个上调表达显着的基因进行后续研究。3、MaCaM2及MaCML1蛋白的功能初探通过原核表达,得到了MaCaM2及MaCML1蛋白。纯化后的目的蛋白用于检测与Ca~(2+)结合情况,以EGTA为Ca~(2+)螯合剂,MaCaM2为对照,通过SDS-PAGE电泳迁移率发现,与Ca~(2+)结合后的蛋白比与EGTA结合后的迁移率快,且MaCaM2与MaCML1迁移率相同。说明MaCaM2及MaCML1结合Ca~(2+)构象都发生了变化,且二者结合Ca~(2+)的能力相同。以纯化的蛋白处理桑叶及烟草叶片,结果表明,MaCML1能够诱导活性氧积累从而引起坏死反应,相比之下MaCaM2诱导能力较弱。通过构建植物过表达载体,将MaCaM2及MaCML1在烟草中异源过表达,检测阳性转基因植株中,与真菌抗病相关基因的表达情况,其中PR1、PR2、PR10及WRKY12在转基因植株中高量表达。用灰霉菌处理转基因植株叶片与野生型植株叶片,转基因植株中的病斑显着小于野生型植株的病斑,说明MaCaM2及MaCML1能够提高抗病相关基因的表达,进而提高植物对灰霉菌的抗性。(本文来源于《西南大学》期刊2019-05-14）
刘丹丹[4]（2019）在《类钙调蛋白亚家族基因（NbrgsCaMs）在本氏烟发育和应激胁迫中的表达及作用》一文中研究指出类钙调蛋白(Calmodulin-like protein,CML)作为一类钙离子传感器,在植物应对非生物和生物应激反应中起着重要的调节作用。Rgs Ca M是CML的一个独特分支,因在烟草中作为基因沉默调控因子(Regulator of gene silencing)而被知。CML37、CML38和CML39是拟南芥Atrgs Ca Ms家族的叁个成员,因此我们认为本氏烟中可能有几种Nbrgs Ca Ms,同Atrgs Ca Ms一样,能够响应不同的环境和生长发育刺激。为了进一步了解rgs Ca M在植物生长发育和环境胁迫中的调节作用,进行了以下研究。1 Rgs Ca M家族基因的序列分析:通过检索本氏烟(Nicotiana benthamiana)全基因组序列,我们得到7个同系物,并根据同系物序列比对的结果依次命名为rgs Ca M1-7。对这7个含基因保守结构域(EF-hand)的Rgs Ca M家族进行氨基酸序列比对分析并构建系统发生树,发现其中有5个是真正的Nbrgs Ca M编码序列,另外两条序列可能是伪基因或功能未知蛋白。因此我们选定rgs Ca M1、3、4(rgs Ca M4是以前报道的Nbrgs Ca M),5和7作为研究目标,来阐明N.benthamiana中rgs Ca M家族基因的特征。通过氨基酸序列比对和系统进化树分析发现Nbrgs Ca Ms编码序列具有70.4%到93.3%的相似性;氨基酸序列具有60.2%到83.2%的同源性。2 Rgs Ca M家族启动子的活性分析:基于β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase,GUS)报告系统,我们构建了嵌合型rgs Ca M启动子(rgs Ca Mp::GUS)。依据GUS染色强弱和RT-q PCR检测GUS基因转录水平的高低,来反映转基因本氏烟不同发育阶段和特定应激处理下Nbrgs Ca M家族启动子活性的强弱情况。结果显示,每个Nbrgs Ca Mp驱动一个重迭但特定的GUS表达模式。Nbrgs Ca Mps主要在幼苗和成熟植株的叶脉和根组织中表达,Nbrgs Ca Mp4是Nbrgs Ca Mps中最活跃的一个。同时,Nbrgs Ca Mps编码序列之间相似度较高,且序列中预测到包含许多功能相同的增强子调控元件,因此,我们认为植物体内Nbrgs Ca Ms很可能具有重迭表达和功能补偿的作用模式,来共同调控植株生长发育和应对环境刺激。3 病毒侵染下NbrgsCaMp4表达活性分析:对NbrgsCaMp4::GUS接种TYLCCNV-A,TYLCCNV-A+β,PVX,PVX+β,TMV的系统叶片进行GUS染色,Nbrgs Ca Mp4::GUS对植株破坏性较大的TMV病毒的响应最强,其次对植株发病后期βC1复合侵染组(TYLCCNV-A+β,PVX+β)的响应。GUS染色和RT-q PCR分析发现,TYLCCNV的侵染早期,单接TYLCCNV A组和βC1复合侵染(TYLCCNV-A+β)组并未表现出启动子活性差异。TYLCCNV的侵染后期,TYLCCNV A+β处理组表现出了较高的启动子活性。TYLCCNV A单独侵染N.benthamiana时,不能引起可见的表型,而βC1作为病原致病因子,是造成植株,曲叶、脉凸的根本原因。因此我们认为βC1可能通过毒性破坏作用诱导Nbrgs Ca M4的表达。4 NbrgsCaM4的表达水平差异分析:TYLCCNV A+β侵染野生型和转基因植株在发病前期Nbrgs Ca M4表达水平与单接TYLCCNV A组无明显差异。野生型植株与转基因植株TYLCCNV A+β组发病后期Nbrgs Ca M4表达水平却高于单接TYLCCNV A组。同时,βC1转基因N.benthamiana中Nbrgs Ca M4的表达水平,无论是在幼苗植株,还是成熟植株中,均高于野生型植株2-3倍,可见βC1诱导提高了Nbrgs Ca M4基因的表达。通过接种不含病毒的缓冲液,对植株施加机械损伤,Nbrgs Ca Mp4对损伤应激反应表现出表达含量几十倍上升。此外,植株的叶龄、年龄也影响Nbrgs Ca M4的表达,老叶中表达含量高于嫩叶几十倍,成熟植株中的表达含量高于幼苗中几十倍。因此,Nbrgs Ca M4作为CML亚家族的一员,除了可在植株一般发育阶段所诱导外,不同程度的植株损伤胁迫效应(盐、干旱、机械损伤、病毒侵染类型)会导致Nbrgs Ca Mps活动的多样性。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2019-05-01）
杨丹,李清,朱利泉,赵天田,梁丽松[5]（2018）在《平欧杂种榛钙调蛋白基因ChaCaM的克隆与表达分析》一文中研究指出以平欧杂种榛(Corylus heterophylla×C.avellana)品种‘达维’为材料,基于转录组测序数据,利用RACE技术克隆钙调蛋白基因,通过生物信息学进行序列预测分析,并利用实时荧光定量PCR技术分析其在不同组织和自交不亲和授粉后不同时间雌蕊中的表达模式。克隆获得一个钙调蛋白基因序列,命名为ChaCaM(Gen Bank登录号:KY211037),其开放阅读框为450 bp,编码149个氨基酸,分子量16.8476 kD。生物信息学分析表明,ChaCaM为酸性稳定蛋白,属于疏水性蛋白,无跨膜域和信号肽存在,主要定位于细胞质基质中,存在糖基化和磷酸化位点。序列分析表明,ChaCaM包含两个EFh结构域,与其他物种的CaM高度相似。系统进化树表明,ChaCaM与烟草、可可和萝卜等的CaM亲缘关系极近,聚类在同一分支下。基因表达分析表明,ChaCaM在平欧杂种榛不同组织中的表达具有差异,且在自交不亲和授粉后的雌蕊中具有明显的表达量变化。ChaCaM具有典型的钙调蛋白基因特征,主要定位于细胞质基质中;表现为组成型表达,推测其参与了榛属植物的自交不亲和反应。(本文来源于《园艺学报》期刊2018年07期）
李杰,许国绿,沈和定,顾冰宁,杨铁柱[6]（2018）在《石磺钙调蛋白Os-IP_3R和Os-RyR基因的克隆、相对表达量及进化关系》一文中研究指出为明确石磺钙通道蛋白1,4,5-叁磷酸肌醇受体(IP3R)基因和蓝尼碱受体(RyR)基因的序列和结构信息,初步研究不同石磺中的Onchidium struma-IP3R/Onchidium struma-RyR(Os-IP3R/Os-RyR)基因表达量百分比与石磺系统进化的相关性,实验在瘤背石磺表皮转录组数据库的基础上,克隆得到2条钙通道蛋白基因Os-IP3R和Os-RyR,利用生物信息学技术对该基因及所编码蛋白的结构特征进行分析,并通过qRT-PCR技术分析2个基因在瘤背石磺、平疣桑椹石磺和紫色疣石磺各组织中的表达情况。结果显示,Os-IP3R核酸序列为4 574 bp,包括2 808 bp的开放阅读框,共编码935个氨基酸,预测编码的蛋白有6个跨膜区;Os-RyR核酸序列为1 253 bp,包括1 131 bp的开放阅读框,共编码376个氨基酸,预测编码的蛋白有3个跨膜区。将瘤背石磺IP3R和RyR的氨基酸序列进行比对,发现位于钙离子通道区的G*R*GGG*GD序列处高度保守;发现3种石磺Os-IP3R/Os-RyR的相对表达百分比的高低顺序与各石磺从陆地到浅海的梯度分布趋势相一致,依次为瘤背石磺>平疣桑椹石磺>紫色疣石磺;石磺的陆栖性越强,则Os-IP3R/Os-RyR的相对表达百分比越高。不同种石磺的Os-IP3R/Os-RyR表达量百分比的研究能为分析海洋无脊椎动物由海洋向陆地进化学说提供新的分子生物学线索。(本文来源于《水产学报》期刊2018年12期）
赵良渊,侯晓敏,秦小江[7]（2018）在《慢病毒介导转染Adra1d基因shRNA对大鼠主动脉血管平滑肌细胞钙离子和钙调蛋白的影响》一文中研究指出目的:探讨慢病毒介导转染α1D-肾上腺素能受体(Adra1d)基因shRNA对大鼠主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)中Ca~(2+)浓度及钙调蛋白(Ca M)表达的影响。方法:Adra1d基因shRNA与GV248载体拼接得到重组载体,经包装质粒共转染293T细胞,包装病毒,收集病毒原液,超速离心浓缩,并测定滴度得到重组慢病毒载体。用得到的重组慢病毒载体转染大鼠VSMCs,通过RT-q PCR和Western blot鉴定干扰效果,然后激光共聚焦检测VSMCs内Ca~(2+)浓度变化,RT-q PCR和Western blot法检测VSMCs Ca M的mRNA和蛋白表达。结果:慢病毒载体构建成功;收集得到293T细胞分泌的病毒上清,测定病毒的滴度为3×1011TU/L。转染后大鼠主动脉VSMCs的Adra1d mRNA和蛋白表达量均显着下调。慢病毒Lv-shRNA4-Adr对目的基因Adra1d的干扰效率大于85%;Adra1d基因被靶向沉默后,与scrambled组相比,大鼠主动脉VSMCs的Ca~(2+)荧光强度显着升高,而且Ca M的mRNA和蛋白表达量也显着增加。结论:慢病毒介导转染Adra1d基因shRNA可显着增加大鼠主动脉VSMCs中Ca~(2+)浓度和Ca M表达。(本文来源于《中国病理生理杂志》期刊2018年07期）
张茜[8]（2017）在《磷酸化钙调蛋白转录因子在番茄花柄脱落过程中的表达及SR2L转基因分析》一文中研究指出植物器官脱落是指植物体的某一部分脱离母体的过程,作为自然界普遍发生的现象,是植物对环境适应的重要手段之一。而在作物生产过程中,非正常的脱落过程,如果菜类蔬菜等花、果器官的脱落则是影响作物产量的重要因素。目前对脱落过程的调控机制仍不十分清楚。蛋白质磷酸化是一种翻译后的修饰方式,在植物的生长发育过程中起着重要作用,且在植物器官脱落过程中发挥着重要调控作用。本论文在前期番茄花柄脱落过程中磷酸化蛋白鉴定的基础上,选择了钙调蛋白转录因子家族作为研究对象,分析不同钙调蛋白转录因子在脱落中的表达水平,并选取与脱落过程密切相关的钙调蛋白转录因子,构建转基因体系,为明确其在脱落过程中的调控作用奠定基础。论文的主要研究结果如下:(1)以离体番茄花柄为试材,通过乙烯、1-MCP、Ca~(2+)、EGTA处理,调查了花柄脱落率,并对SR1L、SR2、SR2L、SR3、SR3L、SR4在不同时间表达量变化进行分析。结果表明,只有SR2L在基因水平变化不明显。结合本课题组前期乙烯处理下不同花柄脱落时间离区的磷酸化肽分析结果,其磷酸化水平差异显着,但翻译和转录水平均变化不明显,即SR2L的磷酸化作用与脱落过程密切相关。所以,从中选取磷酸化钙调转录因子SR2L来对脱落过程中的磷酸化蛋白进行研究。(2)通过TA克隆载体pMD18-T的介导,将SR2L和SR2LSS914A基因与质粒相连,构建了启动子为CaMV35S的表达载体pB7YWG2-SR2L,pB7YWG2-SR2LS914A。采用农杆菌介导法对番茄子叶进行侵染,经过筛选获得抗性幼苗。本次实验共获得TO代植转PB7YWG2-SR2L基因的阳性植株3株,转pB7YWG2-SR2L S914A基因的阳性植株4株。TO代转化率分别为2.9%,4.1%。(3)选择515nm的激发波长,对得到的植株根部进行激光共聚焦检测。结果发现,与野生型"中蔬六号番茄"相比,转基因植株的侧根分生区细胞核区域中出现明显的黄色荧光信号。所以将钙调转录因子SR2L定位在番茄表皮的细胞核中。分别对TO以及T1代植株PCR检测、进行qRT-PCR检测、激光共聚焦检测,表明目的基因已经成功整合到番茄基因组中,并在转录水平上得到了鉴定。(4)通过结合磷酸酶抑制剂处理对番茄离体花柄外植体脱落的影响以及对T1代转pB7YWG2-SR2LS914A植株脱落情况。本试验得出两个推测:经过激光共聚焦试验将SR2L定位于细胞核内,SR2L有可能是在细胞核内与EIN2结合,发生了去磷酸化的作用,从而调控EIN3的应答;SR2L也可能直接与EIN3的启动子区域结合来参与乙烯调控的脱落反应。(本文来源于《沈阳农业大学》期刊2017-06-01）
梁梦月[9]（2017）在《背俞指针疗法对GERD大鼠任督二脉穴位皮温及钙调蛋白基因表达的影响》一文中研究指出目的:本文拟在通过分析背俞指针疗法干预GERD大鼠任督二脉局部的皮温治疗前后变化特点和探索钙调蛋白在胃窦Cajal间质细胞内的表达情况,从中医学和医学分子生物学角度了解该病的病因病机及治疗机制,为今后该病的临床诊治提供相应的参考。方法:按照完全随机法将120只SD大鼠分为空白、模型组、对照组、治疗组进行比较,每组30只。采用贲门钢圈固定法制作GERD大鼠模型,空白组和模型组不实施干预治疗,治疗组连续14天予以实施背俞指针治疗,对照组连续14天予以兰索拉唑肠溶片联合莫沙必利分散片灌胃治疗。于治疗前及治疗结束后的的第1天、第7天及第14天应用红外热成像仪检测GERD大鼠的任督二脉穴位均温皮温变化。实验结束后,取胃中部距贲门1/3处的胃窦运动起搏区组织,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法检测GERD大鼠胃窦部Cajal间质细胞中CaM基因表达情况。结果:1.任督二脉各穴位红外皮温检测结果治疗第1天,模型组、对照组、治疗组与空白组相比,大椎穴、至阳穴、命门穴、膻中穴皮温明显降低(p<0.05),中脘穴、关元穴皮温明显升高(p<0.05)。治疗第7天,模型组与治疗组、空白组相比,大椎穴、至阳穴、命门穴、膻中穴、中脘穴、关元穴皮温明显降低(p<0.05)。与对照组相比,大椎穴、至阳穴、膻中穴、中脘穴、关元穴明显降低(p<0.05),命门穴无明显降低(p>0.05)。治疗第14天,模型组与对照组、治疗组相比,大椎穴、至阳穴、命门穴、膻中穴、中脘穴、关元穴皮温明显降低(p<0.05)。与空白组相比,命门穴、膻中穴明显降低(p<0.05)。大椎穴、至阳穴、中脘穴、关元无明显降低(p>0.05)。2.任督二脉红外热均温检测结果治疗第1天,模型组、对照组、治疗组较空白组相比,任脉均温明显升高(p<0.05),督脉均温明显下降(p<0.05)。治疗第7天,模型组与治疗组相比,任脉均温、督脉均温明显降低(p<0.05),与空白组、对照组相比,任脉均温、督脉均温无明显差异(p>0.05)。治疗第14天,模型组与对照组、治疗组相比,任脉均温、督脉均温明显降低(p<0.05),与空白组相比,任脉均温、督脉均温无明显差异。3.胃窦Cajal间质细胞钙调蛋白基因表达结果模型组大鼠胃窦Cajal间质细胞的CaM基因表达下调(p>0.05),使用西药和背俞指针治疗后可使CaM基因表达上调(p<0.05),且治疗组的CaM基因表达要显着高于对照组(p<0.05)。结论:1.任督二脉穴位皮温的变化与胃食管反流病的发病相关。GERD大鼠的任督二脉穴位皮温较正常大鼠的皮温低,而使用背俞指针治疗后能够提高任督二脉的皮温。背俞指针治疗胃食管反流病有效机制可能是通过改善任督二脉经气来实现。2.GERD大鼠胃窦Cajal间质细胞钙调蛋白表达下降可能是胃食管反流病的发病机制之一。3.背俞指针治疗对GERD的治疗作用很可能是通过上调胃窦Cajal间质细胞钙调蛋白的基因表达,促进胃窦起搏区运动来实现。(本文来源于《广西中医药大学》期刊2017-06-01）
唐利[10]（2017）在《ATP2B1基因沉默经Ca~(2+)/钙调蛋白信号通路促进Akt激活增加HUVEC胰岛素敏感性的实验研究》一文中研究指出目的:研究ATP2B1基因沉默对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)胰岛素敏感性的影响,并探讨所涉及的基础机制,寻找增强内皮细胞胰岛素敏感性的方法,为临床上治疗胰岛素抗抵患者的新药研发提供部分理论支持,降低胰岛素抵抗患者发生心血管疾病的风险。方法:将对数生长期的HUVEC细胞用0.25%胰蛋白酶消化计数后按0.5×10 6cells/孔的密度接种在6孔板中,采用riboFECTTMCP转染试剂盒分别将阴性SiRNA(Si-Neg)和ATP2B1基因沉默特异性SiRNA(Si-ATP2B1)转染到HUVEC细胞中,转染浓度均为100nM。此后,实验分叁个部分进行干预和指标检测。第一部分,转染48h后,收集细胞,用Western Blot检测HUVEC细胞内质膜钙离子ATP酶-1(Plasma Membrane Calcium ATPase-1,PMCA1)蛋白表达水平、Fluo-3 AM钙离子荧光探针法测定HUVEC细胞内Ca~(2+)浓度。第二部分,转染32h后,血清饥饿培养过夜(16h),分别用以下不同的干预方式处理细胞:1、不加任何干预;2、用100nM胰岛素刺激30min;3、用10μM钙螯合剂BAPTA-AM预处理90min,再加入100nM胰岛素刺激30min;4、用500nM钙离子载体A23187处理30min。四种不同的干预方式处理完成后,Western Blot检测HUVEC细胞内丝/苏氨酸激酶(serine-threonine kinase,Akt)及其磷酸化蛋白phospho-Akt(Ser473)(p-Akt)的表达水平。第叁部分,转染32h后,血清饥饿培养过夜(16h),分别采用以下不同干预措施并进行指标检测:1、用30μM特异性钙调蛋白拮抗剂w7预处理30min,再加入100nm胰岛素刺激30min,干预完成后,westernblot检测huvec细胞内p-akt及akt的蛋白表达水平;2、用100nm胰岛素刺激30min,收集细胞,免疫共沉淀法检测与钙调蛋白相关的akt的水平。结果:1、atp2b1基因沉默后huvec细胞内pmca1蛋白表达情况:与阴性si-neg转染细胞比较,si-atp2b1转染细胞中pmca1蛋白表达明显降低(p<0.05)。2、atp2b1基因沉默后huvec细胞内ca2+浓度变化:与阴性si-neg转染细胞比较,si-atp2b1转染细胞中ca2+浓度明显升高(p<0.05)。3、胰岛素对转染细胞中p-akt及akt蛋白的影响:与各自没有用胰岛素刺激的转染细胞比较,100nm胰岛素刺激后,si-neg与si-atp2b1转染细胞中p-akt/akt的比值都明显升高(p<0.05),胰岛素可以诱导huvec内皮细胞akt磷酸化。与100nm胰岛素刺激的si-neg转染细胞比较,100nm胰岛素刺激的si-atp2b1转染细胞中p-akt/akt比值明显升高(p<0.05),atp2b1基因沉默对胰岛素诱导的akt磷酸化具有促进作用,能增加内皮细胞胰岛素敏感性。4、钙螯合剂bapta-am对转染细胞中p-akt及akt蛋白的影响:与没有用钙螯合剂bapta-am预处理的si-atp2b1转染细胞比较,bapta-am预处理的si-atp2b1转染细胞中p-akt/akt的比值明显下降(p<0.05),atp2b1基因沉默依赖于细胞内升高的ca2+浓度促进akt磷酸化来增加内皮细胞胰岛素敏感性。5、钙离子转运体a23187可将细胞外ca2+转运到细胞内,与各自没有用a23187处理的转染细胞比较,a23187处理后,si-neg与si-atp2b1转染细胞中p-akt/akt的比值都明显升高(p<0.05),a23187表现出与胰岛素同样的诱导huvec内皮细胞akt磷酸化的作用。与用a23187处理的si-neg转染细胞比较,用a23187处理的si-atp2b1转染细胞中p-akt/Akt的比值明显升高(P<0.05),ATP2B1基因沉默通过细胞内升高的Ca~(2+)浓度促进Akt磷酸化来增加内皮细胞胰岛素敏感性。6、特异性钙调蛋白拮抗剂W7对转染细胞中p-Akt及Akt蛋白的影响:与没有用W7预处理的Si-ATP2B1转染细胞比较,用W7预处理的Si-ATP2B1转染细胞中p-Akt/Akt比值明显降低(P<0.05),ATP2B1基因沉默促进Akt磷酸化来增加内皮细胞胰岛素敏感性的过程可以通过钙调蛋白介导。7、免疫共沉淀结果显示,与Si-Neg转染细胞比较,Si-ATP2B1转染细胞中与钙调蛋白结合的Akt的水平明显升高(P<0.05),ATP2B1基因沉默经由钙调蛋白对Akt磷酸化产生影响。结论:ATP2B1基因沉默可以增加HUVEC内皮细胞的胰岛素敏感性,这可能是通过Ca~(2+)/钙调蛋白信号通路促进Akt磷酸化途径介导产生的。(本文来源于《西南医科大学》期刊2017-05-01）
钙调蛋白基因论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
该研究根据半夏转录组数据,克隆获得2条半夏钙调蛋白基因,分别命名为Pt Ca M1和Pt Ca M2。生物信息学分析表明,Pt Ca M1,Pt Ca M2基因的完整开放阅读框均为450 bp,编码149个氨基酸,两者编码区序列一致性为80%,氨基酸序列一致性为91%,且均含有EF-hand结构域,属于Ca M家族。采用实时荧光定量PCR分析Pt Ca Ms在不同组织和不同处理中的表达模式,结果表明Pt Ca M1,Pt Ca M2基因均在块茎中表达量最高;外源Ca Cl2处理后Pt Ca Ms的表达量与对照相比显着升高,钙离子鳌合剂EGTA、钙离子通道抑制剂La Cl3以及钙调蛋白拮抗剂TFP处理后其表达量逐渐降低。该研究从半夏中成功克隆得到Pt Ca Ms基因,为深入探索Pt Ca Ms基因功能特点和半夏生物碱合成的研究奠定基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
钙调蛋白基因论文参考文献
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