颜兴和[1]2004年在《提高华根霉Rhizopus Chinensis脂肪酶酶促催化酯合成能力的研究》文中研究说明华根霉脂肪酶在有机相中催化酯合成转化率较高,具有较好的工业化应用潜力。本论文为进一步提高华根霉脂肪酶的工业化应用,对华根霉脂肪酶酶促催化酯合成能力进行研究,包括:建立测定脂肪酶有机相合成酶活方法;以合成酶活为指标,通过诱变育种和培养基优化进一步提高华根霉脂肪酶合成酶活;提高华根霉脂肪酶催化合成己酸乙酯的底物浓度及优化反应条件。实验确定了测定脂肪酶有机相合成酶活的方法。在40℃下,脂肪酶催化己酸(0.6mol/L)与乙醇(0.6mol/L)在正庚烷中进行酯合成反应,通过滴定法测定剩余的己酸,1个脂肪酶有机相合成酶活单位定义为:在测定条件下每分钟消耗1μmol己酸的酶量。测定7种不同来源微生物脂肪酶有机相合成酶活,测定结果相对误差较小,表明该测定法具有较好的准确性。通过比较7种微生物脂肪酶的有机相合成酶活、水相水解酶活及在正庚烷中催化己酸乙酯合成的能力,证明了:合成酶活与水解酶活相关性不高,合成酶活比水解酶活更能反映脂肪酶的合成能力。因此,合成酶活对脂肪酶在有机相中催化酯合成的研究与应用具有指导作用。以合成酶活为指标,对华根霉Y92产脂肪酶进行诱变育种和培养基优化。经诱变获得诱变菌2113,合成酶活比出发菌提高了29.6%。经培养基优化后,诱变菌2113脂肪酶合成酶活比出发菌提高了534%。诱变菌2113脂肪酶合成酶活的较大提高导致催化合成己酸乙酯能力明显增强,反应15h的转化率达到90%以上,所需时间只为出发菌的15.6%。优化后的产酶培养基成分为:麦芽糖1%,蛋白胨4%,豆饼粉4%,橄榄油2%,七水合硫酸镁0.05%,磷酸氢二钾0.2%,起始pH5.5。摇瓶培养条件为:2.2～4.3×105个/30mL接种量、30mL装液量、150 r/min或200 r/min摇瓶转速。补加麦芽糖或橄榄油发酵,对合成酶活提高不大,但由于增加了菌体量,导致菌体总合成酶活的生产量增加。把不同培养时间的华根霉全细胞脂肪酶用于催化己酸乙酯合成,具有高合成酶活的全细胞脂肪酶催化己酸乙酯合成反应较快。可见,全细胞脂肪酶用于催化有机相酯合成反应时,具有高脂肪酶合成酶活的菌体具有较好的催化酯合成能力,具有较好的菌体品质。通过合成酶活的提高及反应条件的优化,提高了华根霉2113全细胞脂肪酶催化己酸乙酯合成的反应底物浓度,其反应条件为:己酸浓度为2.4mol/L;酸醇摩尔浓度比1:1.1;反应体系含水量≤0.2%;脂肪酶水活度0.3～0.66;加酶量16%(g/v);反应温度30℃;150r/min振荡反应。反应最终转化率可接近90%。在酯合成反应中,添加干燥剂可降低生成水含量,提高反应转化率,最终达到92.5%。
朱增亮[2]2012年在《基于形态工程的华根霉膜结合脂肪酶液态发酵调控研究》文中指出华根霉（Rhizopus chinensis CCTCC M201021）膜结合脂肪酶（mb-RCL）具有较强的非水相催化合成活性，在生物香料、生物柴油等领域具有较好的应用前景。本论文通过对华根霉菌体形态与其mb-RCL合成活性关系及其影响因素的研究，结合华根霉脂肪酶mb-RCL液态发酵的生物学特性和要求，进行发酵罐装置改进和冷模特性的研究，通过“形态工程”提高该脂肪酶发酵水平，并在“无溶剂”反应体系中进行应用，该研究对于丰富我国脂肪酶的新品种和丝状真菌发酵的相关理论研究都有积极的意义和价值。主要研究结果如下：（1）针对丝状真菌液态发酵困难的问题，在7L搅拌式发酵罐中进行华根霉脂肪酶mb-RCL放大生产研究。结果表明在发酵罐中华根霉菌丝体呈现两种生长形态，即在挡板、电极、搅拌桨等处呈聚集态和在发酵液中呈游离态，并且呈聚集态的菌丝体表现出较高合成酶活。SDS-PAGE及Western Blot分析表明华根霉菌体呈聚集生长有利于具合成活性的膜结合脂肪酶的表达及在细胞膜上积累。（2）采用饥饿胁迫策略考察华根霉脂肪酶的液态发酵。摇瓶水平研究结果显示营养饥饿胁迫对于菌体生长及单位菌体酶活无积极作用，但厌氧胁迫可提高单位菌体酶活18.8%。发酵罐水平研究结果表明厌氧胁迫易引起华根霉菌体形态发生变化，致使mb-RCL发酵水平降低。（3）改进发酵罐装置和条件优化提高华根霉脂肪酶mb-RCL液态发酵水平。基于华根霉液态发酵生物学特性和要求对搅拌式发酵罐装置进行改进，以及发酵罐冷模特性研究，提出较优操作参数。最终使得华根霉脂肪酶mb-RCL单位菌体酶活达到324.78U/g，菌体干重量达到19.08g/L，发酵单位体积总活力达到6196.88U/L，橄榄油利用率100%，发酵水平提高了5.5倍。（4）以华根霉mb-RCL为催化剂，在“无溶剂”反应体系中催化己酸乙酯的合成。以产物己酸乙酯为“溶剂”，底物（乙醇及己酸）浓度为3.56mol/L，反应温度为37℃，摇床转速为200r/min，反应3天时补加mb-RCL，己酸乙酯转化率可达到77%。
王栋[3]2008年在《华根霉（Rhizopus chinensis）非水相合成活性脂肪酶及其酶学特性的研究》文中提出根霉脂肪酶在微生物脂肪酶酶学研究和非水相生物催化中占有重要地位。由于脂肪酶存在广泛的多样性和复杂性,在脂肪酶的基础理论研究和实际应用中仍存在着许多问题,对这些问题的认识和理解仍需要大量的研究积累,以此不断丰富和发展脂肪酶学,并指导和拓展其在工业上的应用。丝状真菌华根霉(Rhizopus chinensis CCTCCM201021)菌体结合脂肪酶具有良好的催化非水相酯化反应的能力和工业应用潜力。本论文主要针对该华根霉非水相合成活性脂肪酶(sRCL)在生产和应用实践中出现的问题,根据其特点和应用目的,采用针对性的表征脂肪酶非水相催化酯合成能力的分析方法,通过对影响该脂肪酶发酵的关键因素研究,在发酵制备一定数量目的脂肪酶的基础上,利用有机溶剂处理等方法修饰提高其非水相合成活性,分离纯化目的蛋白并对其酶学性质和催化特性进行考察,在细胞水平和蛋白质水平进行了较为系统的研究,得到了一些新的发现。(1)影响菌体结合sRCL生产的关键因素研究首先为便于发酵过程控制,降低下游处理难度,以可溶性氮源蛋白胨替代工业应用的固态氮源豆饼粉,结果使菌体结合sRCL发酵水平成倍提高。研究表明豆饼粉等固态可发酵性组分的添加可能使华根霉以类似固态发酵条件下的代谢方式进行生长和代谢及形态分化,从而影响了菌体结合sRCL的产生。各种油脂及其相关物质对该脂肪酶发酵也有较大影响,适当浓度的油酸及其相关物质可直接作为有效的碳源和诱导物。在培养基主要组成中,蛋白胨和天然产物橄榄油是该脂肪酶发酵生产的最佳氮源和碳源底物。研究也发现华根霉液态培养中菌体表观形态对菌体结合sRCL的发酵有重要影响,表面光滑紧密的大菌团虽然菌体生长较慢,却有利于菌体结合sRCL的生产,可作为根据菌体表观形态判断sRCL生产水平的一个表观指征。(2)培养基组成含量及培养条件优化提高菌体结合sRCL的生产为进一步提高sRCL的生产水平,获得一定数量的目的脂肪酶用于后续研究,对发酵培养基各主要成分含量和部分发酵条件进行了考察和优化。在单因素研究的基础上,先后利用正交试验和响应面分析方法对该脂肪酶发酵培养基组成进行了优化。分别以脂肪酶合成活性和脂肪酶产率为指标,得到了优化的培养基组成为:蛋白胨分别为57.94和55.58g/L,橄榄油21.94和22.99g/L,麦芽糖12.91和14.34g/L,K_2HPO_4 2g/L,MgSO_4·7H_2O 0.5g/L,起始pH 6.0。在优化条件下,脂肪酶合成活性和脂肪酶产率分别提高了61.5%和93.4%。同时得到了较为准确的脂肪酶生产的相关数学模型。该脂肪酶在摇床水平的最适发酵温度为30℃,200 r/min的摇床转速不仅可以得到较高的脂肪酶合成活性,并且使脂肪酶最佳发酵时间缩短约12小时。由于通常使用的发酵罐、特别是机械搅拌发酵罐培养方式限制了特定表观菌体形态的形成,该脂肪酶的发酵罐生产水平较低。(3)sRCL在华根霉细胞上的定位及其有机溶剂处理的影响为了对菌体结合sRCL进行深入研究,首先对其在菌体细胞上的位置进行了确定。利用真菌破壁酶Yatalase处理和去污剂提取分析,该脂肪酶被定位为膜结合蛋白。Yatalase处理可破坏菌体细胞壁结构,增加底物与酶的接触,从而提高该膜结合sRCL的活性。发酵得到的sRCL利用一些有机溶剂处理合成活性也得到了改善,其中异辛烷处理使脂肪酶合成活性增强最为显着。丙酮处理也可显着提高单位质量脂肪酶活性,但回收率降低,可用于该脂肪酶的“浓缩”或“纯化”。通过电镜观察,异辛烷等适当的有机溶剂处理与Yatalase处理作用相似,可使菌体表面结构发生改变,使膜结合sRCL更多地暴露,从而提高该膜结合sRCL的合成活性。对有机溶剂处理条件的研究表明,异辛烷4℃下处理1小时增强膜结合sRCL合成活性的效果最好,脂肪酶合成活性可提高56%,而活性回收率也提高26%。将其应用于催化庚烷中己酸乙酯的合成,催化效果确实得到了提高。利用这种处理方法,异辛烷和丙酮都可以制备用于非水相催化的“干”的脂肪酶制剂,而异辛烷处理更有利于提高该膜结合sRCL非水相中的合成活性。(4)膜结合sRCL的分离纯化及其分子特性研究进一步对该膜结合sRCL进行分离纯化,以便深入至蛋白质水平进行研究。采用常用的去污剂洗脱对膜结合蛋白进行分离提取,以含1.5%去污剂Triton X-100的缓冲液洗脱4小时,可以得到较好的提取效果,但进一步的纯化却相当困难。考察该脂肪酶粗酶提取液的性质发现,该膜结合sRCL对温度和pH都较为敏感,稳定性较差。而且该脂肪酶具有很强的疏水性,Triton X-100对维持其溶解性有重要作用,利用Bio-Beads SM-2树脂吸附去除Triton X-100易引起脂肪酶的聚集沉淀。普通的纯化方法对该膜结合脂肪酶的纯化有较大困难。根据有机溶剂处理的研究结果,丙酮处理可以“纯化”该膜结合sRCL,并使菌体结构破坏。利用缓冲液对其进行充分洗涤,能够去除大量杂蛋白,再经Triton X-100溶液提取,有可能提高该膜结合蛋白的纯化效率。采用上述纯化策略,确实得到了相当纯的目的蛋白,纯化倍数提高接近17倍。进一步通过超滤浓缩和阴离子交换层析,使目的蛋白sRCL得到了纯化。利用此纯化方法,可以简便而快速地纯化得到膜结合sRCL。纯化的膜结合sRCL分子量约为32 kDa,其蛋白N-末端氨基酸序列为SDSCEVVQ,Blast分析未发现与其同源性较高的已报道脂肪酶。该蛋白等电点约在4.5左右,为一个酸性蛋白。Triton X-100的存在对该脂肪酶分子大小、电荷性等表观分子特性有较大影响。(5)纯化的sRCL酶学性质和催化特性研究分别以脂肪酶合成活性和水解活性为表征,对纯化的膜结合sRCL酶学性质进行考察。结果表明:温度、pH、各种化合物等环境因素对该脂肪酶合成活性和水解活性的影响差异较大。sRCL合成活性主要受阴离子的影响,而金属离子则明显影响其水解活性。其中,Cl~-强烈抑制该脂肪酶合成活性,而磷酸根离子则对该活性有一定的提升。Zn~(2+)显着提高了该脂肪酶的水解活性,但Fe~(2+)和Fe~(3+),特别是Hg~(2+),却强烈抑制这一活性。研究表明该脂肪酶不是金属酶,二硫键在维持其活性构象中的作用也不大,该脂肪酶合成活性中心可能含有Ser。该脂肪酶催化有机相酯化反应,以乙醇为酰基受体时辛酸是最适的底物,对碳链长度大于8的中长链脂肪酸也有较高的催化酯合成的能力。以辛酸为酰基供体,脂肪醇底物特异性最好的是正丁醇;除了甲醇,该脂肪酶对碳链长度小于10的脂肪醇都有较高的合成活性。该脂肪酶的水解活性对月桂酸酯(C_(12))的脂肪酸链长特异性最高,对中长链的脂肪酸酯也具有较高的水解活性。该脂肪酶不表现出对叁甘酯的位置选择性。这些性质表明,膜结合sRCL是一种通常意义上的真正脂肪酶,但与一般的根霉脂肪酶有较大差异,结合其分子特性可以认为是一种新型脂肪酶。对纯化的sRCL有机相催化特性进行研究,结果表明,该脂肪酶对丙酮和非极性烷烃类有机溶剂(3.5＜Log P＜5.1)有较好的耐受性。与菌体结合脂肪酶相比有机溶剂处理基本没有增强纯化的sRCL合成活性,这一结果进一步证实,有机溶剂处理对菌体结合脂肪酶活性的影响主要是由于菌体结构的改变。同样,sRCL在非极性溶剂(Log P＞3.5)介质中的合成活性也相对较高,其中庚烷是该脂肪酶的最适反应介质。此外,有机相反应体系中初始水活度对该脂肪酶催化活性影响不大。以上结果表明,该膜结合sRCL比较适合非水相催化酯合成反应的应用。对近来发现的去污剂Triton X-100和叁甘酯及其水解产物等对脂肪酶活性的调节进行了探讨。结果表明,上述活性调节因子对该脂肪酶活性的调节机制可能相当复杂,现有的脂肪酶催化机制尚需完善。
单天宇, 王栋, 徐岩, 何军邀[4]2008年在《华根霉菌丝体结合脂肪酶催化酯合成动力学拆分2-辛醇》文中提出研究了华根霉CCTCC M201021菌丝体结合脂肪酶(RCL)在非水相中催化酯合成动力学拆分外消旋2-辛醇的能力.发现RCL对该反应具有较好的光学选择性(E>100),辛酸和异辛烷分别是最佳的酰基供体和反应溶剂,体系水活度的减少对反应的光学选择性没有明显影响,但能显着提高反应初速度.在相同转化率下,通过添加3A分子筛降低体系水含量可使反应初始速度提高7.3倍.当底物浓度提高到0.230 mol/L,反应40 h时转化率达44.4%,产物酯的ee值为94.7%.与叁种商品化脂肪酶进行了比较,发现在相同条件下RCL对2-辛醇的拆分不但具有较好的光学选择性(E=103.1),而且也表现出较高的反应初速度和转化率.
李飏[5]2008年在《华根霉（Rhizopus chinensis）前导肽和成熟肽脂肪酶在E.coli中的克隆表达和酶学性质研究》文中研究表明根霉脂肪酶是一类典型的微生物脂肪酶,其独特的催化特性使其在脂肪酶理论研究和实际应用中都占有重要地位。华根霉脂肪酶(Rhizopus chinensis lipase, RCL)在酯类物质的合成、生物柴油和手性化合物的制备等重要工业实践中表现出良好的应用价值。对华根霉脂肪酶进行克隆表达以及酶学性质研究,为进一步开展华根霉脂肪酶的理论和应用研究提供了一定基础。为了较全面的认识华根霉脂肪酶,准确表达不同脂肪酶的基因片段,指导其工业应用,本文从华根霉(Rhizopus chinensis CCTCCM201021)基因组中PCR扩增出前导肽脂肪酶基因(proRCL)和成熟肽脂肪酶基因(mRCL)并将其克隆到原核表达载体pET-28a中,构建了重组表达质粒,并在E.coli BL21中实现了具有活性的表达,表达产物SDS-PAGE分析表明,表达的前导肽脂肪酶分子量约43 kD,成熟肽脂肪酶分子量约33 kD,与预期分子量相同。优化表达条件,能获得活性相对较高的重组蛋白。收集菌体,超声破碎上清液经镍离子亲和层析,纯化得到目的蛋白。对重组ProRCL和MRCL主要酶学性质进行了研究,发现ProRCL和MRCL最适反应温度相同,为35℃,最适反应pH相近,分别为8.0和8.5。两重组脂肪酶水解底物的脂肪酸链长特异性差别不大,均对短链的脂肪酸酯水解活力较高,分类学上更接近于酯酶。但底物动力学常数有差异,分别以长链的对硝基苯酚棕榈酸酯和短链的对硝基苯酚丙酸酯为底物,ProRCL和MRCL的Km值说明两脂肪酶对对硝基苯酚丙酸酯的结合能力明显高于对硝基苯酚棕榈酸酯,其Kcat值也说明短链的对硝基苯酚丙酸酯为较适底物。10 mmol/L的Mg2+对两重组脂肪酶有较好的激活作用,而Hg2+、SDS和PMSF强烈抑制其活力。与米根霉脂肪酶(ROL)不同,研究结果表明,前导序列对华根霉脂肪酶的主要酶学特性没有显着影响。
贺芹[6]2008年在《华根霉全细胞脂肪酶催化制备生物柴油》文中认为生物柴油(长链脂肪酸单酯)是一种以动植物油脂为原料生产的可再生的绿色燃料。与传统的化学法相比较,生物酶法生产生物柴油以反应条件温和、醇用量小、产物易于分离、无污染物排放等优点成为国内外研究的热点,但是生物酶的价格昂贵、甲醇在油脂中的溶解度小,以及对酶产生毒害作用等技术问题限制了该方法的使用。本论文针对以上问题较系统地研究了全细胞脂肪酶无溶剂系统中催化油脂制备生物柴油的技术。主要结果如下:1)通过比较5种不同商品化脂肪酶和自制的华根霉全细胞脂肪酶催化油脂制备生物柴油的结果后表明:华根霉CCTCC M201021全细胞脂肪酶能有效应用于无溶剂体系催化合成脂肪酸甲酯。初步解决了酶法生产生物柴油的催化剂成本太高的瓶颈。对该酶催化大豆油脂合成脂肪酸甲酯的条件进行系统地研究,结果表明:以大豆油脂为底物,反应所需甲醇分3次等量加入、总醇油摩尔比3:1、体系水含量2.0%、反应温度30℃、加酶量8%,生物柴油最终最高得率可达86%以上。以log P值为指标选择不同有机溶剂作为助溶剂进行转酯化反应,发现正庚烷等log P值为4~4.5的有机溶剂转化效果最好。无溶剂体系相比于有机溶剂体系最终转化效果相差不大,具有更好的应用前景。2)对华根霉CCTCC M201021全细胞脂肪酶催化脂肪酸乙酯合成的研究表明:华根霉全细胞脂肪酶催化大豆油脂的转乙酯化效果较转甲酯化效果要好一些,最终得率可达88%。但是由于甲醇对酶蛋白的毒害作用要远大于乙醇的毒害作用,反应条件相同程度的改变对于甲酯的影响更为剧烈。3)考察了无溶剂体系华根霉CCTCC M201021全细胞脂肪酶对不同的底物油脂以及游离脂肪酸的作用效果:该酶在无溶剂体系下具有较好的催化油酸酯合成的能力,进一步研究发现该酶可以较好地催化模拟高酸油脂的能力,并且酸价越高,效果越好。而对于含有杂质的地沟油等酸价油,转化率也可以达到80%以上。对于麻疯籽油等近年来比较热门的用于合成生物柴油的非可食用性油脂,其转化率达到88%以上,同时该酶对多种植物油脂都具有很好的转化效果,这表明:该酶具有催化不同油脂原料合成生物柴油的能力,对原料的要求低,从而扩大了原料的来源,初步解决了生物柴油生产工业化中原料成本高的难题。4)对所得的生物柴油粗产品进行分离、精制得到产品。减压蒸馏条件:真空度5 mmHg,油浴温度250℃,蒸馏约12h,脂肪酸甲酯回收率达到90%。通过外观、主要成份的气相色谱分析以及性能指标的检测,表明分离后的产品明显优于粗产品。生物柴油成品各主要性能指标优于国家0#柴油(GB 252-2000)的主要性能指标,基本达到了中国生物柴油标准(BD100)和德国生物柴油的标准(DIN V51606),同时对华根霉全细胞脂肪酶催化制备生物柴油的成本进行了初步核算,表明该方法具有一定的应用可行性。本研究就开辟生物柴油生产的新途径、降低生物柴油的生产成本等内容进行了有益的探索。
王楠[7]2009年在《非水相体系中华根霉脂肪酶催化合成香茅酯的研究》文中提出香茅酯作为萜醇脂肪酸酯类化合物是重要的香料成分且具有巨大的应用价值,不仅用于食品还广泛用于配置各种香水、化妆品等。与传统的化学法相比,生物酶法催化合成香茅酯具有反应条件温和、选择性高、副反应少和环境污染小等优点,不仅具有较为重要的学术价值,而且还具有较好的实际应用价值。本研究确定华根霉菌丝结合脂肪酶RCL (lipase from Rhizopus chinensis)为合成香茅酯的生产用酶,根据不同链长脂肪酸制定不同的反应体系,并对香茅酯产品进行了提取制备。通过对不同脂肪酶无溶剂体系催化合成己酸香茅酯的效果的比较,发现RCL无溶剂体系中对己酸香茅酯具有较好的催化效果。研究进一步确定了RCL的制备条件和无溶剂体系催化合成己酸香茅酯的最适条件:40 U/ml酶加量、摇床转速200 r/min、温度40℃、醇酸比为1.25:1。为了进一步有效提高RCL合成己酸香茅酯的催化效率,并减少后提取过程中由于醇酸比过大带来的问题。在等摩尔醇酸比时进一步对体系疏水性及含水量进行调查。经过对反应过程中水含量跟踪调查发现水含量为反应关键性因素。对不同除水体系进行研究,确定了在外部除水体系中水含量得到有效控制,同时转化率有了进一步提高。在此反应装置中,戊酸及长链脂肪酸与香茅醇在RCL催化下也得到了接近100%的转化率。由于短链酸对RCL的抑制作用,在合成乙酸香茅酯时采用有机相反应体系进行研究。确定最佳反应体系为“记忆”pH 6~7、有机介质庚烷、摇床转速200 r/min、温度40℃为了进一步考察RCL工业化应用前景,使下一阶段产物的提取分离更有效率,实验对底物浓度,以及RCL催化乙酸香茅酯的批次稳定性进行了研究,在第8个批次仍有较高的转化率,说明RCL催化短链香茅酯具有较好的工业应用前景。同时针对两种反应产物沸点的差异,采用减压蒸馏较好地将有机相庚烷和乙酸香茅酯进行分离并确定了最终的分离流程。本研究证明RCL在非水相体系中合成香茅酯具有高效的催化能力,并找到了非水相体系中提高RCL催化催化效率的关键因素,对后续工业生产放大具有一定的价值。
王睿, 喻晓蔚, 沙冲, 徐岩[8]2009年在《定向进化-易错PCR方法提高华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的活力》文中研究说明运用定向进化-易错PCR的方法,提高了华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的活力。经过两轮易错PCR和pNPP顶层琼脂法筛选,从第一轮和第二轮突变库中分别筛选获得最佳突变株1-11和2-28,脂肪酶酶活与野生菌株相比分别提高2倍和4倍。基因比对结果表明,突变脂肪酶2-28有4个氨基酸发生了突变:A129S、K161R、A230T、K322R。蛋白质分子空间结构模拟显示,突变A129S、K161R、A230T位于脂肪酶分子表面。突变A230T增强了α-螺旋盖结构的稳定性。突变K322R处在loop上,靠近脂肪酶底物结合区域,与邻近的Asp(带负电)形成盐桥。静电引力将该loop向底物进入酶活性中心的通道口反方向牵引,使底物分子更易进入酶活性中心。酶学性质研究表明,突变株2-28脂肪酶的Km值比出发菌株下降了10%,Kcat值提高为原来的2.75倍。
王乐乐[9]2008年在《华根霉（Rhizopus chinensis）脂肪酶的基因克隆、表达，纯化和酶学性质研究》文中研究说明生物催化在工业应用的过程中,一个很大的限制因素就是催化剂脂肪酶。自然条件下,菌株产脂肪酶量较低,利用常规育种方法难以满足工业化生产的需要。本论文从华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCCM201021中首次克隆得到其脂肪酶全基因,并实现了华根霉脂肪酶前导肽和成熟肽在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的高水平分泌表达,初步分离纯化后对比了两重组脂肪酶的酶学性质差异,为华根霉脂肪酶的进一步理论研究及其应用奠定了基础。主要研究结果包括:(1)以实验室保藏菌种华根霉基因组为模板,利用根霉通用引物PCR扩增得到华根霉18S rDNA片段,鉴定其种属。根据Rhizopus stolonifer和Rhizopus oryzae脂肪酶基因序列比对后设计调取华根霉脂肪酶基因的引物,利用两次PCR程序分别获得华根霉脂肪酶上、下游片段,拼接后得到华根霉脂肪酶全基因(RCL)。该基因的开放阅读框长1170 bp,不含内含子,编码一个389个氨基酸残基的蛋白质。包括26个氨基酸的信号肽,94个氨基酸的前导序列和269个氨基酸的成熟肽,其推断的氨基酸序列与一些已报道的根霉脂肪酶序列同源性为86%。(2)构建酵母分泌型表达重组质粒pPIC9k-proRCL和pPIC9k-mRCL,将重组表达质粒线性化后电转化巴斯德毕赤酵母。构建了GS115/pPIC9k-proRCL用于分泌表达前导肽脂肪酶,表型包括His+Muts和His+Mut+;构建了GS115/pPIC9k-mRCL用于分泌表达成熟肽脂肪酶,表型包括His+Muts和His+Mut+。SDS-PAGE分析表达的慢生型前肽脂肪酶的分子量为37 kD左右,最大分泌表达量为0.85 mg/mL,占分泌蛋白总量的68.3%, pNPP法测得此时的脂肪酶水解活力为121.2 U/mL;表达的慢生型成熟肽脂肪酶的分子量为30 kD左右,最大分泌表达量为0.16 mg/mL,占分泌蛋白总量的21.6%,pNPP法测得此时的脂肪酶水解活力为4.3 U/mL。(3)将重组巴斯德毕赤酵母GS115/pPIC9k-proRCL Muts和GS115/pPIC9k-mRCL Muts发酵上清液经过10 KD超滤膜浓缩,SP-Sepharose FF强阳离子交换层析和Phenyl-Sepharose 6 FF疏水色谱柱层析后得到脂肪酶活性组分proRCL和mRCL。纯化后的重组蛋白proRCL N-端氨基酸测序分析表明该重组脂肪酶是加工过的产物,分泌表达的重组脂肪酶只保留了前导序列C-端的27个氨基酸和成熟肽的269个氨基酸,简称pro27RCL。酵母菌GS115/pPIC9k-pro27RCL和GS115/pPIC9k-mRCL的表达上清液在用Endo H处理前与处理后其蛋白分子量没有发生变化,表明该酵母表达的重组脂肪酶都未进行N端糖基化修饰。(4)通过对重组脂肪酶pro27RCL和mRCL的酶学性质研究,发现pro27RCL和mRCL的最适反应pH和最适反应温度相近,最适pH值分别为8.5和8.0,最适反应温度分别为40℃和35℃。但底物选择性和动力学常数差异较大。pro27RCL对C6-C8中链脂肪酸酯水解活力较高,而mRCL对pNPC2的水解活力最高,对C2-C6的短链脂肪酸酯水解活力较高,分类学上更倾向于酯酶(Esterase E.C.3.1.1.2)。两脂肪酶对对硝基苯酚棕榈酸酯的Km和Vmax分别为0.304 mmol/L、0.345 mmol/L和3.38μmol/min/mL、0.074μmol/min/mL。pro27RCL和mRCL对叁油酸甘油酯均没有位置选择性。10 mmol/L的Ca~(2+)、Mg~(2+)对两重组脂肪酶均有较好的激活作用,而Hg~(2+)、SDS和PMSF强烈抑制两酶的活力。它们在正己烷、正庚烷和异辛烷(30% v/v)中具有较高的活力和良好的稳定性。
朱珊珊[10]2012年在《华根霉（Rhizopus chinensis）脂肪酶底物特异性的定向改造》文中研究指明华根霉(Rhizopus chinensis CCTCC M201021)作为一种典型的根霉属丝状真菌,不仅是传统酿造工业中的重要功能微生物,在现代发酵工业中也是许多工业用品和酶制剂的重要生产菌株。前期研究已经实现了华根霉脂肪酶基因(proRCL)(GenBank Accession No. EF405962)在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的高水平分泌表达。本文在保留毕赤酵母诱导型启动子(AOX)两端同源重组序列的基础上插入组成型表达启动子(GAP),实现毕赤酵母组成型表达华根霉脂肪酶的作用。同时结合橄榄油罗丹明B平板,建立高通量的平板筛选法。选定脂肪酶盖子区域,运用半理性设计和理性设计的手段获得了一系列的活性和底物特异性改变的突变株,系统研究了盖子结构对脂肪酶活性和底物特异性的影响。具体内容包括:(1)运用PCR技术从pGAPZαA表达载体上扩增得到GAP启动子片段,插入到表达载体pPIC9K-proRCL中,构建组成型表达载体pGAPK-proRCL。在保留含有同源双交换重组序列的诱导型启动子AOX1序列的基础上,电转化后华根霉脂肪酶基因proRCL表达盒在毕赤酵母基因组上发生双交换整合事件,从而组成型表达单拷贝的华根霉脂肪酶基因。重组菌发酵144 h后,脂肪酶最高酶活为130 U/mL。(2)利用橄榄油罗丹明B平板建立高通量筛选组成型表达华根霉脂肪酶基因的有效方法。该方法将初筛时间从12 d缩短为3 d,排除了多拷贝突变株的干扰,为后续脂肪酶的定向进化及筛选奠定了基础。(3)根据半理性设计思路,选定proRCL盖子结构域上连续10个氨基酸位点,利用重迭延伸PCR技术引入区域选择性突变,获得一系列酶活和底物特异性改变的突变酶。(4)根据理性设计思路,利用重迭延伸PCR技术将proRCLS4-3的盖子结构替换成米根霉脂肪酶(Rhizopus oryzae lipase,ROL),米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei lipase,RML)和黑曲霉阿魏酸酯酶(Aspergillus niger Feruloyl esterase,ANE)的盖子结构。获得突变酶proRCLS4-3O,proRCLS4-3M,proRCLS4-3N。(5)纯化后酶学性质与初始脂肪酶proRCLS4-3相比较,proRCLS4-3O对C12的特异性最高,kcat值几乎不变,km值增大一倍,甘油叁酯酶和磷脂酶活力均有下降,热稳定性减弱。结合软件分析结果表明,Met213通过改变疏水通道口的大小直接影响酶与底物亲和力的大小, Thr216的作用则是通过与His229,Ala230的相互作用固定开盖构型。而突变Asn216使构象的不稳定性增加,最终导致突变脂肪酶的热稳定性减弱。(6) proRCLS4-3M对C8脂肪酸的特异性最高。kcat值增大5.6倍,km值几乎不变,同时甘油叁酯酶活提高51%,蛋白质分子空间结构模拟显示GRAVY值升高一倍,说明盖子疏水性升高导致其与疏水性的底物的亲和力增加。同时底物与催化中心距离的缩短表明底物与催化中心的接触更紧密,kcat值增大。突变Ala209Trp引起底物进入酶活性中心通道的变窄,导致突变酶和中长链的pNPC8的结合更加紧密,特异性改变。(7) proRCLS4-3N对短链C2的特异性最高,kcat/km由2.80 mM-1s-1明显下降为0.05mM-1s-1。甘油叁酯酶活力与磷脂酶活力急剧下降。GRAVY值由原来的0.200下降为-1.086说明疏水性盖子替换成亲水性的盖子,破坏了催化中心的疏水环境,底物的催化效率降低,kcat值减小。N端糖基化位点使保持开盖构型,但盖子打开距离缩短,疏水性底物亲和性降低,底物特异性向短链脂肪酸靠近。
参考文献：
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[5]. 华根霉（Rhizopus chinensis）前导肽和成熟肽脂肪酶在E.coli中的克隆表达和酶学性质研究[D]. 李飏. 江南大学. 2008
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[8]. 定向进化-易错PCR方法提高华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的活力[J]. 王睿, 喻晓蔚, 沙冲, 徐岩. 生物工程学报. 2009
[9]. 华根霉（Rhizopus chinensis）脂肪酶的基因克隆、表达，纯化和酶学性质研究[D]. 王乐乐. 江南大学. 2008
[10]. 华根霉（Rhizopus chinensis）脂肪酶底物特异性的定向改造[D]. 朱珊珊. 江南大学. 2012
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