导读:本文包含了蛋白内含肽论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:内含肽,Zbasic标签,白细胞介素15,可溶性表达
蛋白内含肽论文文献综述
史斯玮[1]（2017）在《内含肽介导的药用重组蛋白可溶性表达纯化系统建立及应用》一文中研究指出背景:大肠杆菌作为药用重组蛋白表达系统,成本低,周期短,是最常用的表达系统之一。然而大部分药用重组蛋白在大肠杆菌系统中表达易形成包涵体,需经过繁琐的变性、复性过程得到有生物学活性的产品,增加生产工艺复杂度及生产成本。因此,实现可溶性表达及纯化对提高大肠杆菌系统的应用水平具有关键作用。本研究中,我们以大肠杆菌系统中极易形成包涵体的重组人白细胞介素-15(Recombinant human interleukin 15,rhIL-15)为例,探讨内含肽介导的药用重组蛋白可溶性表达纯化系统建立及应用。rhIL-15可有效调节体内淋巴细胞效应,维持CTLL细胞增殖,调节B细胞、NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)功能,诱导IFN-γ、TNF-α及免疫球蛋白的分泌,具有显着的抗肿瘤活性。然而,现阶段rhIL-15大规模表达与纯化仍面临挑战。临床上使用rhIL-15主要由原核系统以包涵体形式表达,通过变性复性过程纯化所得。变性复性不仅增加纯化步骤,增大生产过程中的经济及时间成本,并且变性过程存在疏水区过度暴露的风险,蛋白空间结构改变可能导致最终产物活力较低。因此我们建立新型可溶性表达纯化体系,对原有生产工艺进行优化,实现rhIL-15可溶性表达及高效纯化。实验方法:在本研究中,我们筛选了多个可溶性标签与拥有C端自剪切功能的内含肽(Intein)ΔI-CM组合,实现rhIL-15在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化。最终获得可溶性标签组合Zbasic-ΔI-CM。该新型标签组合与rhIL-15融合表达可以显着提升rhIL-15的可溶性和表达量。融合蛋白“Zbasic-ΔI-CM-IL-15”利用Zbasic部分的超碱性能够通过离子交换实现高效纯化。通过pH和温度等条件的优化诱导ΔI-CM实现自剪切,释放出的rhIL-15通过进一步疏水及离子交换层析等步骤获得终产物。结果分析:标签组合“Zbasic-ΔI-CM”能够在pH6.0,25℃的条件下实现高效自剪切,剪切活化能为7.48 kcal/mol。所释放的rhIL-15 N端无多余甲硫氨酸。将纯化所得rhIL-15进行ExRP-HPLC和UPLC-MS鉴定,纯度达到92%,分子量12769.5 Da,符合预期。rhIL-15生物学活性可通过CTLL-2细胞增殖实验验证,内含肽系统表达纯化所得rhIL-15生物学活性EC_(50)达到0.12 ng/mL。这种方法有效避免了大肠杆菌系统表达药用重组蛋白的包涵体变性复性的复杂过程,实现rhIL-15高效生产,有广泛的应用前景。(本文来源于《上海交通大学》期刊2017-01-01）
李春雨[2]（2015）在《利用Split-Intein内含肽介导蛋白功能恢复创建双组分雄性不育系的研究》一文中研究指出目前,尽管通过基因工程手段已经实现了植物细胞核不育,但得到的不育系与相应保持系杂交后仅能得到50%的不育株,其余50%的可育株需要去除。如何获得不育率为100%的核不育系是目前雄性不育研究的重点。为实现上述目的,本研究将毒蛋白基因Barnase和草甘膦抗性基因G2-EPSPS分拆为无活性的N端和C端两个片段并分别与Ssp DnaE内含肽和Npu DnaE内含肽的N端和C端融合,分别构建pCABarESN、pCABarESC、pCABarSNZESN、pCABarSCZESC植物表达载体以及pCABarESP、pCABarABn两个对照载体。分别将其导入芥菜和甘蓝植株,研究利用Split-Intein内含肽介导分拆蛋白结构和功能重建实现100%雄性不育的可行性。获得的主要研究结果如下：1、芥菜中实现了Npu DnaE内含肽介导split-EPSPS基因功能重建利用农杆菌介导法,将pCABarESN、pCABarESC载体以及对照载体pCABarESP分别转化芥菜,获得相应的转基因芥菜植株。经PCR, RT-PCR分析结果显示ESN, ESC, G2-EPSPS基因已转入芥菜植株并表达。PPT抗性筛选结果显示,部分pCABarESN、pCABarESC转基因植株中的ESN, ESC基因为多个位点插入芥菜基因组。草甘膦抗性筛选结果表明,仅表达G2-EPSPS基因N端和C端片段的pCABarESN、pCABarESC转基因芥菜植株不具有草甘膦抗性,表达G2-EPSPS基因完整序列的pCABarESP转基因芥菜植株具有草甘膦抗性。而pCABarESN、pCABarESC转基因芥菜植株杂交后代因Npu DnaE内含肽的介导的G2-EPSPS蛋白结构和功能重建,植物具有草甘膦抗性。2、获得了芥菜双组分雄性不育亲本植株将pCABarSNZESN、pCABarSCZESC植物表达载体转入芥菜植株,获得具有PPT抗性的芥菜植株双组分雄性不育亲本植株,经PCR检测目的基因已整合到芥菜基因组中。3、获得了转基因雄性不育甘蓝植株BcA9驱动下的核糖核酸酶Barnase基因植物表达载体pCABarABn,通过农杆菌介导的下胚轴转化导入甘蓝材料‘TF’,获得具有除草剂Basta抗性的甘蓝转基因植株。细胞学观察显示,转基因甘蓝植株的花药因绒毡层细胞提前降解,花粉母细胞退化,成熟花药中无正常花粉粒产生。相对非转基因对照,转基因甘蓝植株花器官变小,花瓣褶皱多,柱头弯曲,雄蕊瘦小等现象。另外,转基因植株在温度低于22℃时出现明显的死蕾现象,当温度高于25℃时,死蕾现象得到缓解。田间结实情况调查显示,转基因甘蓝植株自交不能结实,与野生型杂交可结实但种荚变短。4、获得了甘蓝双组分雄性不育亲本植株将pCABarSNZESN、pCABarSCZESC植物表达载体转入甘蓝植株,获得具有PPT抗性的甘蓝双组分雄性不育亲本植株,经PCR检测目的基因已整合到甘蓝基因组中,RT-PCR分析结果显示,ESN、ESC基因在pCABarSNZESN、 pCABarSCZESC转基因甘蓝叶片中正常表达；SN, SC基因在pCABarSNZESN、 pCABarSCZESC转基因甘蓝花蕾中正常表达。(本文来源于《西南大学》期刊2015-05-20）
刘文俊,吴倩,高慧,徐碧,张鑫宇[3]（2014）在《类弹性蛋白和内含肽融合表达纯化重组人防御素3》一文中研究指出为建立简单、经济的重组人β防御素3(HBD3)制备方法,将HBD3序列插入类弹性蛋白(ELP)与△I-CM内含肽融合表达载体,将重组载体转化大肠杆菌,20℃下用IPTG诱导融合蛋白表达,在优化条件下进行相变循环,用内含肽自裂解活性释放目的蛋白,用琼脂扩散和最小抑菌浓度法测定重组HBD3抗菌活性。结果表明:融合蛋白在重组菌中获得可溶性表达,第1轮相变循环的纯度为85.7%,再次相变循化的纯度达93.1%;内含肽裂解温度为28℃,孵育12 h裂解效率达90.3%;重组HBD3回收率达74.8%,产量为0.98 mg·L~(-1),纯度为92.6%,内毒素含量低于0.03 U·mg~(-1)(蛋白),对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有显着的抑菌活性。说明基于ELP相变循化和内含肽自裂解的重组蛋白表达与纯化系统可用于重组}tBD3的规模化制备。(本文来源于《扬州大学学报(农业与生命科学版)》期刊2014年04期）
伍锦花,蔡双凤,刘海龙,侯靖,韩静[4]（2014）在《基于PHA颗粒-PhaP标签和内含肽元件的极端嗜盐古菌蛋白的表达纯化系统》一文中研究指出【目的】建立一个基于PHA颗粒-PhaP标签的简便实用的极端嗜盐古菌蛋白表达纯化系统,并探讨嗜盐古菌内含肽在该系统优化中的应用。【方法】以嗜盐古菌-大肠杆菌穿梭载体pWL502为基本骨架,构建带有嗜盐古菌强启动子和PhaP融合标签的表达载体;在地中海富盐菌phaP缺陷株(ΔphaP)中融合表达目的基因,通过蔗糖密度梯度离心分离纯化结合于PHA颗粒上的PhaP融合蛋白;在phaP基因与多克隆位点之间引入特定的嗜盐古菌内含肽元件,尝试通过定点突变改变该内含肽的剪切活性。【结果】成功构建了以PhaP作为N端融合标签的表达载体pPM以及作为C端融合标签的载体pIP;在phaP基因簇强启动子控制下,二者均实现了目标蛋白的高效表达;通过PHA颗粒介导的蛋白分离纯化策略,实现了以PhaP为融合标签的目标蛋白的分离纯化;发现内含肽序列Hbt21在地中海富盐菌中保持了高效的剪接活性,通过定点突变其C端末位氨基酸天冬酰胺(N182)及邻位的丝氨酸(S183)失活了该内含肽的C端剪接活性。【结论】首次建立了一个基于PHA颗粒-PhaP标签的简便节约的极端嗜盐古菌蛋白表达纯化系统,并确定了嗜盐古菌型内含肽C端剪接的活性位点,为该内含肽将来应用于PhaP融合蛋白的标签去除奠定了基础。(本文来源于《微生物学报》期刊2014年09期）
王安平,朱善元,吴双,王永娟,左伟勇[5]（2014）在《内含肽-弹性蛋白介导的人溶菌酶在毕赤酵母中的表达》一文中研究指出将人溶菌酶、内含肽、弹性蛋白3个基因串联插入巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC-MIELYZ,经Pme I酶切线性化后电转化毕赤酵母GS115,经G418筛选阳性克隆,并用甲醇诱导表达,以探讨内含肽-弹性蛋白介导的人溶菌酶在毕赤酵母中的表达情况。结果表明:SDS-PAGE和Western blot证实表达的融合蛋白分子量正确,抑菌试验表明融合蛋白对微球菌具有良好的抑菌效果。说明融合基因在毕赤酵母中成功表达,为后继的纯化工作及新型毕赤酵母表达载体的构建奠定基础。(本文来源于《扬州大学学报(农业与生命科学版)》期刊2014年01期）
刘文俊,张鑫宇,夏晓莉,孙怀昌[6]（2013）在《类弹性蛋白和Mxe内含肽介导的非洲猪瘟病毒重组蛋白K205R的表达与纯化》一文中研究指出为了构建Mxe内含肽(mxe intein,MI)和类弹性蛋白(elastin-like peptide,ELP)介导的重组蛋白表达与纯化系统,将PCR扩增的MI序列和限制性内切酶切取的ELP序列插入原核表达载体pET-30a,获得融合表达载体pET-MIE;将PCR扩增的非洲猪瘟病毒(ASFV)K205R基因插入pET-MIE载体,获得重组载体pET-K205R-MIE;分别将pET-MIE和pET-K205R-MIE转化大肠杆菌,对其重组蛋白表达、逆向相变循环沉淀及MI自体裂解条件进行优化。结果显示,在20℃条件下K205R-MIE融合蛋白为可溶性表达,26℃条件下逆向相变循环沉淀融合蛋白的回收率达73.2%,26℃孵育4h的裂解效率达91.4%,K205R蛋白的回收率为51.3%,纯度高达92.2%,能被ASFV免疫血清识别。结果提示,成功构建了简单、经济的重组蛋白表达与纯化系统,制备的K205R抗原可用于ASFV诊断。(本文来源于《中国兽医科学》期刊2013年10期）
石磊,唐莉莉,马兴元,王天文,马飞[7]（2013）在《利用类弹性蛋白可逆相变和内含肽自切割功能高效制备TmSm抗肿瘤蛋白》一文中研究指出目标蛋白TmSm是研发出的一种能够较强抑制肿瘤细胞生长和促进其凋亡的基因工程抗肿瘤蛋白,其由介导目的蛋白进入细胞的转导肽HIV-TAT突变体(Tm)和Survivin突变体(Sm)融合而成。原先的TmSm制备工艺以包涵体表达、变性和复性为主,其过程不仅复杂、收率低成本高,而且所得蛋白活性较低。通过将TmSm基因与编码类弹性蛋白(elastin-like polypeptides,ELPs)和内含肽(intein)的标签序列(EI)进行融合,利用ELPs的可逆相变特性和intein的自切割功能,经简单的温度及pH调控,获得了纯度为99.00%的TmSm蛋白。将纯化后的蛋白作用于肺癌细胞A549,24 h后MTT结果显示,63.21μg/ml的目的蛋白对A549的抑制率为57.83%;流式细胞仪检测结果表明,当TmSm浓度为40μg/ml时,24 h后细胞凋亡率为41.72%。因此,这种新型的以类弹性蛋白和内含肽介导的表达纯化技术不仅成本低廉,而且对抗肿瘤蛋白药物的质量提高具有重要应用价值。(本文来源于《中国生物工程杂志》期刊2013年10期）
崔子寅,王艺萌,唐博,孙旭燕,高明春[8]（2012）在《内含肽和麦芽糖结合蛋白介导具有抗病毒活性牛α干扰素的表达》一文中研究指出为了在大肠杆菌表达系统中高效表达具有抗病毒活性的重组牛α干扰素(BoIFN-α)蛋白,在BoIFN-α基因的上游无缝连接内含肽Ssp DnaB intein(SDI)序列,然后克隆至pMAL-c2X载体中,构建含有内含肽和麦芽糖结合蛋白基因的表达载体pMAL-SDI-BoIFN-α,将重组载体转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞,IPTG诱导表达。结果表明,融合基因获得高效表达,且产物主要以可溶形式存在。经直链淀粉树脂纯化后可得到纯度较高的目的蛋白。经MDBK-BVDV(牛病毒性腹泻病毒)干扰素活性系统检测,证实干扰素融合蛋白具有抗病毒活性。(本文来源于《中国兽医科学》期刊2012年05期）
孙路路[9]（2012）在《内含肽介导被拆分的Barnase毒蛋白功能重建》一文中研究指出内含肽(Intein)是存在于蛋白翻译产物(前体蛋白)阅读框架内的一段氨基酸序列,在前体蛋白转变为成熟蛋白的过程中,通过反式剪接,内含肽被剪切释放出来,游离于成熟蛋白之外,而内含肽两侧的外蛋白子(外显肽)通过肽键连接成成熟的天然肽。该过程不需要特定的细胞环境以及辅助因子的参与,甚至可以在体外进行。内含肽因其独特的剪接功能在蛋白质工程、基因诊断和治疗、转基因植物研究等领域有着广阔的应用前景。来自解淀粉芽胞杆菌的Barnase蛋白属于细胞毒蛋白,广泛用于植物雄性不育、无籽果实、植物抗病性提高等方面的研究。研究表明,内含肽介导的蛋白剪接过程中,内含肽类型、内含肽与外显肽(extein)剪接位点的氨基酸序列变化对剪接效率影响很大。因此,本研究选用两种天然断裂型内含肽Ssp DnaE和Npu DnaE,以Barnase细胞毒蛋白为拆分对象,研究不同内含肽之间、杂合内含肽以及拆分位点处氨基酸变化对反式剪接效率的影响,从而为上述内含肽在Barnase蛋白以及其他功能蛋白的拆分以及功能重建方面的研究提供参考。本研究将Bamase蛋白拆分为N端和C端外显肽(拆分处氨基酸不同)并分别与Ssp DnaE和Npu DnaE断裂型内含肽的N端和C端融合构建融合基因。N端和C端融合基因之间组成不同的组合(16个组合),分别从原核细胞、原核蛋白表达、真核细胞表达叁个方面对其反式剪接效率进行了研究。获得的主要研究结果如下：1.利用原核细胞共表达分析了内含肽介导的反式剪接功能将Ssp DnaE内含肽基因、Npu DnaE内含肽基因N端和C端分别与分拆后的Bamase蛋白N端和C端连接,获得了四对基因：SN基因和SC基因、SNG基因和SCG基因、SNZ基因和SCZ基因、NN基因和NC基因(融合基因均为本实验室按甘蓝密码子偏好性合成保存)。将所有N端融合基因插入原核表达载体pETDuet-1,获得抗氨苄青霉素的表达载体；所有的C端融合基因插入原核表达载体pACYCDuet-1,获得抗氯霉素的表达载体。然后将N端融合基因表达载体与C端融合基因表达载体组成不同的组合(共计16种组合)共转化大肠杆菌BL21,通过大肠杆菌菌落的生长检测内含肽能否成功介导分拆后的Barnase毒蛋白反式剪接。双抗性平板(Amp+Cm)共转化结果分为叁种：(1)无菌落生长。包括NN+NC、 NN+SC、NN+SCG叁个组合。(2)平板上能长双抗菌落,但菌落中质粒表现不稳定。这类组合又分为两类,一类是平板能长少量菌落,但质粒不稳定,包括SN+NC和SNZ+NC两个组合；一类是平板能长大量菌落,但质粒不稳定,包括SNG+NC、 SN+SCZ、SNG+SCZ、SNZ+SCZ、NN+SCZ五个组合。(3)平板上能长大量双抗菌落,且菌落中的质粒表现稳定。包括SN+SC、SNG+SC、SNZ+SC、SN+SCG、 SNG+SCG、SNZ+SCG六个组合。原核细胞表达的结果表明Npu DnaE内含肽本身能介导分拆后的Barnase蛋白高效剪接,同时Npu DnaE内含肽的N端与Ssp DnaE内含肽C端之间也能高效剪接；Ssp DnaE内含肽的剪接效率低,N端内含肽和C端内含肽均为Ssp DnaE内含肽时不能实现有效剪接。C端外显肽第一个氨基酸为Ser或Cys对Npu DnaE内含肽的N端剪接效率无影响；C端融合基因外显肽第一个氨基酸为Cys,对Ssp DnaE内含肽剪接效率的提高有帮助；添加源自于Ssp DnaE内含肽原始外显肽氨基酸残基KFAEY和CFNKS有利于剪接反应的发生但该添加对NN基因的剪接效率有影响。2.在蛋白质水平验证内含肽介导的被拆分的Bamase毒蛋白N端和C端的反式剪接将Barnase蛋白N端第11位氨基酸由Ala突变成为Gly, Barnase蛋白C端第102位的His突变为Arg,使突变后的Bamase蛋白失去了毒性功能,便于在大肠杆菌中表达。将N端融合基因(Bamase N+intein N)和C端融合基因(intein C+Barnase C)组成不同组合插入pETDuet-1的不同表达框之间获得蛋白共表达载体,转入大肠杆菌中表达,SDS-PAGE电泳分析蛋白大小和剪接情况。结果表明：(1)N端和C端蛋白能表达且能反式剪接并有目标蛋白Bamase的生成,包括pETNNm-NCm、pETNNm-SCGm、pETNNm-SCZm、 pETSNZm-SCZm、pETSNm-SCZm五个双基因表达载体,与原核细胞表达结果相一致。(2)N端和C端蛋白能表达但未有目标蛋白Bamase的生成,包括pETSNm-SCm、pETSNm-SCGm、pETSNGm-SCGm、pETSNGm-SCm、 pETSNGm-SCZm pETSNZm-SCm、pETSNZm-SCGm、pETSNm-NCm、 pETSNGm-NCm, pETSNZm-NCm十个双基因表达载体,部分载体因剪接效率低下或两端蛋白表达不平衡,其蛋白表达与原核细胞表达结果不完全一致。(3)N端或C端蛋白缺少表达,pETNNm-SCm双基因表达载体属于此类,与原核细胞表达结果不一致,原因有待进一步研究。蛋白表达结果验证了原核细胞表达得到的结论,尤其是肯定了添加源自于SspDnaE内含肽原始C端外显肽氨基酸残基(CFNKS)有利于提高剪接效率3.在真核水平研究内含肽介导的被拆分的Barnase毒蛋白的N端和C端的功能重建结合原核表达和蛋白表达的结果,选择具有代表性的SN+SCG、SNZ+SCG、 NN+NC、NN+SCG四个组合构建了相应的植物表达载体PCABarSN/SCG、 PCABarSNZ/SCG、PCABarNN/NC、PCABarNN/SCG。载体中的N端融合基因和C端融合基因均在A9绒毡层启动子的驱动下表达。利用农杆菌介导法将其转入芥菜品种“渝丰榨菜”中,结果显示四个载体转化后获得的转基因植株均表现出明显的雄性不育,说明四个载体中的N端融合基因和C端融合基因在芥菜花药绒毡层表达后,内含肽均介导N端融合蛋白和C端融合蛋白的反式剪接,得到重组的Barnase蛋白,造成花药内细胞程序性死亡,花粉败育。其中的PCABarNN/NC、PCABarNN/SCG转基因植株出现花粉败育现象与原核细胞共表达和原核蛋白表达检测结果一致。而PCABarSN/SCG、 PCABarSNZ/SCG转基因植株也表现为雄性不育,与原核细胞共表达和原核蛋白表达检测结果不一致,出现该结果的原因估计是所用融合基因均参照甘蓝密码子使用偏好性设计的,在植物细胞中高表达后,对应内含肽组合即使只有较低的反式效率,但其生成的Barnase毒蛋白也足以导致绒毡层细胞凋亡而导致雄性不育的产生。(本文来源于《西南大学》期刊2012-04-30）
叶丙雨,王政,李德彬,张乐之,肖丽霞[10]（2012）在《环式增强型绿色荧光蛋白热稳定性及Npu DnaE内含肽高反式剪接效率研究》一文中研究指出目的在体内借助Npu DnaE内含肽(intein)的高效反式剪接作用获得环式增强型绿色荧光蛋白(Cyc-EGFP)。方法对构建的融合表达载体pET/Npu DnaE intein/EGFP-28a(+)进行诱导、表达,之后利用亲和纯化获得高纯度的Cyc-EGFP和增强型绿色荧光蛋白(EGFP),并对二者的荧光强度和热稳定性进行比较。结果 NpuDnaE内含肽环化效率可达98%以上,明显优于Ssp DnaE内含肽,环化后的EGFP热稳定性提高了4～5℃。结论 Cyc-EGFP这一明显优势使蛋白环化在蛋白质工程等领域具有重要的应用价值。(本文来源于《军事医学》期刊2012年04期）
蛋白内含肽论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目前,尽管通过基因工程手段已经实现了植物细胞核不育,但得到的不育系与相应保持系杂交后仅能得到50%的不育株,其余50%的可育株需要去除。如何获得不育率为100%的核不育系是目前雄性不育研究的重点。为实现上述目的,本研究将毒蛋白基因Barnase和草甘膦抗性基因G2-EPSPS分拆为无活性的N端和C端两个片段并分别与Ssp DnaE内含肽和Npu DnaE内含肽的N端和C端融合,分别构建pCABarESN、pCABarESC、pCABarSNZESN、pCABarSCZESC植物表达载体以及pCABarESP、pCABarABn两个对照载体。分别将其导入芥菜和甘蓝植株,研究利用Split-Intein内含肽介导分拆蛋白结构和功能重建实现100%雄性不育的可行性。获得的主要研究结果如下：1、芥菜中实现了Npu DnaE内含肽介导split-EPSPS基因功能重建利用农杆菌介导法,将pCABarESN、pCABarESC载体以及对照载体pCABarESP分别转化芥菜,获得相应的转基因芥菜植株。经PCR, RT-PCR分析结果显示ESN, ESC, G2-EPSPS基因已转入芥菜植株并表达。PPT抗性筛选结果显示,部分pCABarESN、pCABarESC转基因植株中的ESN, ESC基因为多个位点插入芥菜基因组。草甘膦抗性筛选结果表明,仅表达G2-EPSPS基因N端和C端片段的pCABarESN、pCABarESC转基因芥菜植株不具有草甘膦抗性,表达G2-EPSPS基因完整序列的pCABarESP转基因芥菜植株具有草甘膦抗性。而pCABarESN、pCABarESC转基因芥菜植株杂交后代因Npu DnaE内含肽的介导的G2-EPSPS蛋白结构和功能重建,植物具有草甘膦抗性。2、获得了芥菜双组分雄性不育亲本植株将pCABarSNZESN、pCABarSCZESC植物表达载体转入芥菜植株,获得具有PPT抗性的芥菜植株双组分雄性不育亲本植株,经PCR检测目的基因已整合到芥菜基因组中。3、获得了转基因雄性不育甘蓝植株BcA9驱动下的核糖核酸酶Barnase基因植物表达载体pCABarABn,通过农杆菌介导的下胚轴转化导入甘蓝材料‘TF’,获得具有除草剂Basta抗性的甘蓝转基因植株。细胞学观察显示,转基因甘蓝植株的花药因绒毡层细胞提前降解,花粉母细胞退化,成熟花药中无正常花粉粒产生。相对非转基因对照,转基因甘蓝植株花器官变小,花瓣褶皱多,柱头弯曲,雄蕊瘦小等现象。另外,转基因植株在温度低于22℃时出现明显的死蕾现象,当温度高于25℃时,死蕾现象得到缓解。田间结实情况调查显示,转基因甘蓝植株自交不能结实,与野生型杂交可结实但种荚变短。4、获得了甘蓝双组分雄性不育亲本植株将pCABarSNZESN、pCABarSCZESC植物表达载体转入甘蓝植株,获得具有PPT抗性的甘蓝双组分雄性不育亲本植株,经PCR检测目的基因已整合到甘蓝基因组中,RT-PCR分析结果显示,ESN、ESC基因在pCABarSNZESN、 pCABarSCZESC转基因甘蓝叶片中正常表达；SN, SC基因在pCABarSNZESN、 pCABarSCZESC转基因甘蓝花蕾中正常表达。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
蛋白内含肽论文参考文献
[1].史斯玮.内含肽介导的药用重组蛋白可溶性表达纯化系统建立及应用[D].上海交通大学.2017
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