双香豆素化合物抗狂犬病病毒的效果及基于SQSTM1/P62抗病毒机制的初步探究

论文摘要

狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies virus,RABV）感染引起的一种高度致死性的人兽共患病。RABV主要侵害人和温血动物的脑部神经系统,并引起致死性脑脊髓炎。狂犬病分布范围广,主要发生在发展中国家,我国狂犬病死亡人数位列全球第二,仅次于印度。目前,预防狂犬病唯一有效的方法是在暴露前或暴露后接种疫苗,然而一旦出现临床症状,死亡率几乎为100%。因此,探寻狂犬病的有效救治药物,具有十分重要的意义。香豆素（Coumarin,CM）是一类重要的含苯骈α-吡喃酮结构的芳香氧杂环化合物,主要存在于芸香科、伞形科、木犀科等植物的根、茎、叶中,也存在于细菌和真菌的代谢物中。CM具有抗肿瘤、抗炎症、抗氧化和抗病毒等多种生物活性。其中,简单CM蛇床子素（osthole）可有效抑制乳腺癌、胃癌细胞的增殖和转移、侵袭;吡喃型CM-Calanolides A（从藤黄科红厚壳属植物Calophyllumlanigerum中分离得到）具有显著抗人类免疫缺陷病毒（HIV）的活性,并已成为抗HIV药物开发的热点先导物,在美国进入临床II期试验;双香豆素化合物（Biscoumarin,BCM）为CM的衍生物,能够有效抑制金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生长。但BCM是否具有抗RABV的作用,目前尚未有研究报道。本课题中使用的BCM是以4-羟基香豆素为原料,与无水乙醇一起加热溶解,并加入含有不同取代基的芳香醛类,经过一系列化学方法制备而成（文中将其标记为BCM-1～9）。本文研究旨在筛选具有抗RABV活性的BCM并探讨其分子作用机制。1.双香豆素化合物抑制狂犬病病毒增殖的效果研究首先,利用磺酰罗丹明B（Sulforhodamine B,SRB）比色法分别检测9种BCM对BHK-21细胞的毒性（半数细胞毒性浓度,CC50）,结果表明BCM-8和BCM-9在低浓度（2.5μM）时即能显著抑制BHK-21的细胞增殖（P<0.01）,因此弃用。随后,采用直接免疫荧光（Direct immunofluorescentassay,DFA）方法检测其余7种BCM对RABV的抑制率（半数细胞抑制效率,IC50）,并用选择指数（Selection Index,SI）来表示BCM抗RABV效果的安全范围,SI越大表明在安全浓度范围内抑制RABV感染复制的效果越好。试验结果证实BCM-3具有较好的抗RABV效果,其SI值最高（3.81）,CC50和IC50分别为12.38±3.56μ和 3.253±0.512 μM;进一步利用 DFA、Western-blot 及实时荧光定量 PCR（Quantitative real-time PCR,qRT-PCR）等方法,检测BCM-3抑制RABV感染复制的作用方式,以及BCM-3在感染不同时间点对病毒复制的影响,结果显示:5μMBCM-3可降低RABV标准攻击毒株（Challenge virus standard-11,CVS-11）的病毒滴度 40 倍（P<0.01）,并可抑制狂犬病病毒CVS-P基因的表达,下调达60.0%（P<0.01）,且在48h内均可显著抑制;另外,在病毒感染后3～12 h期间用药均能抑制RABV复制,其中在感染12 h时用药,可抑制病毒CVS-P蛋白表达达60%（P<0.01）,提示早期用药可能对抗RABV感染更有效。然而,BCM-3不能直接灭活RABV的复制,不能阻止RABV对BHK-21细胞的吸附,与阴性对照组和病毒感染未处理对照组相比,BCM-3处理组后病毒滴度水平和病毒CVS-P基因水平均无明显变化（P>0.05）。最后利用10 LD50的CVS-11细胞毒构建RABV感染小鼠模型,分组灌胃给药,观察BCM-3是否可以挽救病毒感染小鼠的存活率,结果显示:小鼠感染RABV后的临床症状为后肢跛行,体重减轻,用50 mg/kg BCM-3治疗感染小鼠,可将小鼠存活率由0%提高至12.5%,提示BCM-3在小鼠RABV感染模型上具有一定的治疗效果。2.双香豆素化合物调控SQSTM1/p62发挥抗狂犬病病毒作用的机制研究研究报道,自噬在病毒的免疫逃逸和复制增殖中均发挥着重要的作用。RABV可以通过诱导自噬来消除细胞凋亡,进而维持细胞稳态。但有文献报道RABV感染后可诱导不完全自噬,使内源性LC3表达上调,而自噬的重要底物SQSTMI/p62的变化不明显,且通过外源性转染改变SQSTMI/p62的表达在抗RABV中的作用仍不清楚。值得注意的是SQSTM1/p62还是一个具有多种功能的骨架蛋白,广泛参与多种信号通路。前期试验已证实BCM-3能有效抑制RABV复制,那么这种抑制是否与细胞自噬或SQSTM1/p62具有相关性呢?本课题紧接着开展以下研究。选用N2a细胞作为后续机制研究的细胞模型,通过Westem-blot检测自噬、凋亡相关蛋白,筛选与BCM-3抑制RABV复制有关的蛋白,实验研究发现BCM-3处理RABV感染的细胞24 h后,可诱导自噬底物SQSTM1/p62的表达水平上调50%左右（P<0.01）。Western-blot进一步证明经过BCM-3处理48h的病毒感染组,SQSTM1/p62蛋白表达水平显著上调,与此同时,病毒CVS-P蛋白表达水平下调40%（P<0.01）。因此,推测BCM-3可能通过阻断SQSTM1/p62依赖的细胞自噬来发挥抗RABV的作用。为进一步证实SQSTM1/p62在BCM-3抗RABV复制中的作用,成功构建SQSTMI/p62过表达质粒并转染N2a细胞,并用针对SQSTM1/p62基因的特异性siRNA转染N2a细胞,结果表明:过表达SQSTM1/p62可下调病毒CVS-P的mRNA水平达50%（P<0.01）,下调病毒CVS-P蛋白表达仅25%;利用特异性siRNA消减SQSTM1/p62的表达,病毒CVS-P mRNA水平可上调2.1倍（P<0.01）,上调病毒CVS-P蛋白水平仅为30%。提示BCM-3可能通过SQSTM1/p62依赖的途径来发挥其抗RABV的作用,但是BCM-3调控的SQSTM1/p62依赖的病毒复制与细胞自噬的相关性还有待进一步的探究。综上所述,本研究在体外筛选鉴定到一种新的可有效抑制抗RABV的香豆素化合物BCM-3,并初步证实该化合物可能通过上调SQSTM1/p62的表达来发挥其抗RABV的作用,期待此类结构的BCM研发为潜在的药物用于狂犬病的治疗。

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摘要

Abstract

符号说明

第一篇文献综述

1 狂犬病病毒的概述

2 狂犬病的概述

2.1 狂犬病国内外流行概况

2.2 狂犬病传播途径

2.3 狂犬病的潜伏期

3 狂犬病的预防

3.1 传统狂犬病疫苗的发展

3.2 新型狂犬病疫苗的研究进展

4 狂犬病的治疗方法

4.1 狂犬病的疫苗预防治疗

4.2 狂犬病的药物治疗

4.3 密尔沃基疗法（“Milwaukee疗法”）

5 香豆素化合物的简介

5.1 香豆素化合物的结构和分类

5.2 香豆素化合物的抗肿瘤作用及其作用机制

5.3 香豆素化合物抗菌作用及其作用机制

5.4 香豆素化合物的抗病毒作用及其作用机制

第二篇实验内容

第一章双香豆素化合物抑制狂犬病病毒增殖的效果研究

1 实验材料

1.1 主要试剂

1.2 主要仪器

1.3 药物、细胞、病毒及小鼠

1.4 数据处理软件及方法

2 实验方法

2.1 细胞的培养与传代

2.2 病毒的培养

2.3 CVS-11病毒滴度测定

2.4 SRB法测定BCM的细胞毒性

2.5 直接免疫荧光实验

2.6 实时荧光定量PCR检测

2.7 Western-blot实验

2.8 BCM-3灭活RABV的检测

2.9 BCM-3抑制RABV吸附感染的检测

2.10 BCM-3抑制RABV复制的检测

2.11 BCM-3不同作用形式抑制RABV的检测

2.12 RABV感染小鼠模型的构建及治疗

2.13 数据处理及分析

3 实验结果

3.1 BCM的细胞毒性检测

3.2 BCM抑制RABV的增殖和病毒滴度

3.3 BCM-3对RABV的体外抑制作用

3.4 BCM-3处理不同时间对RABV的作用

3.5 BCM-3在小鼠模型体内抗RABV的效果

4 讨论

5 小结

第二章双香豆素化合物调控SQSTM1/p62发挥抗狂犬病病毒作用的机制研究

1 实验材料

1.1 毒株、细胞和质粒

1.2 细胞培养相关试剂

1.3 过表达质粒构建及转染相关试剂

1.4 siRNA转染相关试剂

1.5 蛋白试剂和荧光定量PCR相关试剂

2 主要仪器

3 生物信息学软件及数据分析方法

4 实验方法

4.1 N2a细胞培养及传代

4.2 BCM-3抑制RABV后复制及自噬相关蛋白检测

4.3 pcDNA3.1-SQSTM1/p62真核过表达质粒的构建

4.4 构建过表达质粒载体pcDNA3.1-p62

4.5 过表达质粒pcDNA3.1-p62对病毒的作用

4.6 siRNA的转染及病毒蛋白和基因水平的检测

4.7 荧光定量PCR检测SQSTM1/p62和病毒基因的表达水平

4.8 Western-blot检测SQSTM1/p62蛋白和病毒蛋白的表达

5 实验结果

5.1 自噬通路中参与BCM-3抗RABV复制关键蛋白的筛选

5.2 构建SQSTM1/p62真核表达质粒的构建

5.3 过表达SQSTM1/p62可抑制RABV的复制

5.4 消减细胞中SQSTM1/p62的表达,可促进病毒复制

6 讨论

7 小结

全文结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 徐梦娴

导师: 朱国强,涂长春,刘艳

关键词: 狂犬病,抗狂犬病病毒,香豆素化合物,双香豆素化合物

来源: 扬州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 扬州大学

基金: “宠物疾病诊疗与防控新技术研究-抗狂犬病病毒药物的筛选及机制研究”国家重点研发计划项目(2016YFD0501002),“ZEB1,linc00511,PTPMeg2,Stat3介导胰腺癌发展的机制研究”博士后科学基金特别资助项目(2018T110253)

分类号: S852.65

DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.001182

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