导读:本文包含了蝎毒素基因论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:毒素,东亚,基因,杆状,核型,病毒,膜片。
蝎毒素基因论文文献综述
罗锋,李正,范丽梅,梁勇,林燕[1]（2012）在《东亚正钳蝎毒素基因BmKbpp的原核表达及其抗菌功能初步鉴定》一文中研究指出一级结构分析和二级结构预测表明无二硫键蝎毒液多肽(NDBPs)BmKBPP具两亲性α-Helix结构,含有大量带净正电荷的碱性残基(Arg和Lys),符合多价阳离子抗菌肽的典型特征。采用PCR法和质粒载体pGEX-5X-1构建BmKbpp、EGFP及BmKbpp/EGFP与GST的原核融合表达载体,3个表达载体与pGEX-5X-1分别在Rossetta(DE3)菌中进行表达,并测定4个Rossetta(DE3)表达工程菌诱导表达的生长曲线。结果表明,BmKBPP是一个具有很强抑菌功能的抗菌肽,GST、BmKBPP及EGFP3个蛋白一起融合表达可获得少量蛋白的表达,这将为后续的功能研究和应用研究奠定基础。(本文来源于《江汉大学学报(自然科学版)》期刊2012年05期）
赵睿明[2]（2010）在《细尖狼蝎毒素基因种内多样性分析及其SdPI蛋白酶抑制功能研究》一文中研究指出蝎是一种在世界上分布极为广泛的毒液动物,四亿多年的适应与进化使其产生了毒腺与毒腺中多种多样的生物活性组分。这些以蛋白和多肽为主的生物活性组分对于蝎种自身的捕食与防御具有不可替代的作用,也给现代生物医药研发提供了十分宝贵的分子资源。然而,虽然蝎作为药物使用的历史已超过两千多年,但目前对于蝎毒素的研究仍然聚焦于少数几个蝎种和它们丰度较高的几种毒素类型上,由于不同蝎种间毒素存在丰富的多样性,大量具有重要生物学意义的毒素组分仍亟待发掘。另外,通过毒素分离与组学分析的方法,蝎种之间毒素的差异已被广泛接受,但对于同一蝎种中毒素差异的比较研究很少,蝎毒素的种内多样性需要更为全面清晰地阐明。本文通过构建蝎毒腺组织cDNA文库的方法,对不同地域来源的细尖狼蝎进行了毒素转录组学比较分析,获得了大量新的毒素分子,阐明了蝎毒素存在显着的种内多样性,同时也克隆、表达、鉴定了首个蝎毒液来源的Kunitz型毒液蛋白SdPI (Scorpion derived Protease Inhibitor)。本室从海南省和云南省采集获得了2种蝎样本,根据形态学特征鉴定它们属于同一蝎种——细尖狼蝎(Lychas mucronatus)的不同地域种。通过构建海南细尖狼蝎(Hainan-sourced Lychas mucronatus)与云南细尖狼蝎(Yunnan-sourced Lychas mucronatus)的毒腺组织cDNA文库,并进行转录组学分析,共分离和鉴定了158个新的蝎毒素基因。这些毒素基因依据同源性可分为20个类型,包括钠毒素、α-钾毒素、β-钾毒素、脂类分解激活肽、钙毒素、小阳离子抗菌肽、ponericin类似肽、BmKbpp类似肽、酸性肽、甘氨酸富集肽、丝氨酸蛋白酶、磷脂酶A2、8C-toxin、唾液蛋白、La1类似肽、金属蛋白酶、TIL类似肽(Trypsin inhibitor like peptide)、细胞毒性肽、氯毒素以及非典型毒素(Atypical toxin)。其中甘氨酸富集肽、8C-toxin和唾液蛋白是叁种新型蝎毒素。该研究结果展示了蝎毒素分子的极端多样性。然后,通过对海南细尖狼蝎与云南细尖狼蝎毒腺组织cDNA文库的比较转录组学分析发现,海南细尖狼蝎与云南细尖狼蝎毒液中拥有16种共同的已知毒素类型：它们分别是钠毒素、α-钾毒素、p-钾毒素、脂类分解激活肽、钙毒素、小阳离子抗菌肽、ponericin类似肽、BmKbpp类似肽、酸性肽、甘氨酸富集肽、丝氨酸蛋白酶、磷脂酶A2、8C-toxin、唾液蛋白、Lal类似肽、金属蛋白酶和TIL类似肽,且它们在毒液中的丰度都相对较高。进一步分析发现在细尖狼蝎两个地域种的毒液中相同毒素类型的丰度明显不同,且毒素序列也存在显着差异：海南细尖狼蝎毒液中含有丰度较高且序列更为多变的钠毒素和抗菌肽,而云南细尖狼蝎毒液中的钾毒素则更为丰富多变。这些研究结果系统证实了细尖狼蝎毒液蛋白组分存在十分明显的种内多样性,同时也表明了蝎种在不同选择压力下可能通过毒液中现有毒素类型的丰度与氨基酸序列的变化来适应新的生存环境。最后,通过大规模EST分析与序列同源性搜索,从云南细尖狼蝎毒腺组织cDNA文库中筛选到了一个全新的Kunitz型毒液蛋白基因SdPI。SdPI全长cDNA为364 nt,其中243 nt的开放阅读框总共编码80个氨基酸：21个氨基酸残基的信号肽以及59个氨基酸残基的成熟肽。SdPI具有与其它动物毒液来源的Kunitz型毒液蛋白相似的氨基酸序列,但序列中半胱氨酸的结构模体却发生了改变。根据SdPI的cDNA序列设计引物,PCR扩增其成熟肽编码序列,构建重组表达载体pET28a-SdPI,转化受体菌E.coli Rosetta后,IPTG诱导表达。运用包涵体变性复性结合RP-HPLC的方法获得了色谱纯的重组SdPI蛋白。高纯度重组SdPI蛋白的得率达到5.5 mg/L培养液。丝氨酸蛋白酶抑制实验表明,重组SdPI蛋白能显着地抑制胰蛋白酶活性,其Ki为1.6×10-7 M,且具有很强的热稳定性。定点突变实验结合CD和酶抑制试验进一步证明了SdPI的活性中心为第14位的赖氨酸残基,与天然Kunitz结构模体的活性中心相似。综上所述,对属于同一蝎种的海南细尖狼蝎与云南细尖狼蝎进行了详尽的转录组学比较分析,发现了158个新的蝎毒素基因,分属于20个毒素类型,不仅为创新药物研发提供了大量的候选分子,也首次全面地阐述了蝎毒素的种内多样性,为了解蝎毒素的适应性进化提供了线索。同时鉴定了首个蝎毒液来源的Kunitz型毒液蛋白SdPI的功能,为了解蝎毒液中的未知毒素类型进行了探索,也为开发蝎毒液来源的蛋白酶抑制剂类多肽药物奠定了基础。(本文来源于《武汉大学》期刊2010-07-21）
马一保[3]（2009）在《蝎毒素的基因分离、多样性机制及其进化研究》一文中研究指出蝎具有4亿多年的进化史。为了不断地适应生存环境的变化,蝎进化产生了一种特定的毒腺器官。毒腺分泌的毒液富含生物活性组分,主要用于捕获猎物和防御其它动物的攻击。研究结果表明,不同蝎种毒液的毒素组成存在着巨大的差异。在我国,蝎毒素的药用功能早在2000多年前就已经被发现。现代科学研究初步揭示了蝎毒素的药学机理,一些毒素分子作为候选新药相继被发现并处于临床前和临床试验,从而显示了蝎毒素是一个创新药物的源泉。为了较系统地分析不同蝎种毒液组成的差异及其与蝎生存的相关性,同时也为了给现代生物药物研发提供一个创新药物资源,本论文对3个蝎科的4个蝎种进行了毒腺组织转录组学分析,并在此基础上对蝎毒素的多样性机制和进化进行了探讨。首先,本论文构建了细尖狼蝎(Lychas mucronatus)、斑等蝎(Isometrus maculates)、亚洲雨林蝎(Heterometrus spinifer)以及西藏琵蝎(Scorpiops tibetanus)的毒腺组织cDNA文库。通过转录组学分析,分离和鉴定了246个新的蝎毒素基因。这些毒素分为21个类型,包括钠毒素、脂类分解激活肽、а-钾毒素、β-钾毒素、scorpine类似肽、K-钾毒素、钙毒素、scamp(small cationtic antimicrobial peptides)、细胞毒性肽、ponericin类似肽、lcamp(long cationic antimicrobial peptides)、BmKbpp类似肽、溶菌酶、酸性肽、磷脂酶A2、Lal类似肽、脯氨酸富集肽、tibetanin、8C-toxin、唾液蛋白以及丝氨酸蛋白酶。其中脯氨酸富集肽、tibetanin、8C-toxin和唾液蛋白为4类新型蝎毒素。该研究结果充分反映了蝎毒素的分子多样性。其次,本论文从两个层面上探讨了蝎毒素分子多样性的机制。将本研究中得到的2个兴奋型昆虫p-钠毒素与已报道的7个兴奋型昆虫p-钠毒素的基因进行密码子比对,然后用最大似然法进行适应性进化的检测。结果显示,在9个兴奋型昆虫β-钠毒素共有的64个密码子中,11个密码子位点存在显着的正向选择现象。该结果表明,基因复制之后的适应性进化是蝎毒素分子多样性的遗传机制之一。另外,本论文发现LmTxLP11和LmVP1.1两个毒素的转录本具有完全一致的5’区域和完全不同的3’区域。运用PCR的方法,分子克隆和鉴定了LmTxLP11和LmVP1.1两个毒素的编码基因。生物信息学分析表明,LmTxLP11和LmVP1.1是由同一个基因编码并通过选择性拼接而产生的两个毒素转录本。该结果表明,选择性拼接是蝎毒素分子多样性的遗传机制之一。最后,基于细尖狼蝎、斑等蝎、亚洲雨林蝎以及西藏琵蝎的毒素表达谱数据,进行了蝎毒素的分子进化分析,初步推断了蝎毒素的进化过程：在Buthidae与其它蝎科分化之前,蝎毒液中已经含有а-钾毒素、β-钾毒素、磷脂酶A2、Lal类似肽、唾液蛋白、丝氨酸蛋白酶和酸性肽等7类毒素；在Caraboctonidae与Scorpionidae、Liochelidae、Euscorpiidae和Chactidae分化之前,scorpine类似肽和lcamp已存在于蝎毒液中；在Scorpionidae与Liochelidae分化之前,к-钾毒素已经招募到蝎毒液中。综上所述,246个不同的蝎毒素基因的分离和鉴定,将现有蝎毒素基因的数目提高了40%,不仅揭示了蝎毒素的分子多样性和不同蝎种的毒素分子差异性,而且为创新药物设计与研发提供了众多候选分子。本论文发现的基因复制后的适应性进化和选择性拼接,分别在DNA水平和RNA水平上进一步阐明了蝎毒素分子多样性的遗传机制。此外,蝎毒素分子进化研究表明蝎毒液是一个不断进化的动态系统,从而有助于揭开蝎4亿年进化保守的“秘密”。(本文来源于《武汉大学》期刊2009-05-20）
俞燕芳,许雅香,李兵,沈卫德[4]（2009）在《表达东亚钳蝎毒素BmKT基因的重组苜宿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)的构建》一文中研究指出为了研究重组杆状病毒杀虫剂对家蚕的影响,将东亚钳蝎毒素BmKT基因和AcNPV的polh基因克隆到杆状病毒转座载体pFastBacHTB中,构建成重组转座载体pFast-BmK-Ph,利用杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac)得到含多角体蛋白并可表达蝎毒素的重组病毒rAcNPV。(本文来源于《中国蚕学会第六届青年学术研讨会论文集（2）》期刊2009-05-01）
罗锋,刘辉,李文鑫[5]（2006）在《东亚钳蝎毒素BmKT四个同源基因的克隆及基因组织分析》一文中研究指出BmKT是从本室构建的cDNA文库中筛选到的1个α钠通道毒素,根据其全长cDNA序列设计引物,采用PCR法以蝎总基因组DNA为模板,获得4个BmKT的同源基因,分别命名为BmKT′和BmKTa、BmKTb、BmKTb′.序列分析表明:BmKT′和BmKTa基因含有大小分别为509bp和506bp的内含子,位于信号肽编码区内,插入信号肽-4位残基Gly密码子的第一个碱基G之后;而BmKTb和BmKTb′的内含子大小均为418bp.这4个BmKT的同源基因内含子符合GTAG拼接规律,其中BmKT′和BmKTa的内含子A+T含量分别为61.7%和61.9%,低于目前已报导的大多数蝎毒素基因A+T含量,大大低于它们第一外显子A+T含量(71.7%),略高于第二外显子A+T含量(55.5%);而BmKTb,BmKTb′的内含子A+T含量分别为75.8%和76.1%,与目前已报导的大多数蝎毒素基因A+T含量相似.BmKT′基因的外显子与BmKT基因cDNA所对应氨基酸序列仅在信号肽中-7位有一个氨基残基的差异(BmKT:Leu→BmKTa:Val);而BmKTa基因外显子所推断的氨基酸序列与BmKT前体比较,则在成熟肽的+54位发生了突变(BmKT:Lys→BmKTa:Asn),是与BmKT同源的一个新基因.BmKTb基因和BmKTb′基因所编码的前体肽与BmKT基因对应的前体肽同源性约为65%,显然BmKTb和BmKTb′是不同于BmKT的2个新基因(GenBank登录号:BmKT′,AY786186;BmKTa,AY676142;BmKTb,AY676140;BmKTb′,AY676141).(本文来源于《中国生物化学与分子生物学报》期刊2006年05期）
聂婷婷[6]（2006）在《茶毛虫NPV基因组部分序列分析和含东亚钳蝎毒素基因重组HearSNPV的构建》一文中研究指出茶毛虫(Euproctis pseudoconspersa Strand)又称茶毒蛾,属鳞翅目毒蛾科,主要分布于我国湖北、福建、浙江、广西、贵州和安徽等省以及亚洲的日本和印度等国,是茶树的主要害虫之一。茶毛虫核型多角体病毒(Euproctispseudoconspersa nucleopolyhedrovims简称EupsNPV)是自然界控制茶毛虫的重要生物因子,多年来作为一种病毒杀虫剂在我国已经被推广使用,在茶毛虫的生物防治过程中取得了良好的社会和经济效益,具有很大进一步开发应用的潜力。本研究采用分子生物学技术,提取病毒的基因组DNA,通过随机克隆,构建了其基因组的部分质粒文库,克隆了部分基因组DNA片段,测定和分析了几个相关基因的核苷酸序列,从基因水平确定了该病毒与其它杆状病毒的亲缘关系。 主要结果如下: 克隆和测定了茶毛虫核型多角体病毒(EupsNPV)全长5942bp的EcoRI-XhoI基因组DNA片段。序列分析表明该片段包含5个完整的开放阅读框(ORF),分别编码P24、Rr1、38.7K、Lef1和Ep-ld124。通过对上述5个基因与其它已知杆状病毒的同源基因的分析比较,以及对P24、Rr1和Lef1的分子进化树分析,表明EupsNPV是一种与已知杆状病毒都有较大差异的病毒种类,属于NPV Ⅱ组病毒。结果还表明EupsNPV与茶尺蠖(Ectropis obliqua)核多角体病毒(EcobSNPV)的亲缘关系最为接近。 克隆了EupsNPV多角体蛋白基因(ph)及其旁侧的920nt序列。ph基因开放阅读框共有738bp,可编码246个氨基酸的多肽。预计编码的蛋白质分子量在28.9KD左右。分析多角体基因的启动子序列,结果显示,在编码区起始密码子ATG上游有一个富含AT的启动子区,在起始密码子ATG上游-52bp处有杆状病毒晚期启动子基序ATAAG,在ph基因翻译终止密码子下游25nt和80nt处各有一个polyA加尾信号AATAAA。EupsNPV ph基因ATG-52bp处14bp保守序列为CCAATAAGTATTTT。第一个核苷酸C与其它19种ph基因在此位置的碱基(A或T)不同。 昆虫选择性神经毒素蛋白是作用于昆虫神经系统的一种蛋白类毒素。被(本文来源于《浙江大学》期刊2006-05-01）
盛继群[7]（2004）在《一种新的东亚钳蝎毒素BmTxKS4基因克隆及其功能鉴定研究》一文中研究指出蝎子是古老的物种,其种类、进化史及其毒素的多态性,引起世界各国科学家极大的研究兴趣。蝎子尾腺分泌毒液,其毒液中含有多种生物活性成分,主要有由蛋白质和非蛋白质两组分组成。蝎毒的蛋白质成分主要是一类由20～80个氨基酸小分子多肽(通称为蝎毒素),每一种蝎子其毒液中约含有50～100种蝎毒素,存在较强的多态性变化。现已证实,蝎毒素作用的靶目标为兴奋和非兴奋细胞质膜上的离子通道,蝎毒素与通道结合后可以引起通道电流的阻断或门控动力学的改变。蝎毒素可分为:Na~+通道、K~+通道、Cl~-通道和Ca~(2+)通道(主要存在于骨骼肌细胞浆膜上)毒素。 分离新的蝎毒素基因,是采用分子生物学方法研究蝎毒素的前提与基础。构建cDNA文库对于分离目的基因,特别是多基因家族成员的蝎毒素基因具有特别重要的价值。以中国产东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch,BmK)毒腺组织为材料,成功地构建了一个高质量的cDNA文库。随机挑取14个克隆子,用PCR方法进行鉴定,结果表明,5个克隆子均含有插入片段,大小为300～600bp。 采用通用引物测序的方法,从已构建的蝎毒腺细胞cDNA文库中筛选得到一个新的537bp的cDNA序列,被命名为BmTxKS4(GenBank登记号为AY278247)。BmTxKS4的cDNA的5′和3′端非编码序列(UTR)分别长111bp和189bp;有两个加尾信号AATAAA在距poly(A)上游37bp和14bp处。此序列含有一个234bp的开放阅读框(ORF),编码78个氨基酸,其中包括21个氨基酸残基的信号肽、11个氨基酸残基的前肽,46个氨基酸残基的成熟肽,叁对二硫键。根据cDNA推测所得的氨基酸序列分别与钾离子通道蝎毒素AGTX1、AGTX2、AGTX3、KTX1、Bs6、Pi3、Pi2、BmTx3、ChTx-a和BeKm-1分别有35.5%,35.5%,35.5%,35.5%,35.5%,35.5%,30.6%,27.8%,26.1%,25.0%,22.6%,的同源性。 提取蝎总DNA,根据BmTxKS4 cDNA的5′和3′端非编码序列(UTR)设计PCR引物,从蝎总DNA中克隆到BmTxKS4的全长基因。序列分析发现BmTxKS4含有(本文来源于《武汉大学》期刊2004-06-01）
刘珍[8]（2003）在《破骨细胞形成抑制因子OPG、蝎毒素BmK ITa1的基因克隆、表达及其功能研究》一文中研究指出本论文利用RT-PCR和RACE技术克隆了OPG和BmK ITa1两个基因, 并分别对其进行了表达及功能研究。第一部分，OPG及其突变体OPG-280、OPG-Fc的构建、表达及功能研究。 破骨细胞形成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor, OCIF 或称 osteoprotegerin, OPG) 是1997年发现的具有降血钙作用和防止骨质流失的一种新的可以调节骨密度的糖蛋白质。OPG作为一种新发现的蛋白质，具有很高的研究意义和开发价值。目前用于结构与功能研究的OPG主要通过CHO细胞表达重组蛋白, 但其较低的表达量限制了研究进程。所以我们的目标就是利用基因工程手段构建一系列OPG突变体，同时完成将它们在不同的表达系统中进行重组表达的研究以建立一种或几种理想的表达系统用以大量制备具有生物活性的重组蛋白。成熟的OPG共有380个氨基酸，存在着单体和二聚体两种形式，其中Cys379对OPG形成同源二聚体是必需的。之前，我们利用RT-PCR技术首次从中国人正常肝细胞株L02中克隆到一种新的破骨细胞形成抑制因子变体基因(OPG-372) (GenBank登录号AF134187), 序列分析结果表明，与国外文献报道相比较，中国人肝细胞株和胎盘中该cDNA 3'端存在一个赭石型终止码突变，从而使这一个蛋白比报道的在C端少8个氨基酸残基。 OPG-372基因已在昆虫杆状病毒表达系统表达并证明OPG-372没有形成二聚体。为了构建OPG一系列突变体，进一步比较重组OPG单体与同源二聚体的体内代谢及其生物效应稳定性, 我们接着从中国人外周血淋巴细胞(PBL)中克隆了OPG基因3’端基因组序列210bp，与国外文献报道的OPG cDNA3'序列相一致，将此210bp与OPG-372重组拼接得到全长无缺失的OPG。 同时，考虑到人免疫球蛋白IgG Fc片段的多个二硫键可能有助于OPG形成同源二聚体， 我们在OPG-372 C端融合Fc得到加长突变体OPG-Fc。 另外，为了调查重组OPG最小的功能片段，结合其结构特点，我们去除OPG-372 C端的100个氨基酸，得到缩短突变体OPG-280。<WP=3>之后，本论文首次成功地将OPG及其变体OPG-280和OPG-Fc基因克隆于表达载体pET-28a中，在大肠杆菌中进行融合表达。研究结果表明经1mmol/L IPTG诱导5h后，OPG-280得到高效表达，产物主要为不溶性包涵体，OPG, OPG-Fc 仅有少量表达。将OPG-280 经Ni2+-IDA柱纯化，变复性，OPG-280的6×His 融合蛋白在3h后可以降低小鼠血钙浓度1.5 mg/100ml， 即下降15%左右。然而，OPG和OPG-Fc在大肠杆菌中的重组表达量太低， Ni2+-IDA柱亲和层析纯化后表达产物很少，而且需要对表达产物进行变复性，不足进行动物实验。所以我们在其他表达系统如昆虫表达体系进行OPG进一步研究。进而，将OPG、OPG-280和OPG-Fc基因分别插入昆虫杆状病毒供体质粒pFastBac1和pFastBacHTb中, 成功地将OPG、OPG-280、OPG-Fc叁种基因在粉纹夜蛾Tn-5B1-4细胞中得到高效表达，而且OPG-Fc在Tn细胞中形成同源二聚体。经小鼠降血钙实验发现，六种表达产物OPG 、OPG-280、OPG-Fc 、His-OPG 、His-OPG-280、 His-OPG-Fc均有生物活性，它们3h后可以降低小鼠血钙浓度分别为10%，11%，15%，8%，10%，14%。同时，我们首次将OPG、OPG-280和OPG-Fc基因克隆于昆虫病毒转移载体pBacPAK8 中，并将它们在家蚕核型多角体病毒(BmNPV)-家蚕( Bombyx mori)表达系统中进行了高效表达，通过非还原SDS-PAGE 发现OPG和OPG-Fc均能形成同源二聚体，而且表达的OPG蛋白出现糖基化。通过小鼠降血钙的实验，证明了叁种重组表达产物OPG、OPG-280、OPG-Fc均有良好的生物活性，它们3h后可以降低小鼠血钙浓度分别为19%，14%，17%。在以上叁个表达系统中，C端缺失100个氨基酸的OPG-280仅以单体方式存在， OPG仅在昆虫虫体中可以形成二聚体，C端融合人免疫球蛋白Fc片段的OPG-Fc在大肠杆菌中没有形成同源二聚体，而在Tn细胞和家蚕虫体内均存在单体和同源二聚体两种形式，推测Fc自身的多个二硫键有助于OPG同源二聚体的形成。从小鼠降血钙实验分析，在昆虫细胞产物中，OPG-Fc活性最高，在昆虫虫体中，OPG和OPG-Fc活性相当，说明在虫体中都能很好形成稳定双体，活力略高于单体，而C端缺失100个氨基酸对其生物学活性没有明显影响。这为开发重组表达OPG的家蚕口服药物在临床上治疗高血钙症以及骨质疏松症等疾病创造了条件。第二部分，蝎毒素基因BmK ITa1的克隆、表达及其重组蛋白酰胺化后加工<WP=4>的研究。 根据东亚钳蝎中的抑制型昆虫毒素的N端序列，戚正武先生实验室利用cDNA末端序列快速扩增技术 (RACE) 从蝎尾腺总RNA中克隆到多个昆虫毒素cDNA，我们从中得到一个BmK ITa1 cDNA，经测序证明它是抑制型昆虫型毒素。它的结构与已知的抑制型昆虫型毒素很相似：cDNA 编码一段21个残基的信号肽，一段61个残基的成熟肽和C末端叁个额外的残基，而且序列也很同源。在BmK ITa1 cDNA 的成熟肽编码区后有GKK 叁个残基，这说明BmK ITa1 的基因产物C末端是酰胺化的。(GenBank登录号AY090782)接着，我们将BmK ITa1基因克隆至装有融合蛋白DsbC的表达载体pET-40b中，得到融合基因DsbC-BmK ITa1在大肠杆菌中重组表达。经1mM的IPTG诱导表达3小时，超声破菌后表达产物约占细菌蛋白质总量(本文来源于《中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）》期刊2003-06-01）
刘岩峰,张景海[9]（2003）在《重组蝎毒素基因表达的研究进展》一文中研究指出目的介绍重组蝎毒素基因表达的研究进展。方法根据近年来国内外公开发表的有关研究论文 ,综述重组蝎毒素基因表达的研究。结果与结论通过筛选得到的蝎毒素基因或化学合成的编码蝎毒素的基因分别在大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫和植物中都有过表达尝试。重组蝎毒素基因表达的关键是如何使有活性的重组蛋白高水平表达(本文来源于《沈阳药科大学学报》期刊2003年01期）
曹志贱,肖帆,毛歆,刘辉,李文鑫[10]（2002）在《一个东亚钳蝎蝎毒素BmTXKβ基因的克隆及其基因表达调控》一文中研究指出从东亚钳蝎 (ButhusmartensiiKarsch ,BmK)毒腺组织cDNA文库中分离的长链钾通道毒素BmTXKβcDNA序列 ,克隆了BmTXKβ基因组序列 .BmTXKβ基因含有一个长度为 886bp的内含子 ,定位于BmTXKβ成熟肽中 ,与其它蝎毒素基因内含子定位于信号肽的基因结构不同 .并且 ,BmTXKβ基因的内含子特征也与其它蝎毒素基因不同 .研究结果从基因水平上证实了BmTXKβ是一个新的蝎毒素样肽 .以BmTXKβcDNA序列为探针与蝎基因组DNASouthern杂交出现 2条特异性杂交带 .杂交结果为蝎毒素基因可能通过DNA重排、多拷贝或多基因家族来调控基因表达提供了证据 .(本文来源于《中国生物化学与分子生物学报》期刊2002年06期）
蝎毒素基因论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
蝎是一种在世界上分布极为广泛的毒液动物,四亿多年的适应与进化使其产生了毒腺与毒腺中多种多样的生物活性组分。这些以蛋白和多肽为主的生物活性组分对于蝎种自身的捕食与防御具有不可替代的作用,也给现代生物医药研发提供了十分宝贵的分子资源。然而,虽然蝎作为药物使用的历史已超过两千多年,但目前对于蝎毒素的研究仍然聚焦于少数几个蝎种和它们丰度较高的几种毒素类型上,由于不同蝎种间毒素存在丰富的多样性,大量具有重要生物学意义的毒素组分仍亟待发掘。另外,通过毒素分离与组学分析的方法,蝎种之间毒素的差异已被广泛接受,但对于同一蝎种中毒素差异的比较研究很少,蝎毒素的种内多样性需要更为全面清晰地阐明。本文通过构建蝎毒腺组织cDNA文库的方法,对不同地域来源的细尖狼蝎进行了毒素转录组学比较分析,获得了大量新的毒素分子,阐明了蝎毒素存在显着的种内多样性,同时也克隆、表达、鉴定了首个蝎毒液来源的Kunitz型毒液蛋白SdPI (Scorpion derived Protease Inhibitor)。本室从海南省和云南省采集获得了2种蝎样本,根据形态学特征鉴定它们属于同一蝎种——细尖狼蝎(Lychas mucronatus)的不同地域种。通过构建海南细尖狼蝎(Hainan-sourced Lychas mucronatus)与云南细尖狼蝎(Yunnan-sourced Lychas mucronatus)的毒腺组织cDNA文库,并进行转录组学分析,共分离和鉴定了158个新的蝎毒素基因。这些毒素基因依据同源性可分为20个类型,包括钠毒素、α-钾毒素、β-钾毒素、脂类分解激活肽、钙毒素、小阳离子抗菌肽、ponericin类似肽、BmKbpp类似肽、酸性肽、甘氨酸富集肽、丝氨酸蛋白酶、磷脂酶A2、8C-toxin、唾液蛋白、La1类似肽、金属蛋白酶、TIL类似肽(Trypsin inhibitor like peptide)、细胞毒性肽、氯毒素以及非典型毒素(Atypical toxin)。其中甘氨酸富集肽、8C-toxin和唾液蛋白是叁种新型蝎毒素。该研究结果展示了蝎毒素分子的极端多样性。然后,通过对海南细尖狼蝎与云南细尖狼蝎毒腺组织cDNA文库的比较转录组学分析发现,海南细尖狼蝎与云南细尖狼蝎毒液中拥有16种共同的已知毒素类型：它们分别是钠毒素、α-钾毒素、p-钾毒素、脂类分解激活肽、钙毒素、小阳离子抗菌肽、ponericin类似肽、BmKbpp类似肽、酸性肽、甘氨酸富集肽、丝氨酸蛋白酶、磷脂酶A2、8C-toxin、唾液蛋白、Lal类似肽、金属蛋白酶和TIL类似肽,且它们在毒液中的丰度都相对较高。进一步分析发现在细尖狼蝎两个地域种的毒液中相同毒素类型的丰度明显不同,且毒素序列也存在显着差异：海南细尖狼蝎毒液中含有丰度较高且序列更为多变的钠毒素和抗菌肽,而云南细尖狼蝎毒液中的钾毒素则更为丰富多变。这些研究结果系统证实了细尖狼蝎毒液蛋白组分存在十分明显的种内多样性,同时也表明了蝎种在不同选择压力下可能通过毒液中现有毒素类型的丰度与氨基酸序列的变化来适应新的生存环境。最后,通过大规模EST分析与序列同源性搜索,从云南细尖狼蝎毒腺组织cDNA文库中筛选到了一个全新的Kunitz型毒液蛋白基因SdPI。SdPI全长cDNA为364 nt,其中243 nt的开放阅读框总共编码80个氨基酸：21个氨基酸残基的信号肽以及59个氨基酸残基的成熟肽。SdPI具有与其它动物毒液来源的Kunitz型毒液蛋白相似的氨基酸序列,但序列中半胱氨酸的结构模体却发生了改变。根据SdPI的cDNA序列设计引物,PCR扩增其成熟肽编码序列,构建重组表达载体pET28a-SdPI,转化受体菌E.coli Rosetta后,IPTG诱导表达。运用包涵体变性复性结合RP-HPLC的方法获得了色谱纯的重组SdPI蛋白。高纯度重组SdPI蛋白的得率达到5.5 mg/L培养液。丝氨酸蛋白酶抑制实验表明,重组SdPI蛋白能显着地抑制胰蛋白酶活性,其Ki为1.6×10-7 M,且具有很强的热稳定性。定点突变实验结合CD和酶抑制试验进一步证明了SdPI的活性中心为第14位的赖氨酸残基,与天然Kunitz结构模体的活性中心相似。综上所述,对属于同一蝎种的海南细尖狼蝎与云南细尖狼蝎进行了详尽的转录组学比较分析,发现了158个新的蝎毒素基因,分属于20个毒素类型,不仅为创新药物研发提供了大量的候选分子,也首次全面地阐述了蝎毒素的种内多样性,为了解蝎毒素的适应性进化提供了线索。同时鉴定了首个蝎毒液来源的Kunitz型毒液蛋白SdPI的功能,为了解蝎毒液中的未知毒素类型进行了探索,也为开发蝎毒液来源的蛋白酶抑制剂类多肽药物奠定了基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
蝎毒素基因论文参考文献
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