人参不定根培养体系的建立与人参和三七土壤微生物的分析及代谢调控研究

论文摘要

人参（Panax　ginseng　C.A.Mey.）是国内外名贵中药材,应用十分广泛。本文为了提高人参不定根中人参皂苷含量,分别进行人参不定根系的筛选,人参和三七土壤微生物和内生菌优势菌分析,以及三七的优势菌株球毛壳菌对人参皂苷代谢调控的研究。首先根据人参外植体年限和人参不定根形态（主根与支根）,分别建立了6种人参不定根培养体系。从人参皂苷含量、功能基因表达水平等方面将人参不定根系与5年生栽培人参（5Y）进行比较,并结合主成分分析,结果表明:AR-5R（5年生人参诱导不定根支根）人参皂苷含量（23.03 mg/g）与5Y（31.88 mg/g）最接近,且与基因表达量相一致,从而筛选出AR-5R为人参不定根最优根系。以不同人参产地（抚松,靖宇,通化）和三七产地（阿三龙,回龙,示范园）的根际土壤和根部样本为研究对象,提取样本中微生物的总DNA后分别在细菌16S rDNA和真菌ITS1区域进行高通量测序,以回龙三七和抚松6年生人参的活性成分最高为重要依据,对其进行优势菌株预测。发现人参土壤优势细菌有Pseudomonas citronellolis等16株,人参土壤优势真菌有Trichoderma spirale等15株,人参优势内生细菌有Delftia tsuruhatensis等30株,人参优势内生真菌有Clonostachys divergens等20株。三七土壤优势细菌有bacterium Ellin5102等18株,三七土壤优势真菌有Chaetomium globbosum等32株,三七内生细菌优势菌有Sphingobium fuliginis等19株,三七内生真菌优势菌有Microidium phyllanthi等10株。采用传统微生物分离方法,从三七根部和土壤共得到细菌36株、真菌40株、鉴定出Chaetomium globosum等15株,其中C.globosum与ITS1预测的三七回龙的优势菌一致,被选为后续实验菌株。为提高人参皂苷含量,考察不同处理方式（灭菌菌体,孢子悬浮液,固定化孢子,固定化菌丝体）的C.globosum对人参不定根的影响。发现固定化孢子组明显增加皂苷含量,最优共培养条件是液固比10:1（mL/g）,初始pH 6.5,时间24 h,总皂苷（56.29 mg/g）提高3.2倍。考察其诱导机制,发现诱导子可增加人参抗性反应中信号分子（Ca2+、NO和H202）积累、上调抗性基因（PAL和PR10）和人参皂苷生物合成途径中的功能基因（GPS、FPS、SS、SE、DS、CYP716A47、CYP716A53 v2、UGT74AE2、UGT94Q2、UGTPg1和UGTPg100）的表达量。为确定C.globosum中的有效成分,对共培养发酵液进行GC-MS分析,发现在C.globosmu发酵液分析出6个特征代谢物,其中L-天冬氨酸可能起主要作用。通过最优菌株球毛壳菌与最优人参根系共同培养,明显提高不定根中人参皂苷含量,为工业化生产人参活性成分提供理论基础和技术支持。

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摘要

ABSTRACT

1 前言

1.1 药用植物根际土壤微生物的研究进展

1.1.1 促进药用植物对养分的吸收

1.1.2 促进药用植物生长

1.1.3 抑制有害微生物的生长

1.2 药用植物内生菌的研究进展

1.2.1 影响药用植物次生代谢产物

1.2.2 产生与宿主植物相同或相似的活性成分

1.2.3 转化合成活性成分

1.3 人参和三七微生物研究进展

1.3.1 人参根际土壤微生物

1.3.2 人参内生菌

1.3.3 三七根际土壤微生物

1.3.4 三七内生菌

1.3.5 人参和三七微生物比较

1.4 人参组织培养研究进展

1.4.1 人参愈伤组织培养研究

1.4.2 人参悬浮细胞培养研究

1.4.3 人参体细胞胚培养研究

1.4.4 人参毛状根培养研究

1.4.5 人参不定根培养研究

1.4.6 人参属根系的评价

1.5 立题背景及选题意义

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

2.1.1 人参样品

2.1.2 人参土壤和根部样品的收集

2.1.3 三七土壤和根部样品的收集

2.1.4 主要试剂

2.2 实验仪器

2.3 实验方法

2.3.1 人参不定根培养体系的建立

2.3.2 土壤和根部基因组DNA的提取

2.3.3 细菌16S rDNA和真菌ITS区域测序

2.3.4 测序结果的生物信息学分析

2.3.5 微生物分离、纯化和鉴定

2.3.6 球毛壳菌（Chaetomium globosum）菌丝体对人参不定根中生物量和人参皂苷含量的影响

2.3.7 C. globosum孢子悬浮液对人参不定根生物量和人参皂苷含量的影响

2.3.8 固定化C. globosum的制备

2.3.9 固定化C. globosum与人参不定根共同培养的作用评价

2.3.10 GC-MS检测

2.4 分析方法

2.4.1 鲜重干重增值倍数的测定

2.4.2 人参中人参皂苷的种类的分析及含量测定

2.4.3 抗氧化活性测定

2.4.4 信号分子的测定

2.4.5 抗性基因及功能基因的表达

2.4.6 菌丝体多糖含量的测定

2.4.7 数据分析

3 结果与讨论

3.1 人参不定根系的评价

3.1.1 人参不定根培养体系的建立

3.1.2 人参不定根系与栽培人参根中皂苷成分分析

3.1.3 人参不定根系与栽培人参根中人参皂苷含量

3.1.4 人参不定根系与栽培人参主成分分析

3.1.5 人参不定根系与栽培人参中功能基因表达

3.1.6 人参单体皂苷与功能基因的相关性分析

3.1.7 人参不定根系与栽培人参总抗氧化活性（FRAP法）的比较

3.1.8 小结

3.2 人参、三七土壤微生物及内生菌群落多样性

3.2.1 不同产地人参、三七根中皂苷含量

3.2.2 不同产地人参土壤细菌的物种多样性和群落结构分析

3.2.3 不同产地人参土壤真菌的物种多样性和群落结构分析

3.2.4 不同产地人参内生细菌的物种多样性和群落结构分析

3.2.5 不同产地人参内生真菌的物种多样性和群落结构分析

3.2.6 不同产地三七土壤细菌的物种多样性和群落结构分析

3.2.7 不同产地三七土壤真菌的物种多样性和群落结构分析

3.2.8 不同产地三七内生细菌的物种多样性和群落结构分析

3.2.9 不同产地三七内生真菌的物种多样性和群落结构分析

3.2.10 人参和三七微生物的汇总

3.2.11 微生物的筛选及鉴定

3.2.12 小结

3.3 优势菌C. globosum对人参不定根的代谢调控研究

3.3.1 C. globosum菌丝体对人参不定根生物量和人参皂苷含量的影响

3.3.2 C. globosum孢子浓度对人参不定根生物量和人参皂苷含量的影响

3.3.3 固定化C. globosum与人参不定根共培养体系的可行性

3.3.4 固定化C. globosum与人参不定根共培养体系的条件优化

3.3.5 固定化C. globosum对人参不定根中信号分子含量的影响

3.3.6 固定化C. globosum对人参不定根中抗性基因含量的影响

3.3.7 固定化C. globosum对人参不定根中功能基因含量的影响

3.3.8 共培养发酵液代谢物分析

3.3.9 特征代谢物对人参不定根皂苷含量的影响

3.3.10 小结

4 结论

5 展望

6 参考文献

7 攻读硕士学位期间发表论文情况

8 致谢

附录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 梁文霞

导师: 满淑丽

关键词: 人参,不定根系,优势菌株,诱导子,诱导机制

来源: 天津科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,农业基础科学,农艺学,农作物,农作物

单位: 天津科技大学

基金: 国家自然科学基金(81703639),中央重大增减项目(2060302-1604-05)

分类号: S567.51;S567.236;S154.3

DOI: 10.27359/d.cnki.gtqgu.2019.000433

总页数: 129

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人参不定根培养体系的建立与人参和三七土壤微生物的分析及代谢调控研究

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