口蹄疫病毒非结构蛋白抗体时间分辨荧光免疫分析检测方法的建立

论文摘要

为建立快速定量检测羊血清中口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的方法,本研究通过优化抗原表达条件等步骤,在大肠杆菌原核表达系统中获得了可溶性的3A-3B1-3B2融合蛋白,基于纯化的可溶性融合蛋白建立了口蹄疫病毒非结构蛋白抗体时间分辨荧光免疫分析检测试剂盒。该方法能够检测羊血清中的口蹄疫病毒非结构蛋白抗体,敏感性高,特异性强,对其他相关的羊类病原无交叉反应,其组内与组间变异系数分别低于10%和15%,具有良好的重复性。对300份临床血清样品进行检测,同Procheck公司的口蹄疫非结构蛋白抗体试剂盒进行比较,阳性样品符合率为98%,阴性样品符合率为92%,总符合率为95%。重复性试验组内与组间变异系数均小于10%。口蹄疫病毒非结构蛋白抗体时间分辨荧光免疫分析检测方法同传统的ELISA方法相比,特异性相当、敏感性更高,操作简单、快速,具有较高的应用推广价值。

论文目录

1材料与方法

1.1材料

1.2目的基因片段的获得

1.3目的基因的扩增与融合

1.4重组蛋白可溶性诱导表达条件的筛选

1.5重组蛋白3A-3B1-3B2的表达与纯化

1.5.1树脂的预处理

1.5.2挂柱

1.5.3重组蛋白的洗杂和洗脱

1.5.4蛋白的收获

1.6纯化后蛋白的抗原性分析（Dot-ELISA检测）

1.7铕标记抗体结合物的制备

1.7.1家兔抗山羊二抗的预处理

1.7.2家兔抗山羊二抗的标记

1.7.3铕标记家兔抗山羊二抗的纯化

1.7.4铕标稀释液的配制

1.7.5铕标结合物的配制

1.7.6标记物的保存

1.8 3A-3B1-3B2抗原的包被和封闭

1.9铕标记家兔抗山羊二抗最适工作浓度的确定

1.10样品稀释度的确定

1.11抗原最佳反应时间的选择

1.12阴阳性临界值的确定

1.13特异性试验

1.14敏感性试验

1.15重复性试验

1.16符合性试验

2结果

2.1 SDS-PAGE分析

2.2纯化后蛋白的抗原性分析（Dot-ELISA检测）

2.3 3A-3B1-3B2抗原最佳包被浓度与铕标二抗最佳稀释浓度的选择

2.4样品稀释度

2.5待检抗体反应时间的选择

2.6铕标二抗反应时间的选择

2.7阴阳性临界值的确定

2.8特异性试验

2.9敏感性试验

2.10重复性试验

2.11符合性试验

3讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 孙雨,宋晓晖,肖颖,毕一鸣,王睿男,蒋菲,张存瑞,王旭,杨林,王传彬

关键词: 口蹄疫病毒,非结构蛋白,可溶性表达与纯化,时间分辨荧光免疫分析

来源: 中国兽医科学 2019年07期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国动物疫病预防控制中心,重庆动物疫病预防控制中心

基金: 国家重点计划研发项目(2016YFD0501504)

分类号: S852.65

DOI: 10.16656/j.issn.1673-4696.2019.0117

页码: 812-820

总页数: 9

文件大小: 1150K

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