李纪鹏[1]2005年在《TGF-β1修饰未成熟树突状细胞在诱导大鼠小肠移植免疫耐受中的实验研究》文中研究指明器官移植在治疗某些终末期疾病上取得了巨大的成就,成为医学界令人瞩目的领域之一,但组织器官移植后排斥反应等始终是困扰人们的难题。在防治移植排斥的研究和临床实践中,强有力的免疫抑制剂对于保持移植物的存活状态起到了举足轻重的作用。但是,大量免疫抑制剂的使用,除本身诸如升高血压、肝肾毒性等毒副作用外,随着用药时间的延长,免疫抑制剂所引起严重的机会感染和恶性肿瘤的发生,以及移植器官过早失功等矛盾亦渐渐突出。因此,当今器官领域所面临的最大难题是如何诱导移植免疫耐受,防止移植物排斥。近年来,随着对抗原提呈细胞(APC)特别是树突状细胞的深入研究,发现树突状细胞不仅是最有效的抗原提呈细胞而且树突状细胞也是唯一能激活初始T细胞的抗原提呈细胞,因而调控或干扰DC致敏途径有可能诱导免疫耐受,延长移植物存活时间,同时新的免疫因子的发现以及体外培养树突状细胞技术的成熟,用基因修饰的树突状细胞诱导移植免疫耐受成为可能。而TGF-β 1是一种强效免疫抑制因子,广泛参与免疫系统细胞之间的相互作用,影响胸腺细胞,自然杀伤细胞的增殖分化,干扰B细胞各种免疫球蛋白的产生和转换,并通过直接,间接影响IL-1,IL-2,IFN-γ而起到免疫抑制作用,同时其还可通过抑制DC表面MHC抗原,协同刺激分子表达,降低DC的抗原呈递功能,干扰DC分化成熟诱导供者特异性移植耐受。
孙家乾[2]2004年在《未成熟树突状细胞诱导大鼠小肠移植免疫耐受的实验研究》文中认为目的 一、通过改进外科技术，探讨建立一种稳定和实用的大鼠异位全小肠移植(SBT)模型方法：叁袖套血管吻合法 二、参照树突状细胞(DC)经典分离诱导方案，从大鼠骨髓分离DC及前体，培养扩增未成熟树突状细胞(imDC)。 叁、用培养扩增的供者imDC预处理受者，复制大鼠SBT模型，术后观察受者一般情况及移植肠存活时间，检测移植术后移植肠的排斥反应分级。 方法 实验分叁部分。 一、SBT部分：将60只Wistar大鼠作为受体随机分为实验组(30只)和对照组(30只)，另取60只Wistar大鼠作供体，行Wistar大鼠同系小肠移植。实验组受体鼠给予叁袖套血管吻合法，对照组受体鼠给予经典血管吻合法，比较两组手术结果。 二、imDC培养部分：采用直接分离诱生法：在经典分离诱导方案(GM-CSF+IL-4)的基础上，培养第5天分成两组：IL-4组和IL-10组。IL-4组继续用经典方案培养，IL-10组加入IL-10抑制大鼠骨髓来源DC的成熟，制备imDC，光镜观察DC形态，用FCM检测所得DC表型。 直接分离诱生法：低渗裂解红细胞，特异T、B细胞单抗、补体依赖的细胞毒性作用破坏T、B淋巴细胞、巨噬细胞、血小板等其它杂项细胞，最后阴性选择留下DC及前体细胞，再利用DC的弱粘附性，将DC及前体从血液或骨髓液中分离出来，然后加入细胞因子培养扩增。 叁、imDC干预SBT部分：将24只SD大鼠作为受体随机分为空白对照组、CsA组、imDC组、CsA+imDC组，每组6只，另取24只Wistar大鼠作供体。空白对照组只行SBT，不作干预(预处理)；imDC组用培养的Wistar大鼠的imDC预处理SD大鼠，CsA组用CsA预处理SD大鼠，imDC+CsA组用CsA预处理SD大鼠，行同种异体SBT移植，术后观察受体鼠一般情况及移植肠存活时间，术后第3、5、7天分别取移植小肠粘膜行组织病理检查。 结果 一、SBT部分： 1。实验组30例手术，成功27例，失败3例，手术成功率为90%，并发症3例;受体动脉静吻合时间8士2分钟，移植肠温缺血时间10士Zmin，受体手术时间60士10分钟，总手术时间120士ZOmin。 对照组30例手术，成功24例，失败6例，手术成功率为80%，并发症8例;受体动脉静吻合时间38士5分钟，移植肠温缺血时间22士smin，受体手术时间100士15分钟，总手术时间170士3Omin。 2.和对照组比较，实验组动静脉吻合时间、移植肠温缺血时间及受体手术时间比较有显着性差异(P<0.01)。 3.两组手术成功率、并发症发生率、术后体重变化无显着性差异 (P>0 .05)。 二、imDC培养部分: 1.DC的生长情况和形态:DC在第5天出现毛刺状细胞，随着培养时间的延长，此类细胞数量增多，至第13天，I L4组细胞形态均一、毛刺状聚集成簇;IL10组毛刺状细胞和聚集体不明显。 2.DC的纯度、表型:IL一4组DC表面表达大鼠特异性标志OX62的细胞比例为81.30%，MHC一11(oX6)表达水平为63.0%;ILlo组DC表面0X62的细胞比例为78.30%，0X6表达水平为30.03%。 两组OX62表达水平比较无显着性差异(P>0.05)，说明IL10不影响DC的分化;两组MHC一Il(0X6)表达水平比较有非常显着性差异(P<0.01)，说明IL一10可抑制DC的成熟。 叁、imDC干预SBT部分: 1动物存活与一般状况空白对照组大鼠均于6一7天间死亡，死于排斥反应，平均存活时间为(6.83士1.17)天。CsA组大鼠移植肠平均存活时间为(13.17士1.17)天，imDC组大鼠移植肠平均存活时间为(2 0.50士3.02)天，csA+i mDC组大鼠移植肠平均存活时间为(26.17士2.14)天，各组间移植肠存活时间比较均有非常显着性差异(P<0.01)。 2移植肠的肉眼所见在切取移植肠时，观察到空白对照组术后第3天移植肠的肉眼观同imDC组，术后第5天，移植肠略苍白，肌张力减弱，肠腔扩大，有纤维素样粘连。术后第7天，移植肠严重粘连成包块状，移植肠苍白，无肌张力，肠腔进一步扩大，肠壁菲薄，内有大量脓性、干酪样物质，移植肠系膜淋巴结肿大.CsA组、imDC组、imDC+CsA组移植肠肠系膜 一5-血管搏动明显，移植肠红润，有肌张力，肠腔内有少量或无肠液分泌，术后第10天仅有少量的纤维素样粘连。 3病理学检查空白对照组大鼠术后第3天移植肠的病理改变符合轻度排斥的诊断标准，第5天符合中度排斥的诊断标准，第7天符合重度排斥的诊断标准。CsA组、imDC组、imDC+CsA组大鼠术后第3天移植肠的病理改变为:肠粘膜绒毛轻度畸形，间质轻度水肿及少量炎细胞浸润，绒毛中轴乳糜管扩张，无排斥征象。第5、7天有部分移植肠病理符合轻度排斥诊断标准，术后第10天的病理表现较第7天有所改善。 结论 一、叁袖套法血管吻合法行大鼠异位SBT操作简便、并发症少，受体动静脉吻合时间、移植肠温缺血时间及受体手术时间明显缩短，是一种良好的研究SBT的实验模型。 二、直接分离诱生法可以从大鼠骨髓中可以获得大量较高纯度imDC。直接分离部分可以从大鼠骨髓中分离出纯度较高的DC及其前体，细胞因子GM一CSF、IL一4可体外诱生imDC并扩增，IL一10可有效抑制imDC成熟。 叁、imDC免疫大鼠可诱导免疫耐受、减
戴向晨[3]2005年在《IDO抑制小鼠小肠移植急性排斥反应的实验研究》文中进行了进一步梳理本课题旨在研究小鼠骨髓和脾脏树突状细胞(dendritic cells,DC)吲哚胺2,3双加氧酶(Indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)的表达情况及对同种异系T淋巴细胞增殖的作用。使用高表达IDO的供体DC对受体进行术前输注,从中探讨其在移植排斥反应中的作用及机理,在此基础上进一步联合应用中药青藤碱,观察两者对于移植排斥反应的影响。 第一部分 小鼠DC的IDO表达及对T细胞增殖的影响 目的:研究小鼠骨髓和脾脏DC的表型、IDO的表达情况及其对同种异系T淋巴细胞增殖的作用。方法:分离诱生法培养小鼠骨髓和脾脏DC,流式细胞仪检测DC的表型,RT-PCR、Western Blot和毛细管电泳等方法测定DC在干扰素γ(Interferon-γ,IFN-γ)诱导前后的IDO表达水平及活性,并通过单向混合淋巴细胞培养观察DC在IFN-γ诱导前后刺激同种异系T淋巴细胞增殖能力的变化。结果:从每只小鼠中平均可获得1-2×10~7个骨髓DC和3-5×10~6个脾脏DC。均具有典型的树枝状突起。两类DC的MHCⅡ、CD11_c、CD80和CD86阳性表达率无明显差异(P>0.05),脾脏DC的CD8_α阳性表达率(15.46±0.85%)较骨髓DC(1.68±0.16%)明显增高(P<0.01)。在骨髓和脾脏DC中,IDOmRNA和蛋白表达水平相似,且在IFN-γ诱导后表达水平均相应升高。脾脏DC分泌的IDO具有将色氨酸分解成犬尿氨酸的活性,在IFN-γ诱导后该活性增强;而IFN-γ诱导前后的骨髓DC所分泌的IDO均只有很微弱的活性。脾脏DC较骨髓DC对同种T细胞增殖的刺激能力明显降低,在IFN-γ诱导后进一步降低,在加入IDO的特异性抑制剂1-甲基色氨酸(1-methyl-tryptophan,1-MT)后其刺激能力与骨髓DC无明显差异。结论:小鼠脾脏DC与骨髓DC的不同之处在于其有15%左右为CD8_α~+DC并可以表达有功能的活性IDO,活性IDO可能为CD8_α~+DC分泌。IFN-γ可诱
方航荣[4]2008年在《hIL-10基因修饰树突状细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究》文中认为目的建立体外培养、诱导和扩增DA(Dark Agouti)大鼠骨髓来源的树突状细胞的方法;建立改良的大鼠原位肝移植模型和急性排斥反应模型,用hIL-10基因修饰大鼠骨髓来源的不成熟树突状细胞(imDC);探讨其诱导同种异体大鼠原位肝移植免疫耐受的情况。方法1.培养、诱导和扩增DA大鼠骨髓来源的DC,经形态学、免疫表型及功能鉴定后,将pIRES2-EGFP- hIL-10质粒转染imDC,检测hIL-10在imDC中的表达。2.建立改良的大鼠原位肝移植模型和DA大鼠→Lewis大鼠急性排斥反应模型:在原二袖套法的基础上,采用快速切取供肝,一针法连续缝合肝上下腔静脉以及对出血点进行热止血等方法,进行120例大鼠原位肝移植,并观察术后存活率。3.行以DA大鼠为供体、近交系Lewis大鼠为受体的同种异体原位肝移植100例,随机均分为5组:未注射DC组(对照组)、mDC组、imDC组、空载体组、及hIL-10转染组;分别于移植前5d每天给Lewis大鼠腹腔注射mDC、imDC、空载体转染的imDC和hIL-10修饰的imDC各2×106个,于肝移植术后3d、7d、10d各处死4只,观察外周血肝功能变化(ALT和TBIL),肝脏病理改变,外周血清细胞因子情况,各组除去技术死亡的受鼠,将余下受鼠作生存分析,死亡时取肝脏行病理组织学检查。结果1.成功建立了体外大量培养、诱导及扩增大鼠骨髓来源DC的方法;经倒置相差显微镜、透射电镜、扫描电镜及流式细胞仪鉴定,证实所培养细胞为DC。形态学结果显示:DC形态不规则,细胞核大而偏位,细胞表面可见细长树枝状突起。免疫表型结果显示:mDC和imDC表面均表达表面分子OX62,而共刺激分子CD86在mDC呈高表达,在imDC呈低表达。混合淋巴细胞反应(MLR)结果显示:imDC刺激同种异体T淋巴细胞的能力明显弱于mDC(P=0.005)。pIRES2-EGFP- hIL-10质粒经基因测序显示其序列与Pubmed基因库的hIL-10序列相符合;经PCR鉴定示在540bp处有明显的条带。荧光显微镜观察显示pIRES2-EGFP- hIL-10质粒转染imDC后可见黄绿色荧光。流式细胞术显示转染后DC表面分子CD86和CD80的表达未受影响。转染后MLR显示,hIL-10转染组的imDC对T细胞的增殖反应均弱于imDC组和空载体组(P=0.024和P=0.033)。ELISA检测IL-10组的hIL-10表达明显高于mDC组、imDC组及空载体组(P=0.004、0.004及0.003);经Westen-Blot检测有hIL-10蛋白表达。2.成功建立改良的大鼠原位肝移植模型和急性排斥反应模型。3.活体观察:移植后的肝脏病理组织学切片显示IL-10组术后仅有较少量的单核细胞浸润,RAI评分2～5分,属非确定型急性排斥反应到轻度急性排斥反应,10d开始出现肝细胞再生,有少量的中性粒细胞浸润。肝功能示IL-10组在7d、10d时,肝功能有所恢复,但与imDC组及空载体组相比差异无统计学意义。ELISA检测示,术后7d,IL-10组的血清IL-12浓度均低于对照组、mDC组、imDC组及空载体组(P为0.000、0.000、0.005及0.008)。IL-10组中位生存期40d均长于imDC组(23d)和空载体组(25d)(P均为0.002)。结论1.本实验通过运用大鼠淋巴细胞分离液和培养过程的手法筛选相结合,能培养、诱导、扩增大量的DC;hIL-10基因转染imDC能够获得有效的表达,转染后对imDC表型没有明显影响;hIL-10基因转染可明显降低imDC对同种异体T淋巴细胞的反应性。2.经改良的大鼠原位肝移植方法,手术时间短,成功率高,稳定可靠,建立了比较稳定的大鼠原位肝脏移植模型,可满足本实验的要求。3.hIL-10基因修饰的imDC能诱导同种异体大鼠肝移植免疫耐受,显着延长同种异体肝移植大鼠的生存期。
杨海燕[5]2007年在《树突状细胞诱导半相合骨髓移植免疫耐受的实验研究》文中指出目的探讨利用未成熟树突状细胞诱导半相合骨髓移植免疫耐受的疗效,寻找防治骨髓移植免疫排斥反应的新方法。方法①以雄性SD大鼠为骨髓移植供鼠,以雄性SD大鼠与雌性Wistar大鼠的杂交雌鼠(F1雌鼠)为骨髓移植受鼠建立半相合骨髓移植动物模型。②用供鼠的外周血在体外经细胞因子rmGM-CSF、rmIL-4诱导培养7天收获未成熟树突状细胞。③实验组受鼠10只,接受骨髓移植+供鼠来源的未成熟树突状细胞输注;对照组受鼠10只,只接受骨髓移植,无未成熟树突状细胞的输注;观察比较aGVHD的发病情况。结果①观察至移植后+40天,存活的16只受鼠中有15只表达SRY基因。②用供鼠外周血细胞诱导培养imDC的过程中,经动态跟踪观察显示:培养细胞的形态学特点符合未成熟树突状细胞的形态学特点。③实验组受鼠的aGVHD发生率显着低于对照组(60%VS100%)。④观察至移植后+40天,实验组受鼠的临床aGVHD评分显着低于对照组(2.7±1.0 VS 6.9±1.5);实验组受鼠的肝脏、小肠病理GVHD严重程度显着低于对照组。结论①利用SD雄鼠和F1雌鼠(雄性SD大鼠与雌性Wrist大鼠的杂交雌鼠)建立半相合骨髓移植动物模型进行有关研究是可行的。②利用大鼠外周血诱导培养未成熟树突状细胞可用于其诱导移植免疫耐受性的研究。③未成熟树突状细胞可降低大鼠半相合骨髓移植后aGVHD的发生率、减轻大鼠半相合骨髓移植后aGVHD的病情。
杨洋, 沈中阳, 宋红丽[6]2013年在《树突状细胞诱导小肠移植免疫耐受的研究进展》文中研究表明目前,对于小肠功能衰竭合并全胃肠外营养(total parenteral nutrition,TPN)并发症的患者,小肠移植已成为公认的唯一能够挽救生命的治疗手段。随着新型免疫抑制剂的应用和外科技术的改进,临床小肠移植疗效得到很大改善。根据第十二届世界小肠移植大会报告(www.isbts2011.org)显示,1985年4月-2011年8月,全球共有79个移植中心完成
杨晓俊[7]2010年在《未成熟树突状细胞分泌的exosomes延长大鼠小肠移植受体的存活时间》文中研究说明未成熟树突状细胞分泌的exosomes延长大鼠小肠移植受体的存活时间第一章大鼠小肠移植模型的建立目的建立稳定而可靠的大鼠异位节段性小肠移植模型。方法近交系F344大鼠为供体,近交系Wistar大鼠为受体。取带血管的10cm-15cm左右小肠段作为供肠,带部分腹主动脉的肠系膜上动脉与受体肾下腹主动脉行端-侧吻合,供体门静脉与受体肾下下腔静脉行端-侧吻合。供肠近端结扎后固定于腹壁,远端肠管右下腹壁造瘘。结果共进行了56次正式实验,在未用免疫抑制剂的情况下,50例受体存活时间超过3天,造模成功率为89.3%。供体平均手术时间(37.3±1.6)min,受体平均手术时间为(57.3±4.1)min,其中动脉吻合(10.4±1.6)min,静脉吻合(8.9±0.7) min,移植小肠冷缺血时间(21.9±2.1) min,热缺血时间(19.3±2.0) min。受体大鼠(阴性对照组)生存时间最短为5d,最长为8d,平均(7.0±0.6)d。结论采用本方法建立的大鼠小肠移植模型稳定、可靠、成功率高,为后续实验打下了基础。第二章未成熟树突状细胞(imDC)分泌的exosomes制备与鉴定目的探讨体外诱导和扩增大鼠骨髓来源imDC,分离纯化imDC分泌的exosomes(imDex)的方法,并从形态学、分子表型和免疫学功能等方面对imDex予以鉴定。方法无菌条件下获取大鼠骨髓前体细胞,在GM-CSF(5ng/ml)+IL-4(5ng/ml)条件下进行体外诱导、扩增,隔日半量换液,第6天收获细胞。通过倒置显微镜及电镜观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞表面分子表达情况,ELISA检测细胞培养上清细胞因子含量,鉴定收获的细胞是否为imDC。再此基础上,收集培养6天的imDC细胞上清,超速离心法分离imDex,膜超滤离心法纯化除菌。透射电镜观察imDex形态,流式细胞仪检测imDex膜表面分子表达情况,混合淋巴细胞反应(MLR)进行imDex功能学检测。结果培养至第6天可获得imDC。电镜下可见细小树突状突起,流式细胞仪检测表明imDC低表达MHCII、CD80、CD86及CD40分子,ELISA检测显示imDC分泌促炎性细胞因子IL-12p70能力显着低于成熟DC(mDC)。超速离心imDC细胞上清可分离获得imDC分泌的imDex。膜超滤离心纯化除菌后透射电镜下观察可见imDex为直径介于50-100nm,具有典型脂质双分子层结构的小囊泡。流式细胞仪检测表明imDex高表达MHCII分子,低表达或不表达CD80、CD86及CD40分子。MLR检测显示imDex在imDC的辅助下刺激T淋巴细胞增殖的能力显着低于成熟DC(mDC)分泌的exosomes(mDex)。结论本法是体外制备大鼠骨髓来源imDC分泌的imDex的有效方法,为后续实验打下了基础。第叁章ImDC分泌的exosomes延长大鼠小肠移植受体的生存时间及相关机制目的探讨静脉输注供体imDex能否有效的延长大鼠小肠移植受体的存活时间,并进一步研究imDex诱导移植免疫耐受的可能机制。方法供体为F344大鼠,受体为Wistar大鼠,供受体间进行异位节段性小肠移植。首先根据受体接受不同剂量供体来源的imDex处理将受体大鼠分为5组,A组(未处理组,n=6):移植前1周注射1ml生理盐水;B组(n=6):移植前1周注射含供体1μg imDex混悬液1ml;C组(n=6):移植前1周注射含供体10μg imDex混悬液1ml;D组(n=6):移植前1周注射含供体20μg imDex的混悬液1ml;E(n=6)组:移植前1周注射含供体50μgimDex的混悬液1ml。通过对不同剂量的供体imDex延长受体大鼠生存时间的比较,筛选出最佳剂量。再根据最佳剂量,重复大鼠小肠移植实验及分组:未处理组(n=6):移植前1周经阴茎背静脉注射1ml生理盐水;最佳剂量组(n=6):移植前1周经阴茎背静脉注射含供体最佳剂量imDex混悬液1ml。移植术后当未处理组出现移植排斥的表现是,收取各组大鼠的外周血、脾脏及移植小肠分析。ELISA法检测各组受体大鼠血清细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α及TGF-β含量,混合淋巴细胞反应(MLR)检测各组受体大鼠脾脏T淋巴细胞增殖能力,并ELISA法检测MLR上清细胞因子IL-10及IFN-γ含量。流式细胞仪检测各组受体大鼠脾脏T淋巴细胞中CD4+CD25+T细胞比例,实时定量PCR检测各组受体大鼠脾脏T淋巴细胞Foxp3mRNA表达。常规病理切片(HE染色)观察各组移植小肠病理变化。结果A、B、C、D及E组受体平均存活时间分别为(7.0±0.6)天、(7.3±1.0)天,(9.8±1.2)天,(14.5±1.0)天和(7.8±1.2)。C组(10μgimDex)较A组(未处理组)受体存活时间轻度升高,差异有统计学意义(P<0.05), D组(20μgimDex)受体存活时间显着高于C组(P<0.05),B组(1μgimDex)及E组(50μgimDex)受体存活时间较A组差异无统计学意义(P>0.05)。ELISA检测显示imDex(20μg)治疗组血清促炎性细胞因子IL-2、IFN-γ及TNF-α较未处理组显著降低,而抑炎性细胞因子TGF-β含量则显著升高。MLR结果显示imDex(20μg)治疗组受体大鼠脾脏T淋巴细胞在同种异体抗原的刺激下增殖受到显着抑制,促炎性细胞因子IFN-γ分泌较未处理组显著降低,而抑炎性细胞因子IL-10分泌显着升高。流式细胞仪及实时定量PCR检测imDex(20μg)治疗组脾脏CD4+CD25+T细胞比例及Foxp3mRNA表达较未处理组显着升高。移植后第7天阴性对照组病理为急性重度排斥反应的表现,造瘘口坏死,闭塞,而imDex(20μg)治疗组为轻度排斥反应的表现,造瘘口粘膜红润,轻度水肿,分泌少许肠液。结论ImDC分泌的imDex可抑制大鼠小肠移植后的急性排斥反应,降低了受体血清促炎性细胞因子的变化,延长了受体存活时间。受体脾脏CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞比例升高,进而抑制受体初始T淋巴细胞增殖可能是imDex诱导移植免疫耐受的机制之一。
张国强[8]2009年在《经脾脏注射未成熟树突状细胞对大鼠小肠移植免疫耐受诱导作用的研究》文中研究指明目的:研究经脾脏注射骨髓来源的未成熟树突状细胞(iDC)对大鼠小肠移植免疫耐受的诱导。方法:分离供体F344大鼠骨髓来源DC细胞前体,经GM-CSF、IL-4体外刺激培养6天后,检测细胞表面共刺激分子及MHC表达,鉴定是否为imDC;健康成年F344大鼠为供体,SD大鼠为受体。随机分为四组(n=10),A组(阴性对照组):移植前7天,受体经阴茎背静脉注射生理盐水1ml;B组(阴性对照组):移植前7天,受体经脾脏注射生理盐水1ml;C组(iDC阴茎背静脉注射组):移植前7天,受体经阴茎背静脉注射供体的iDC,细胞数为2×106个;D组(iDC脾脏注射组):移植前7天,受体经脾脏注射供体的iDC,细胞数为2×106个。四组大鼠注射后1周后行大鼠异位节段性小肠移植术。观察:1、大鼠移植后存活情况;2、移植后7天移植肠病理学情况;3、同时TUNNEL法检测移植肠的细胞凋亡情况。结果: D组大鼠移植小肠存活时间为(17.50±1.05)d,较A组(7.17±1.17)d、B组(7.33±1.51)d、C组(12.83±2.79)d显着延长;D组移植小肠炎性细胞浸润、黏膜组织结构破坏程度明显低于A、B、C组;D组小肠粘膜上皮细胞凋亡数(9.3±1.7)个,相对于A组(25.3±4.6)个、B组(25.5±4.7)个、C组(16.5±2.1)个,移植肠粘膜上皮细胞凋亡数显着降低。结论:经脾脏注射供体来源的未成熟树突状细胞,可在一定程度上诱导受体产生免疫耐受,延长受体大鼠小肠移植术后的存活时间。D组移植小肠炎性细胞浸润、黏膜组织结构破坏程度和黏膜细胞的凋亡数目明显低于A、B、C组。
王海权[9]2006年在《联合应用CD40L单克隆抗体和未成熟树突状细胞对小肠移植免疫耐受的实验研究》文中研究表明目的：研究供体骨髓来源的未成熟树突状细胞(imDC)联合CD40L单克隆抗体(CD40L mAb)诱导同种异体大鼠节段性小肠移植免疫耐受中的作用。 方法：190只SD大鼠施行异位节段性小肠移植，手术显微镜下门静脉-下腔静脉端侧吻合、腹主动脉端侧吻合建立同种异体大鼠节段性小肠移植模型；分离供体大鼠骨髓来源DC细胞前体，经GM-CSF、IL-4体外刺激培养6天后，检测细胞表面共刺激分子及MHC表达，鉴定是否为imDC；实验动物随机分为3组，每组15对，进行不同预处理后进行小肠移植。A阴性对照组，受体不经任何处理，即行小肠移植术；B组：小肠移植前7天，每只受体经阴茎背静脉注射供体的未成熟DC，细胞数为2×10~6个；C组：小肠移植前7天，每只受体经阴茎背静脉注射供体的未成熟DC，细胞数为2×10~6个。同时腹腔注射CD40L mAb 200ug／只。B、C组1周后行大鼠异位节段性小肠移植术。观察：1、大鼠移植后存活情况；2、移植后3、5、7、14天移植肠病理学情况；3、同时TUNNEL法检测移植肠的细胞凋亡情况。4、移植后3、5、7、14天取受体血清，检测TH1、TH2细胞因子IL-2、IL-10和INF-a的浓度。 结果：采用近交系SD大鼠建立大鼠同种同基因大鼠节段性小肠移植模型，共实施手术95次，50次为预实验，预试验手术成功率54％。45次正式实验，正式实验手术成功率为86.7％。其中供体平均手术
朱春富[10]2009年在《MyD88基因沉默的不成熟树突状细胞延长大鼠小肠移植受体的存活时间》文中研究表明第一章大鼠小肠移植模型的建立目的建立稳定而可靠的大鼠异位节段性小肠移植模型。方法近交系F344大鼠为供体,封闭群SD大鼠为受体。取带血管的10cm左右小肠段作为供肠,带部分腹主动脉的肠系膜上动脉与受体肾下腹主动脉行端-侧吻合,供体门静脉与受体肾下下腔静脉行端-侧吻合。供肠近端结扎后固定于腹壁,远端肠管右下腹壁造瘘。结果共进行了52次正式实验,43例手术成功,成功率82.7%。供体平均手术时间(42.1±8.7)min,受体平均手术时间为(67.6±11.5)min,其中动脉吻合(10.5±3.7)min,静脉吻合(12.7±3.6) min。移植小肠冷缺血时间(21.9±7.6) min,热缺血时间(23.9±3.1) min。受体大鼠生存时间最短4.5d,最长10 d,平均(5.9±1.9)d。结论采用本方法建立的大鼠小肠移植模型稳定、可靠、成功率高。第二章不成熟树突状细胞(iDC)的培养、扩增与鉴定目的探讨体外诱导和扩增大鼠iDC的方法,并从形态学、表型和免疫学功能等方面予以鉴定。方法无菌条件下获取大鼠骨髓前体细胞,在GM-CSF(5ng/ml)条件下进行体外诱导、扩增。隔日半量换液,第6天收获细胞。显微镜下观察形态学变化,流式细胞仪检测细胞表面分子表达情况,混合淋巴细胞反应进行功能学检测。结果培养至第6天可获得iDC。电镜下可见细小树突状突起,流式细胞仪测定表明iDC低表达MHCII、CD80和CD86;iDC刺激T淋巴细胞增殖的能力显着低于成熟DC(mDC)。结论本法是体外诱导扩增大鼠骨髓来源iDC的有效方法。第叁章MyD88-siRNA诱导iDC MyD88基因沉默目的应用RNA干扰(RNAi)方法诱导iDC MyD88基因沉默。方法以阳离子脂质体作为载体,将化学合成的小干扰RNA(siRNA)体外转染iDC。转染后检测转染效率、细胞活力、细胞表面分子表达,RT-PCR和Western blot法测定MyD88表达水平。结果在siRNA转染浓度为1μg/500μl条件下,转染效率为(85.6±3.5)%,转染iDC低表达MHC II、CD80和CD86;转染iDC MyD88基因mRNA转录及MyD88蛋白表达水平显着降低。结论化学合成siRNA在阳离子脂质体介导下可以高效地进入iDC并能够有效诱导特异基因沉默,同时转染过程并不诱导iDC成熟。第四章MyD88基因沉默的iDC延长小肠移植受体的生存时间目的探讨静脉输注MyD88基因沉默的iDC能否延长大鼠小肠移植受体的存活时间。方法供体为F344大鼠,受体为SD大鼠,供受体间进行异位节段性小肠移植。根据受体接受处理因素的不同分4组,A组:移植前1周注射1ml生理盐水;B组:移植前1周注射含2×106个未转染iDC混悬液1ml;C组:移植前1周注射含2×106个阴性对照siRNA转染iDC混悬液1ml;D组:移植前1周注射含2×106个MyD88-siRNA转染iDC的混悬液1ml。移植后观察受体的存活时间,并在适当时间取移植小肠作病理检查。结果A、B、C和D组受体平均存活时间分别为(5.9±1.9)天、(11.0±1.87)天,(10.2±1.64)天和(18.6±3.60)天。B、C两组比较差异无统计学意义(P>0.05),但显着长于A组(P<0.05); D组显着高于前叁组(P<0.05)。病理示:A(移植后第6天)、B(移植后第10天)、C(移植后第10天)叁组病理所见基本相似,皆为急性重度排斥反应的表现;D组移植后第10天标本为轻度排斥反应的表现,第19天标本呈急性重度排斥反应的表现。结论MyD88基因沉默的iDC可抑制大鼠小肠移植后的排斥反应,延长受体以及移植小肠的存活时间。第五章MyD88基因沉默对iDC免疫功能的影响目的研究MyD88-siRNA干扰对大鼠iDC免疫功能的影响,进而探讨MyD88基因沉默的iDC诱导移植免疫耐受的可能机制。方法体外培养大鼠骨髓来源iDC,进行MyD88-siRNA干扰获得MyD88基因沉默的iDC。采用ELISA法测定脂多糖(LPS)刺激下MyD88基因沉默的iDC分泌细胞因子的变化。取移植后一周受体大鼠脾脏,制备脾脏T淋巴细胞悬液,ELISA法测定T淋巴细胞分泌细胞因子的变化。采用混合淋巴细胞反应的方法检测MyD88基因沉默的iDC、未转染iDC和阴性转染iDC刺激T细胞增殖反应的能力。经静脉注射MyD88基因沉默的iDC并检测其在淋巴器官的分布情况。结果在LPS刺激下MyD88基因沉默的iDC产生促炎细胞因子IL-12和TNF-α的能力显著降低。接受MyD88基因沉默的iDC处理的受体大鼠脾脏T细胞分泌Th1型细胞因子能力显着降低,而分泌Th2型细胞因子能力显着增强。在体外,MyD88基因沉默的iDC刺激T细胞增殖的能力与未转染iDC、阴性对照siRNA转染的iDC无显着差异。在体内,MyD88-siRNA转染iDC和阴性对照siRNA转染的iDC在体内各淋巴器官分布无显着差异。结论分泌促炎因子尤其是IL-12能力的下降,并进而诱发受体初始T细胞发生Th2极化并大量分泌Th2型细胞因子可能是MyD88基因沉默的iDC诱导移植免疫耐受的重要机制之一。
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[9]. 联合应用CD40L单克隆抗体和未成熟树突状细胞对小肠移植免疫耐受的实验研究[D]. 王海权. 南京医科大学. 2006
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