猪源大肠杆菌对达氟沙星敏感性临界值及其耐药机制研究

论文摘要

大肠杆菌属于肠杆菌科的一种革兰氏阴性细菌,存在于人类和动物的胃肠道。大肠杆菌为条件性致病菌,有些血清型具有致病性,可引起畜禽严重的肠道感染和全身感染等,给养殖业造成了巨大经济损失。通过食物链或环境,大肠杆菌对人类的健康和公共卫生也会产生严重的危害。达氟沙星属于氟喹诺酮类抗菌药物成员之一,属于畜禽专用抗菌药物,在控制畜禽大肠杆菌等敏感细菌引起的感染性疾病方面发挥了重要的作用。最初认为氟喹诺酮类药物抗菌机制独特细菌很少产生耐药性,但随着长期使用以及不合理的滥用,包括大肠杆菌在内的革兰氏阴性菌对达氟沙星的耐药现象越来越严重,且与其他氟喹诺酮类药物成员之间存在严重的交叉耐药现象。因此,有效监测大肠杆菌对达氟沙星的耐药性以及制定科学合理的给药方案对耐药大肠杆菌的防控与有效治疗具有重要的理论与临床指导意义。而临界值是进行细菌耐药性监测重要的技术依据。迄今为止,全球建立敏感性判定标准最权威的两个机构欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）和美国临床及实验室标准学会（CLSI）尚未建立大肠杆菌对达氟沙星的敏感性判定标准,国内外关于大肠杆菌对达氟沙星等氟喹诺酮类抗菌药物的分子耐药机制的系统研究报道也较少。因此,本论文旨在建立达氟沙星对大肠杆菌流行病学临界值和药效学临界值;研究猪源大肠杆菌对达氟沙星等氟喹诺酮类抗菌药物的分子耐药机制;采用PK/PD同步模型优化达氟沙星治疗猪大肠杆菌病的给药方案。研究结果对达氟沙星耐药大肠杆菌的监测以及猪大肠杆菌病的有效治疗提供理论依据,在保证药物达到治疗效果的同时,最大程度减少细菌耐药性产生的机会。（1）建立达氟沙星对大肠杆菌的流行病学临界值和药效学临界值参考CLSI发布的M07-A9号文件的指导原则,采用微量稀释肉汤法测定了达氟沙星对1233株猪源大肠杆菌临床分离株的最小抑菌浓度（MIC）。用软件SPSS 22.0对MIC分布和Graphpad 6.0中的非线性最小二乘法回归对流行病学临界值（ECV）进行统计分析。本研究用仔猪血浆药物浓度数据建立猪药代动力学（PK）数据结合体外MIC值,使用Crystal Ball软件中的蒙特卡罗模拟方法建立药效学临界值(COPD)。研究结果表明:达氟沙星对大肠杆菌的MIC分布范围是0.008128μg/mL。每个MIC（0.008,0.016,0.03,0.06,0.125,0.25,0.5,1,2,4,8,16,32,64和128μg/mL）菌株数量所占的百分比分别是0.73%,3.97%,2.35%,0.73%,3.16%,7.38%,13.22%,10.62%,6.16%,5.43%,7.54%,12.98%,7.62%,8.76%和9.33%。MIC50和MIC90分别是4μg/mL和128μg/mL。MIC分布统计符合正态分布,因为偏度系数（skewness=-0.321）和峰度系数（kurtosis=-0.731）均小于1。通过统计学分析,流行病学临界值（ECV）被设定为8μg/mL。蒙特卡洛模拟结果表明当MIC=0.03μg/mL时,达氟沙星达到AUC:MIC比值至少为125的概率为92.25%。因此,COPD被定义为0.03μg/mL。（2）猪源大肠杆菌对达氟沙星等氟喹诺酮类抗菌药物的耐药机制研究分别选取来自中国7个省份的479株猪源大肠杆菌临床分离株,研究其对诺氟沙星,环丙沙星,氧氟沙星和左氧氟沙星的敏感性,这些菌株覆盖达氟沙星对大肠杆菌各个MIC分布范围（0.0075>128μg/mL）。根据敏感性的研究结果,选择来自不同省份74株对以上四种氟喹诺酮类药物均耐药的大肠杆菌进行耐药基因型研究,系统地分析了由大肠杆菌染色体突变引起的耐药机制及由质粒介导的氟喹诺酮类药物耐药机制。研究结果表明:猪源大肠杆菌对人医常用四种氟喹诺酮抗菌药物的耐药百分比与对达氟沙星耐药程度呈正相关,且这种相关性不存在地域差异。染色体上gyrA,parC,parE,marR和acrR基因发生双突变或单突变是导致大肠杆菌对氟喹诺酮类药物耐药的主要机制之一。在74株大肠杆菌临床分离株中,gyrB均未发现突变;39株细菌在gyrA发生单突变或双突变,这些是位于83位置的突变S83L和87位置的突变D87到N,Y,G或H;21株细菌的parC发生单突变或双突变,分别是S80I和E84K;有两株细菌parE发生I355T和L416F双突变,且这两株细菌gyrA发生双突变和parC发生单突变;26株细菌marR发生突变,其中25株细菌发生G123S单突变,1株发生D87N和G123S双突变;有2株细菌acrR发生了单突变,分别是V33G和S60-,这两株细菌gyrA均未发生突变。质粒上捕获的介导氟喹诺酮类药物耐药的基因包括qnrS,oqxAB和aac（6’）-Ib-cr。其中7株细菌携带qnrS基因,29株细菌携带oqxAB基因,9株细菌携带aac（6’）-Ib-cr基因,而qnrA,qnrB,qnrC,qnrD和qepA的检出率均为0。gyrA发生双突变的菌株能介导对氟喹诺酮类药物的高水平耐药,而细菌质粒上携带了qnrS,oqxAB和aac（6’）-Ib-cr基因则提升了对氟喹诺酮类药物的耐药水平。（3）达氟沙星对猪大肠杆菌的PK/PD同步模型研究在本研究的1233株大肠杆菌临床分离菌株中,在达氟沙星MIC=0.5μg/mL的菌株分布最多,随机选择其中69株大肠杆菌进行血清型测定,并通过致病性测试,选择一株细菌HP501(O158)进行后续的PD和PK/PD同步模型研究。在麻醉剂的辅助下,成功地将超滤探针植入仔猪回肠用于收集回肠超滤液。六头仔猪按经2.5 mg/kg剂量肌肉注射达氟沙星后,在不同时间点采集血浆和回肠超滤液,采用高效液相色谱法测定不同时间点血浆和回肠超滤液中的药物浓度,计算血浆和回肠超滤液的药代动力学（PK）参数。参考CLSI推荐的方法测定MH肉汤、给药前对照血浆和给药前对照回肠超滤液中达氟沙星对HP501的MIC和最小杀菌浓度（MBC）;测定MH肉汤中达氟沙星对HP501最小防突变浓度（MPC）和抗菌后效应（PAE）。分别测定MH肉汤和回肠超滤液中的达氟沙星对HP501的体外杀菌效果和半体内杀菌效果,并绘制相应的杀菌曲线。建立回肠超滤液中AUC24h/MIC和Cmax/MIC分别与log10（细菌与回肠超滤液共培养24 h后细菌数-初始细菌数,CFU/mL）的关系。分别计算回肠超滤液中达氟沙星实现抑菌、杀菌和根除细菌所需的PK/PD参数值AUC24h/MIC或Cmax/MIC,并计算相应的给药剂量及优化给药方案。将十二头健康去势仔猪连续3天每天灌胃50 mL 1010 CFU/mL HP501菌液建立大肠杆菌感染模型。将所有感染的仔猪随机分成两组。试验组（n=6）按本研究优化的剂量方案（2.42 mg/kg每12 h给药一次治疗3 d）肌肉注射给药,对照组（n=6）按临床常规推荐剂量方案（2.5 mg/kg每24 h给药一次治疗3天）肌肉注射给药。研究结果表明:仔猪按2.5 mg/kg剂量单次肌肉注射达氟沙星后,血浆和回肠超滤液中的Tmax分别是1.1 h和6.0 h;回肠的平均Cmax是血浆的13.59倍;回肠超滤液中的消除半衰期（6.84 h）高于血浆（4.94 h）。MH肉汤,给药前对照血浆和给药前对照回肠超滤液中达氟沙星对菌株HP501的MIC均为0.5μg/mL,其相应的MBC值分别为0.5、1和1μg/mL,MH肉汤中达氟沙星对HP501的MPC为4μg/mL。PAE的长短与药物的浓度及细菌在药物溶液中暴露的时间呈明显相关性。体外杀菌曲线和半体内杀菌曲线均表明达氟沙星对大肠杆菌的抗菌活性呈浓度依性,因此与达氟沙星抗菌作用最相关的PK/PD参数是AUC/MIC或Cmax/MIC。根据体内回肠超滤液中达氟沙星PK数据和半体内的MIC,相对应的半体内PK/PD数据AUC/MIC和AUC/MPC分别为170.64 h和21.33 h。回肠超滤液的浓度保持在MIC和MBC以上的时间分别为29.76 h和19.32 h。平均Cmax/MIC比和Cmax/MPC分别为13.32和1.67。回肠超滤中达氟沙星产生抑菌、杀菌和根除细菌效果的AUC24h/MIC分别为99.85h、155.57 h和218.02 h;Cmax/MIC分别为4.14、6.49和9.05。根据以上达到不同效果的AUC24h/MIC值计算得到三种不同给药剂量分别为（1.49 mg/kg、2.42 mg/kg和3.24 mg/kg）。使用Mlxplore软件模拟不同剂量方案治疗3天后发现2.42 mg/kg每12 h给药一次的杀菌效果最好。给药方案验证结果也表明以2.42 mg/kg达氟沙星的剂量方案每12 h给药一次治疗3 d后,足以清除猪肠道感染的大肠杆菌。综上所述,本研究建立的ECV为8μg/mL、COPD为0.03μg/mL。COPD远低于ECV可能是由于达氟沙星的给药剂量较低,因此本研究建议将ECV（8μg/mL）定义为猪源大肠杆菌对达氟沙星的最终敏感性临界值。对达氟沙星耐药的猪源大肠杆菌对人类医学上常用的四种氟喹诺酮类抗菌药（诺氟沙星,环丙沙星,氧氟沙星和左氧氟沙星）存在明显交叉耐药现象。猪源大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制是主要是由染色体氟喹诺酮类药物靶标基因发生突变（gyrA、parC、parE、marR和acrR双位点或单位点突变）引起以及质粒上捕获的介导氟喹诺酮类药物耐药的基因（qnrS、oqxAB和aac（6’）-Ib-cr）引起。猪回肠超滤液中能实现抑菌、杀菌和根除细菌的平均AUC24h/MIC分别为99.85、155.57和218.02 h。本研究优化的达氟沙星剂量方案为2.42 mg/kg剂量、每12 h肌肉注射一次及连续治疗3 d足以清除猪回肠中大肠杆菌的感染,且最大程度减少细菌耐药性产生的机会。

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摘要

英文摘要

缩略词表

1 引言

1.1 大肠杆菌的危害和防治

1.1.1 大肠杆菌致病性和危害

1.1.2 用于治疗肠道大肠杆菌病的抗菌药物

1.2 达氟沙星研究进展

1.2.1 化学结构

1.2.2 构效关系

1.2.3 抗菌谱和抗菌活性

1.2.4 药物代谢动力学

1.2.5 副作用

1.2.6 动物源大肠杆菌对达氟沙星的耐药性及其对人类的危害

1.3 临界值分类及其制定方法

1.3.1 流行病学/野生型临界值（ECV/COWT）

1.3.2 药效学临界值（COPD）

1.3.3 临床临界值（COCL）

1.4 大肠杆菌对氟喹诺酮类抗菌药物分子耐药机制研究进展

1.5 抗菌药物PK/PD模型研究进展

1.5.1 药代动力学

1.5.2 体外药效学

1.5.3 动物模型研究

1.5.4 PD的临床研究

1.5.5 抗菌药物PK/PD模型研究

1.6 研究目的和意义

2 材料和方法

2.1 试验材料

2.1.1 药品和试剂

2.1.2 仪器和设备

2.2 菌种和动物

2.3 达氟沙星对猪源大肠杆菌流行病学临界值的制定

2.3.1 大肠杆菌菌株的采集、分离纯化、鉴定与保存

2.3.2 达氟沙星对猪源大肠杆菌临床分离株的最小抑菌浓度（MIC）的测定

2.3.3 数据处理及流行病学临界值的制定

2.4 部分猪源大肠杆菌临床分离株血清型的鉴定

2.5 达氟沙星对猪源大肠杆菌药效学临界值的制定

8）的体外杀菌曲线'> 2.5.1 达氟沙星对JLP95（O₈）的体外杀菌曲线

2.5.2 达氟沙星在香猪血浆中的药动学特征研究

2.5.3 蒙特卡洛模拟建立药效学临界值

2.6 猪源大肠杆菌对四种氟喹诺酮类药物的交叉耐药性研究

2.6.1 菌株选择

2.6.2 猪源大肠杆菌对人类医学常用四种氟喹诺酮药物敏感性研究

2.7 猪源耐药大肠杆菌对氟喹诺酮类药物分子耐药机制研究

2.7.1 PCR扩增猪源大肠杆菌染色体上氟喹诺酮类药物靶位基因

2.7.2 PCR扩增猪源大肠杆菌质粒上介导氟喹诺酮类药物耐药的基因

2.8 达氟沙星在仔猪体内的PK/PD同步整合模型研究

158)的致病性测定'> 2.8.1 四株猪源大肠杆菌临床分离株(O₁₅₈)的致病性测定

2.8.2 达氟沙星在猪血浆和回肠液中的药动学特征

2.8.3 达氟沙星对猪源大肠杆菌菌株HP501 的体外药效学研究

2.8.4 达氟沙星对猪源大肠杆菌HP501 的体外杀菌曲线

2.8.5 达氟沙星对猪源大肠杆菌HP501 的半体内杀菌曲线

2.8.6 达氟沙星在杂交仔猪回肠液的PK/PD同步整合模型研究

2.8.7 给药方案的制定

2.8.8 给药方案治疗效果的验证

3 结果与分析

3.1 猪源大肠杆菌临床分离株的分离鉴定结果

3.2 达氟沙星对猪源大肠杆菌临床分离株的MIC测定结果

3.3 达氟沙星对猪源大肠杆菌流行病学临界值的确定

3.4 部分猪源大肠杆菌临床分离株血清型的测定结果

8）体外杀菌曲线'> 3.5 达氟沙星对猪源大肠杆菌JLP95（O₈）体外杀菌曲线

3.6 达氟沙星在香猪体内的药动学研究结果

3.6.1 达氟沙星在香猪血浆中的HPLC检测方法的确定

3.6.2 达氟沙星在香猪血浆中的药动学特征

3.7 达氟沙星对猪源大肠杆菌药效学临界值的确定

3.8 猪源大肠杆菌对人医常用四种氟喹诺酮类抗菌药物敏感性研究结果

3.9 猪源大肠杆菌对氟喹诺酮类药物耐药机制研究结果

3.10 猪源大肠杆菌临床分离株的致病性测定结果

3.11 达氟沙星在猪血浆和回肠液的药动学特征

3.11.1 猪血浆和回肠液中达氟沙星浓度测定的HPLC方法的确定

3.11.2 达氟沙星在仔猪血浆和回肠液的药动学特征

158)的体外药效学结果'> 3.12 达氟沙星对HP501(O₁₅₈)的体外药效学结果

158)的体外杀菌曲线'> 3.13 达氟沙星对HP501(O₁₅₈)的体外杀菌曲线

158)的半体内杀菌曲线'> 3.14 达氟沙星对HP501(O₁₅₈)的半体内杀菌曲线

3.15 达氟沙星在杂交猪回肠液中的PK/PD同步整合模型

3.16 给药方案的确定

3.17 给药方案的治疗效果验证结果

4 讨论

4.1 敏感性临界值的确定

4.1.1 流行病学临界值的制定

4.1.2 药效学临界值的制定

4.1.3 本研究推荐的敏感性临界值

4.2 猪源大肠杆菌对人类医学常用氟喹诺酮类药物的交叉耐药

4.3 猪源大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的分子耐药机制研究

4.4 达氟沙星在猪体内PK/PD同步模型研究

4.4.1 猪回肠超滤取样探针的安置

4.4.2 达氟沙星在杂交仔猪血浆和回肠液中的药动学特征

4.4.3 给药方案的制定

4.4.4 给药方案的验证

5 结论

致谢

参考文献

攻读博士学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 博士论文

作者: 杨雨齐

导师: 张秀英

关键词: 大肠杆菌,达氟沙星,敏感性临界值,分子耐药机制,同步模型

来源: 东北农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 东北农业大学

分类号: S852.61

总页数: 123

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猪源大肠杆菌对达氟沙星敏感性临界值及其耐药机制研究

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