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KPNA2基因表达的分析检测及与肝癌的相关性研究

2020-12-02阅读(843)

KPNA2基因表达的分析检测及与肝癌的相关性研究

论文摘要

第一章简介了基因及基因产物核酸和蛋白质的一些检测方法、原理等,阐述了基因及其产物检测在生物医学研究中的意义,对核转运蛋白（Karyopherinα2,KPNA2）的家族、结构、功能及研究进展做了综述。第二章核转运蛋白KPNA2调节一些大分子物质进行核质转运,细胞转运系统失调在肿瘤形成过程中经常被观察到,采用免疫组化检测方法对100例肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）组织和20例癌旁组织进行研究,发现肝癌组织中KPNA2较癌旁正常组织明显高表达。进一步应用聚合酶链反应（quantitative real-timepolymerase chain reaction,qRT-PCR）技术对4种肝癌细胞株（SMMC-7721,HepG2,Hep3B和Huh-7）中KPNA2基因进行mRNA量检测,结果显示KPNA2在4株肝癌株中均是高表达,提示KPNA2可能癌的发生有密切关系。第三章利用基因沉默技术可以对生物体内某个基因的功能进行靶向目的研究,RNA干扰对基因表达的抑制较化学合成方法具有高效性、特异性及稳定性,因此我们选用RNAi干扰技术。应用RNAi慢病毒载体靶向沉默两株肝癌细胞中KPNA2基因,随后采用RT-PCR技术和免疫印迹方法检测KPNA2基因在mRNA和蛋白质水平表达情况,结果表明实验组沉默KPNA2后细胞内表达受到明显抑制。MTT法检测两组细胞增殖情况,沉默KPNA2后细胞的实验组较对照组细胞增殖明显受到抑制。采用流式细胞仪检测两组肝癌细胞周期、凋亡情况,沉默细胞KPNA2基因后肝癌细胞阻滞在细胞周期的G2/M期和S期,细胞有丝分裂无法正常进行。沉默肝癌细胞中KPNA2基因的表达后,细胞凋亡率相对于对照组显著升高,提示KPNA2可能通过影响细胞周期和凋亡在肝癌细胞中发挥作用。第四章为进一步确认KPNA2的生物学功能,以HepG2细胞为成瘤细胞,分别将沉默KPNA2基因的肝癌细胞实验组和正常肝癌细胞对照组接种裸鼠皮下,建立移植型肝癌裸鼠模型,此方法周期短、成瘤率较高。每天观察成瘤情况,测量瘤体大小,最后处死裸鼠后称瘤体重。结果实验组裸鼠瘤体较对照组明显小,表明靶向沉默KPNA2基因明显抑制肝癌细胞的裸鼠成瘤能力,体内实验也证明KPNA2与肝癌发生、发展有密切关系。第五章基因生物信息学分析及KPNA2生物功能机制分析,把肝癌细胞中KPNA2基因导入Affymetrix人类基因表达谱芯片检测,分析差异基因,实验组相对于对照组,上调的基因647个,下调的基因938个。采用IPA生物信息学分析软件对表达的差异基因富集分析,结果提示G2/M期和S期细胞周期信号通路和周期相的基因富集,采用qRT-PCR和Western blot方法对关键基因表达检测验证,验证结果提示与IPA差异基因经典通路分析结果相符合。最后推测KPNA2基因可能是通过影响G2/M期、S期的细胞周期信号通路以及P53信号通路进而发挥抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用。

论文目录

  • 中文摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 绪论
  •   1.1 引言
  •   1.2 基因及其产物检测的临床意义
  •   1.3 肿瘤基因及其产物的检测方法
  •     1.3.1 免疫组织化学方法（immunohistochemistry,IHC）
  •     1.3.2 酶联免疫吸附法（ELISA法）
  •     1.3.3 原位杂交法
  •     1.3.4 Northern印迹法
  •     1.3.5 多聚酶链式反应（PCR）
  •     1.3.6 免疫印迹法（Western blot）
  •     1.3.7 流式细胞术（Flow CytoMetry,FCM）
  •     1.3.8 基于基因芯片的生物信息学分析
  •   1.4 核转运蛋白研究进展
  •     1.4.1 核转运蛋白KPNA2 功能
  •     1.4.2 核转运蛋白KPNA2 的研究进展
  •   1.5 立题背景、研究内容及创新性
  •   参考文献
  • 第二章 KPNA2 基因在肝癌组织和细胞系中的表达
  •   2.1 引言
  •   2.2 材料与方法
  •     2.2.1 主要实验材料和仪器
  •     2.2.2 实验方法
  •   2.3 结果
  •     2.3.1 肝癌组织中KPNA2 表达
  •     2.3.2 肝癌细胞株中KPNA2 基因在mRNA水平的表达
  •   2.4 讨论
  •   参考文献
  • 第三章 KPNA2 基因对肝癌细胞增殖的影响
  •   3.1 引言
  •   3.2 材料与方法
  •     3.2.1 主要实验材料和仪器
  •     3.2.2 实验方法
  •   3.3 结果
  •     3.3.1 慢病毒感染目的细胞的效率
  •     3.3.2 慢病毒有效抑制KPNA2 基因的表达
  •     3.3.3 KPNA2 基因敲减后抑制肝癌细胞生长
  •     3.3.4 KPNA2 基因敲减后抑制肝癌细胞活力
  •     3.3.5 KPNA2 基因敲减后抑制肝癌细胞克隆形成
  •     3.3.6 KPNA2 基因敲减后影响肝癌细胞周期
  •     3.3.7 KPNA2 基因敲减后诱导肝癌细胞凋亡
  •   3.4 讨论
  •   参考文献
  • 第四章 KPNA2 基因的裸鼠体内成瘤研究实验
  •   4.1 引言
  •   4.2 材料与方法
  •     4.2.1 主要实验材料和仪器
  •     4.2.2 实验方法
  •   4.3 结果
  •     4.3.1 慢病毒感染SMMC-7721 细胞的效率
  •     4.3.2 RNAi沉默KPNA2 基因抑制裸鼠成瘤（瘤体测量）
  •   4.4 讨论
  •   参考文献
  • 第五章 KPNA2 基因在肝癌中的机制研究
  •   5.1 引言
  •   5.2 材料与方法
  •     5.2.1 主要实验材料和仪器
  •     5.2.2 实验方法
  •   5.3 实验结果
  •     5.3.1 RNA纯化的质检结果
  •     5.3.2 基因芯片数据的质控结果
  •     5.3.3 基因芯片数据的分析结果
  •     5.3.4 生物信息学方法分析结果
  •     5.3.5 qRT-PCR和 Western blot检测验证差异表达基因
  •     附件
  •   5.4 讨论
  •   参考文献
  • 总结与展望
  • 缩略语表
  • 攻读学位期间取得的研究成果
  • 致谢
  • 个人简况及联系方式

    • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 杨云锋

    导师: 双少敏,王俊平

    关键词: 基因表达,沉默,基因芯片,肝癌

    来源: 山西大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,医药卫生科技

    专业: 生物学,生物学,肿瘤学

    单位: 山西大学

    分类号: R735.7;Q75

    总页数: 120

    文件大小: 8676K

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