论文摘要
背景:近年来,病原菌相关感染性疾病仍然是世界范围内危害人体健康的一大隐患。世界卫生组织（WHO）在2019年公布的全球十大健康威胁中,与感染相关的疾病和高危行为就有六种。目前传统的病原微生物培养和鉴定步骤仍然是许多医疗机构,尤其是医疗资源欠发达地区内鉴定病原菌的主流方法。但其操作繁琐、耗时较长和所需试剂量大的缺点给临床医疗诊断带来了许多问题。为了实现病原菌种属的快速鉴定,近些年来出现了一系列分子生物学方法和生物传感技术。但是这些方法依然存在一定的缺点,例如仪器昂贵、特异性和灵敏度不高等问题。质谱学技术,例如MALDI-TOF-MS,被称为革命性的微生物检测新技术,已经成功在部分实验室常规开展开来,但是该技术的检测灵敏度较低（105106 CFU）,且设备维护成本高,在鉴别某些病原菌种属（例如大肠杆菌和志贺氏菌）时仍存在一定的缺陷。因此探索一种高灵敏、高特异、快速准确的临床病原菌检测新方法具有重要的意义。在当今信息科学高速发展的大背景下,从多学科交叉融合角度探究科学问题成为一种新型研究思路,而太赫兹（Terahertz,THz）波的生物医学应用研究则是当今物理光学和生物医学交叉的前沿热点。THz波通常指频率在0.1-10 THz范围的电磁波,在电磁波谱中处于毫米波与红外波之间的位置。在生物医学应用领域,THz波具有许多独特的优势:（1）指纹图谱性:多种生物分子之间/内的弱相互作用力、骨架振动和转动等低频分子运动能级等正好处于THz波的频率范围内,利用THz波技术可以获取其他频段电磁波难以探测的生物信息,通过生物分子的特征性光谱指纹实现靶标的无标记识别和检测。（2）安全性:THz波的电子能量极低,和X线和伽马射线相比,不会产生电离作用损伤检测的样品或对操作人员带来危害,是一种安全无损的检测方法。（3）便捷性:作为一种光谱学检测技术,THz波仅需数十秒便可获取高分辨率的光谱信号,探测过程快捷简便,非常适合于开发小型便捷式检测设备。THz技术是一种图像-频谱融合技术,既可以获取反映待测样本本质属性差异的THz波段频谱信息,又可以根据其强度和相位等信息构建THz图像。得益于其快速、无标记和无损伤的特点,这些THz光谱和成像技术目前已经被用于包括核酸、蛋白质、细胞、细菌和组织等多个层次的生物医学研究中。在病原菌检测领域,以往研究多局限于对少数病原菌胞内成分、芽孢和菌体进行简单的光谱检测和分析,在具有较高临床运用意义的病原菌种属水平的研究涉及较少。有国外研究中尝试利用THz光谱技术检测大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的差异性光谱,但是对于各类细菌在THz频段产生信号响应的机理解释还不清楚,现有的大多数分子动力学模拟结果与实验检测数据相差较大,因此有必要对THz光谱技术用于病原菌无标记检测的机理进行深入探索。此外,THz技术目前的特异性和灵敏度还仍然较低,无法满足临床病原菌检测的实际需求,亟需寻找新的提高特异性和灵敏度的手段联用将其发展成一种高效的生物传感方法。滚环扩增技术（Rolling Circle Amplification,RCA）是一种常用的核酸等温扩增技术,将RCA技术和THz传感技术联用,通过检测病原菌DNA扩增产物区分病原菌就有望解决特异性问题。RCA技术的原理是通过设计单链DNA探针特异性识别和捕获靶核酸序列。随后在DNA聚合酶作用下在环形DNA模板上进行链合成,实现环状DNA模板的等温线性扩增。该技术具有操作简单、反应快速、可在固相基质上操作和不依赖昂贵实验仪器等优点,目前已经在各类病原菌核酸快速检测方面得到了广泛的应用。超材料结构是近些年来发展起来的一种提高THz波检测灵敏度的有效手段。超材料通常是指由周期性排列的亚波长谐振单元和载体构成的人工复合材料,通过结构设计使对其表面物质的介电常数变化非常敏感。当THz波入射至其表面时,可引起超材料表面的局域电场增强,加入的样本导致其共振频率的改变,从而实现样品的高灵敏探测。此外,诸如纳米颗粒等高折射率的物质在THz超材料上可产生更好的信号响应,可结合在样品上实现信号的二次放大。因此,通过构建“超材料-纳米颗粒”信号放大系统就有望对THz波的检测灵敏度进行显著提高。综上所述,本研究通过改进和优化现有的THz光谱和成像技术平台,从病原菌的菌落、菌体和核酸片段三个层次出发,进行临床常见病原菌的THz图谱特征研究和核酸片段的恒温快速检测。我们系统性的开展了病原菌和THz波信号相互作用研究,通过对四种常见感染性病原菌菌体进行THz频谱表征和THz吸收二维模型构建,阐明了病原菌胞内含水量在病原菌THz波信号中的主导作用,实现了病原菌的种属鉴定和生存状态评估。在机理研究的基础上,通过发挥THz波“图谱合一”的技术优势,利用透射式THz成像和THz衰减全反射（THz-ATR）技术进一步开展了培养后菌落的可视化成像检测和培养平板上的菌落原位成像分析。此外,为了进一步提高THz技术检测特异性和灵敏度,我们整合RCA反应和“超材料-纳米颗粒”信号放大系统,以病原菌特异性DNA片段为靶标,从分子水平开展RCA-THz液相传感体系和THz超材料纳米生物传感器的构建,并对其检测临床菌株的性能进行了系统性评估,获得了检测灵敏度和特异性等关键方法学参数。通过上述工作,本研究构建了一套病原菌菌落、菌体和核酸水平的THz波无标记检测技术,为THz波生物医学研究和病原菌检测领域提供了一种全新的研究思路。方法:1.病原菌菌体的THz光谱检测:选取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌四种常见感染性病原菌为研究对象。通过细菌培养、金属浴加热和冷冻干燥等方法制备活菌、死菌和细菌粉末样本。利用自行设计和构建的适用于病原菌光谱检测的样本池对不同种属和生存状态的病原菌进行无标记光谱检测。2.病原菌菌落的透射式THz成像研究:采用基于光泵浦的连续波气体激光器的透射式THz成像系统,设计和制备适用于病原菌单菌落成像高阻硅微孔检测板,将培养后的病原菌菌落直接点样在微孔中进行透射式THz成像检测。利用上述方法对不同种属病原菌和混合病原菌样本进行检测并对同一病原菌菌落的活性变化进行监测分析。3.病原菌菌落的THz-ATR原位成像:采用高阻硅棱镜的THz-ATR成像检测系统进行病原菌菌落原位成像检测。利用一系列基于K均值聚类的背景分割与边缘细化等图像处理算法,对原位测量图像进行优化,获取高对比度的THz-ATR图像。4.用于病原菌DNA检测的RCA-THz液相传感体系的构建:以大肠杆菌靶核酸序列为模板,设计特异性锁式探针和捕获探针,建立磁珠表面的RCA反应体系,通过琼脂糖凝胶电泳、Zeta电位测量和激光共聚焦测量验证体系构建的有效性,并进行方法学评价。5.超材料结构的设计加工:设计和加工了两种基于周期性排列的金属开口谐振环的超材料结构,分别用于病原菌菌体和DNA扩增产物的检测,采用有限元模拟分析和实验测量方式进行病原菌菌体的超材料测量,评价其提高检测灵敏度的效果。6.恒温扩增型太赫兹超材料纳米生物传感器的构建和条件优化:在前期构建的RCA-THz液相传感体系基础上,有机耦合纳米颗粒和RCA产物的制备“RCA产物-纳米颗粒”复合物进行超材料检测研究,完成太赫兹超材料纳米生物传感器的构建,并对该传感器的检测条件,如杂交反应温度和纳米金颗粒浓度等进行系统优化。7.临床样本检测和方法学评价:利用所构建的太赫兹超材料纳米生物传感器进行临床样本检测,通过与传统培养与鉴定方法对比获取其检测灵敏度、特异性和准确度等关键方法学参数。结果:1.获取了大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌四种常见感染性病原菌的THz吸收系数、折射率、介电常数实部和虚部的频谱参数。构建病原菌的THz吸收二元模型,比较了大肠杆菌吸收系数的实验测量值和估计值,证明病原菌胞内水分子对样本整体吸收具有很大影响,提出THz光谱基于水含量无标记检测病原菌的理论。2.利用透射式THz成像技术对四种不同种属病原菌菌落和多种病原菌混合菌落进行可视化成像分析,其中不同种属病原菌THz图像差异明显,且不同混合比例的病原菌样本可在THz图像中被区分。获得了对金黄色葡萄球菌活性随时间变化的THz信号图像。3.获取了高对比度的THz-ATR图像,证实了原位测量方式的可行性。鲍曼不动杆菌和大肠杆菌的单纯细菌信号值ATR信号值分别为74.65±0.56%和71.55±0.49%,具有统计学差异（p<0.05）。利用THz-ATR技术可以对不同种属的病原菌菌落进行原位测量,且检测标准差明显小于透射式成像,说明该方法的检测稳定性更好。4.RCA反应体系的电泳结果显示,产物集中在泳道加样口证明了反应产生高分子量单链DNA。Zeta电位测量结果显示,RCA磁珠的Zeta电位（-42.9±0.90 mV）明显低于Blank磁珠（-29.7±0.15 mV）和捕获探针磁珠（-28.6±0.25 mV）,说明RCA-MB表面覆盖有扩增的核酸产物。荧光染色结合激光共聚焦见过显示RCA磁珠带有的扩增核酸被SYBR Green II染料染为绿色,而捕获探针磁珠上并未出现明显的颜色,以上结果证实了磁珠表面的RCA反应体系的有效性。成功构建RCA-THz液相传感体系,该方法检测病原菌合成DNA和临床样本DNA的最低检测限分别为0.6×10-1010 M和0.05 ngμL-1,大肠杆菌样品和参照的平均THz吸收系数差(39.4±4.0cm-1)显著高于铜绿假单胞菌样品(5.2±1.3cm-1)和鲍曼不动杆菌样品(5.0±1.1cm-1)（p<0.05）,说明了本方法较好的特异性。5.有限元分析方法显示大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌四种病原菌菌株在THz超材料上的共振位移具有显著差异。超材料检测菌体结果显示,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌体在THz超材料上可产生不同的频移,大肠杆菌活菌和死菌之间的共振位移也具有明显差异。6.验证了太赫兹超材料纳米生物传感器构建的有效性,大肠杆菌RCA产物的MB共振峰较空白超材料的频移量为45.78GHz,明显大于阴性对照（15.21GHz）和空白对照（7.61GHz）。有纳米金颗粒存在时超材料的频移量（61.04GHz）明显大于纯RCA产物（45.78GHz）。优化了太赫兹超材料纳米生物传感器的检测条件:PLP与靶核酸序列杂交反应温度为60℃,所需E.coli DNA ligase连接酶用量为5U,连接反应时应该使用BSA效果更好,反应后使用核酸外切酶exonuclease I和核酸外切酶exonuclease III可消除多余的PLP,最佳CP-MBs用量为1μM,最佳Phi 29 DNA polymerase聚合酶用量为10U,最佳dNTPs Mixture混合液浓度为10mM,最佳扩增时间为40分钟,纳米金修饰探针的浓度为1nM时得到的“RCA产物-纳米颗粒”复合物在超材料上频移量最大。7.“RCA产物-纳米颗粒”复合物在超材料上的频移量与其靶核酸序列浓度的对数值成明显的线性关系（y=16.23x+28.66,R2=0.9465）,太赫兹超材料纳米生物传感器检测临床样本的最低检测限为0.1 pg/μL-1。与传统病原菌检测方法比较,该传感器检测四种临床病原菌的灵敏度、特异度和准确度分别为:E.coli（100%、95.8%和98.0%）;S.aureus（100%、100%和100%）;P.aeruginosa（90.9%、97.4%和96%）;A.baumannii（100%、97.6%和98.0%）。采用Kappa检测对上述指标进行统计学分析,两种方法检测这四种病原菌的结果具有一致性（p<0.05,Kappa>0.75）。结论:1.阐明了临床常见病原菌在THz频段的信号响应机理和主要影响因素,为利用THz技术快速无标记检测病原菌提供理论支撑。开发出基于病原菌胞内含水量快速无标记检测病原菌的新方法,可在数分钟之内实现病原菌的种属鉴定和生存状态评估。2.进行培养后病原菌菌落的THz波可视化成像和基于THz-ATR技术的原位检测研究,验证了THz成像技术在临床病原菌菌落水平检测的实用价值,通过将复杂的THz成像结果转化为三维彩色显示模型中简单的颜色图,无需进行复杂的数据解析即可对菌落种属判断和混合样本中靶标的直接鉴定,构建一种适合于紧急情况下的菌落快速检测方法。3.将核酸等温扩增技术与THz光谱结合,构建了RCA-THz液相传感体系,解决了临床病原菌直接检测缺乏特异性的难题,实现了病原菌DNA的有效检测。利用构建的RCA-THz液相传感体系,对合成的大肠杆菌靶核酸片段和临床菌株基因组DNA进行了检测,得到了其检测灵敏度、重复性和特异性等一系列重要方法学指标,为THz技术用于核酸片段的高灵敏检测提供通用型方案。4.建立一种高灵敏和高特异性的恒温扩增型THz超材料纳米生物传感器,从病原菌核酸层次开展临床实际样本的检测研究。该传感器耦合了RCA反应、和超材料-纳米颗粒信号放大系统,相对于现有的临床微生物检测技术具有快速、准确、高灵敏和高特异的特点和一定的临床应用价值,从前沿交叉学科角度为检验医学领域提供了一种无标记传感新技术。
论文目录
文章来源
类型: 博士论文
作者: 杨翔
导师: 府伟灵
关键词: 病原微生物,太赫兹光谱,太赫兹成像,太赫兹衰减全反射,滚环扩增,超材料,纳米金颗粒
来源: 中国人民解放军陆军军医大学
年度: 2019
分类: 基础科学,医药卫生科技
专业: 生物学,临床医学,生物医学工程
单位: 中国人民解放军陆军军医大学
基金: 国家重点基础研究计划(“973”计划)(No.2015CB755400),国家自然科学基金重点项目(No.81430054),军队后勤科研重大项目(No.AWS17J010)
分类号: R446.5;R318
DOI: 10.27001/d.cnki.gtjyu.2019.000214
总页数: 157
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标签：病原微生物论文; 太赫兹光谱论文; 太赫兹成像论文; 太赫兹衰减全反射论文; 滚环扩增论文; 超材料论文; 纳米金颗粒论文;