谢玲玲[1]2008年在《淫羊藿苷诱导骨髓间充质干细胞分化心肌样细胞的实验研究》文中研究说明心肌梗塞后，存活的心肌细胞数量减少，纤维疤痕组织增生，心功能下降，最终发展为缺血性心力衰竭甚至死亡。目前临床所用的治疗手段不能逆转已坏死的心肌，心脏移植由于费用和排斥反应等问题不能得到推广应用。因此，寻找一种新的、更好的治疗手段已成为当务之急。大量的研究人员把研究重点放到了干细胞的移植治疗上，而干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。其中胚胎干细胞由于取材困难等因素的限制，成体干细胞逐渐成为人们研究的重点。骨髓间充质干细胞(MSCs)是成体干细胞的一种，来源于中胚层的间充质。在一定的环境和刺激因子的作用下可分化为多种组织细胞，在组织工程中，MSCs作为一种重要的种子细胞越来越引起人们的关注，将MSCs诱导分化为心肌细胞移植治疗心肌梗塞，为中药与干细胞联合治疗心血管疾病提供新的理论依据。MSCs属于非造血细胞，其特点是贴壁生长，呈纺锤型的纤维细胞样，国内外研究认为MSCs具有独特的表征和巨大的培养增殖能力，并认为其是多向分化潜能的干细胞，在一定条件下可以分化为骨骼、软骨、肌肉、神经和造血微环境组织等，具有很高的可塑性。国内外学者在体外培养中将MSCs经传代后用5-氮胞苷(5-aza)对其进行诱导分化，可见有心肌细胞样超微结构，有心肌特异性基因表达，并有持续的动作电位，表明他们成功地诱导出心肌细胞。另有研究人员将MSCs直接注射入自体心肌组织内，发现有心肌样细胞形成，具有肌钙蛋白T和肌球蛋白重链染色阳性的心肌细胞特异性标志，表明MSCs在体内微环境条件下可以诱导分化为心肌细胞。MSCs作为一种重要的种子细胞越来越引起人们的关注，研究者把研究重点放在如何对其进行诱导分化为心肌细胞，以期为移植治疗心梗提供新的理论依据。用于MSCs体外诱导分化为心肌细胞的诱导剂主要是化学物质5-Aza，但5-Aza有一定的毒性，关于中药诱导的报道较少，这可能与干细胞诱导分化研究涉及的技术问题较多，中药介入的条件还不太成熟有关。寻求一种高效安全的诱导剂是干细胞诱导分化研究的关键。淫羊藿是补肾壮阳类中药，常用于治疗阳虚证，淫羊藿苷(ICA)是其主要活性成分，ICA药理活性主要表现在改善心血管系统功能、增强机体免疫力、促进DNA合成及诱导肿瘤细胞分化等方面。在改善心脑血管系统功能方面，其主要功效为补肾强心、宁心安神、养血除烦。对改善冠心病患者心绞痛等症状及缺血型心电图有较好疗效，并有镇静和降血脂作用。在对该成分体外定向诱导ES细胞分化成心肌细胞的研究中发现：ICA与ES细胞的定向分化呈一定的量效、时效关系。我们考虑ICA是否也与MSCs的定向分化呈一定的量效、时效关系。该诱导分化是否也能促进MSCs在体内对梗死心肌的修复作用。本课题研究希望通过检测ICA诱导MSCs后的α-MHC、β-MHC等基因的表达，以及Desmin、cTnT、VEGF和BFGF的表达，来探讨ICA是否能诱导MSCs分化为心肌细胞，其最佳的诱导浓度和诱导时间是多少；在体内实验研究中，诱导后的细胞是否能有效改善心梗大鼠的受损心肌，为研究心梗的治疗提供新的研究思路。目的探讨淫羊藿苷体外诱导MSCs分化为心肌样细胞的最佳时效和量效关系，并以此为基础，进一步探讨诱导后的MSCs移植治疗心梗大鼠的心肌修复。方法本课题分为四个实验进行实验一、按照不同的药物浓度将ICA分为10~(-6)M、10~(-7)M、10~(-8)M、10~(-9)M、10~(-10)M五个浓度梯度，利用MTT法检测不同浓度组对MSCs的增殖影响。同时通过形态学和免疫组化对分离所得的细胞进行表型分子鉴定。实验二、利用RT-PCR对ICA各浓度组(10~(-6)M、10~(-7)M、10~(-8)M、10~(-9)M)诱导MSCs后，心肌细胞特有的α-MHC、β-MHC和GATA-4的表达情况，探讨ICA诱导MSCs表达心肌细胞特有的α-MHC、β-MHC和GATA-4的时效、量效关系。同时以5-Aza为阳性对照。实验叁、在实验二的基础上进一步探讨诱导后的MSCs分泌VEGF和BFGF的表达情况，同样以5-Aza为阳性对照。实验四、在实验二和实验叁的基础上，把ICA体外诱导后的MSCs经尾静脉注射入大鼠体内2W和4W，通过免疫组化检测心梗部位心肌Desmin、cTnT、VEGF和BFGF的表达情况，同时通过HE染色和Masson染色观察该治疗方法对受损心肌的修复情况。结果实验一、采用无菌分离大鼠胫、股骨骨髓腔细胞，并用全贴壁培养法所获得的细胞经传代培养，去掉其中的造血细胞，得到的是骨髓间充质干细胞。与空白对照组比较，10~(-7)M、10~(-8)M的ICA与MSCs共培养48h后，能明显促进MSCs的增殖，P<0．01。实验二、ICA体外促进MSCs分泌α-MHC、β-MHC的最佳浓度是10~(-7)M，最佳的诱导时间是共培养24h后，换成完全培养基培养1W。实验叁、再次确认ICA体外促进MSCs分泌VEGF和BFGF的最佳浓度是10~(-7)M，最佳的诱导时间是共培养24h后，换成完全培养基培养1W。实验四、把经ICA最佳浓度和时间诱导后的MSCs移植入心梗大鼠体内后，与移植治疗2W组比较，4W组能明显促进Desmin、VEGF和BFGF的表达，梗塞部位心肌纤维化程度减轻，有一定数量的新生血管形成，对梗塞心肌的修复作用明显。结论由实验一至实验叁可知：①10~(-7)M和10~(-8)M的ICA在体外能促进MSCs增殖；②10~(-7)M和10~(-8)M的ICA能有效促进MSCs心肌发育依赖的α-MHC、β-MHCmRNA的表达，而诱导24h后再换液培养1周是其最佳的诱导时间。③10~(-6)M和10~(-7)M的ICA能显着促进细胞分泌VEGF、bFGF表达。综合以上实验结果，我们认为：ICA体外诱导MSCs分化为心肌样细胞的最佳浓度是10~(-7)M，最佳诱导时间是诱导24h后再换液培养1周。在体外实验结果的基础上对MSCs进行诱导，再把诱导后的细胞通过尾静脉注射输入心梗大鼠体内，实验发现：把经10~(-7)M的ICA诱导24h再换液培养1周的MSCs经尾静脉移植，能有效地修复受损心肌，促进该部位Desmin、cTnT、VEGF和BFGF的表达。已有大量的实验研究针对骨髓间充质干细胞(MSCs)移植治疗心梗，较多的研究人员提出：将MSCs通过一定的途径移植到心梗大鼠体内能有效地修复受损心肌。而在本实验中，我们却发现：MSCs没有预先经过一定的处理而直接进行移植治疗，Desmin、cTnT、VEGF和BFGF的表达相对较弱，仅比不做任何治疗的模型组稍好；而经过与ICA共培养后再进行移植，其修复效果理想，Desmin、cTnT、VEGF和BFGF的表达强，效果满意。综上所述，ICA能促进体外分离的MSCs增殖；还能促进MSCs的α-MHC、β-MHCmRNA的表达；对VEGF和BFGF的分泌同样有促进作用；通过尾静脉注射移植诱导后的MSCs细胞，能修复受损心肌，促进心肌修复所需的Desmin、cTnT、VEGF和BFGF的表达。因此，由本课题研究我们认为：10~(-7)M的ICA与MSCs共培养24h后，在更换为完全培养基培养1周，能诱导MSCs分化为心肌样细胞，经其诱导后的细胞能有效改善心梗后的受损心肌。
王利霞[2]2005年在《5-氮胞苷体外诱导人骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究》文中研究指明近年来,急、慢性缺血性心脏病(ischemic heart disease,IHD)的基础研究和临床治疗均有较大的进展,尤其是心血管药物治疗学和心脏介入技术水平不断提高,急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)的死亡率明显下降,但心肌梗死后心功能衰竭的发病率和致残率仍居高不下,已成为危害人类健康的主要疾患之一。目前临床治疗缺血性心脏病的常用治疗手段主要包括药物治疗、内科介入治疗、外科手术治疗等。这些治疗方法的主要作用是改善局部血运,挽救濒死心肌,增加存活心肌功能,而非针对病变冠状动脉的再造和梗死心肌再生、重建的根本性治疗方法。干细胞的研究和应用为心肌坏死性疾病提供了新的治疗方法。 细胞治疗(cellular therapy)通过移植功能细胞,替代、修复或加强受损的组织或器官的生物学功能,已成为治疗多种组织坏死性疾病的新策略。细胞移植(cellular transplantation)、心肌再生(myocardial regeneration),可以增加梗死区功能心肌细胞数量,改善心肌功能,逆转心室重塑,是目前研究的热点。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSCs)因其独特的生物学特性在干细胞研究领域倍受重视。骨髓中有两种类型干细胞,造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)和间充质干细胞。骨髓MSCs是存在于骨髓基质内的非造血细胞来源的细胞亚群,是中胚层发育的早期细胞,不仅可以分化为造血实质和造血基质细胞,还可以分化为许多造血以外的组织,特别是中胚层和神经外胚层来源组织的细胞。研究发现MSCs在体内或体外诱导条件下可以分化为心肌样
刘博武[3]2012年在《四种方法诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的电生理特性及意义》文中指出研究背景由心肌梗死(Myocardial Infarction, MI)引起的缺血性心脏病(IschemicHeart Disease, IHD)是导致心力衰竭(Heart Failure, HF)的主要病因之一。尽管调脂、抗血小板等治疗可以减少动脉粥样硬化和冠心病的风险，以及早期介入治疗可以使MI病人的死亡率显着下降，但是MI后心肌细胞、心肌组织坏死和心功能降低，终末期时心室发生重构，心功能显着降低，心血管事件增多。心脏移植虽然是一种有效的治疗方法，但因为供体的数量有限，不能满足临床需要。骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal stem cells, BMMSCs)移植治疗MI后的HF已经得到了初步的临床试验结果，诱导其分化形成为心肌样细胞的方法目前有很多，但获得的心肌样细胞在的生理学特性研究尚未完全明确，不同的诱导方法是否对细胞功能产生不同的影响也尚未明确。随着研究的深入，或许在不久的将来可以发现一种有效的联合诱导方法，使BMMSCs诱导分化的心肌样细胞具备良好的功能状态，从而发挥最大的治疗效果。研究目的1. SD大鼠BMMSCs体外分离、培养、纯化及鉴定。2.分别用5-AZA、Ang-II、PFT-α、BMP-2诱导SD大鼠BMMSCs分化为心肌样细胞，检测分化率和心肌特异性蛋白表达。3.检测5-AZA、Ang-II、PFT-α、BMP-2诱导SD大鼠BMMSCs分化为心肌样细胞的电生理特性。研究方法1. SD大鼠BMMSCs体外分离、培养、纯化及鉴定：采用脱颈法处死SD大鼠后分离四肢长骨，获取全骨髓细胞之后采用密度梯度离心法和差速贴壁法弃除骨髓中的其他细胞，得到纯化的BMMSCs。使用倒置相差显微镜每日观察BMMSCs在培养传代过程中细胞的形态学变化，并使用流式细胞仪检测BMMSCs表面标记抗原CD29(+)、CD44(+)和CD45(-)，进行细胞纯度鉴定。各组细胞经诱导后，形态由不规则星形逐渐成为长梭形，表现出心肌细胞的形态学特征。2. BMMSCs经5-AZA、Ang-II、PFT-α、BMP-2诱导分化为心肌样细胞的分化率和心肌特异性蛋白表达：传代纯化之后取第4代细胞，分为5个实验组：5-AZA组(10μmol/L)，Ang-II组(0.1μmol/L)，PFT-α (20μmol/L)组，BMP-2(10μg/L)组和正常对照（Control）组。各实验组诱导24h后换正常完全培养液继续培养4w，倒置显微镜观察细胞形态学变化，采用流式细胞仪测定心肌样细胞分化率，Western Blot测定缝隙蛋白43(Cx43)和心肌肌钙蛋白I (cTnI)表达量，免疫荧光染色测定诱导后1w和4w肌钙蛋白T(cTn T)表达。3.检测5-AZA、Ang-II、PFT-α、BMP-2诱导SD大鼠BMMSCs分化为心肌样细胞的电生理特性：取第4代细胞分组诱导第4w时，采用激光共聚焦测定反映各组细胞内游离钙离子浓度变化的fluo3/AM荧光表达水平，采用膜片钳测定各组细胞的钾通道电流密度水平。研究结果1. SD大鼠BMMSCs原代培养、传代形态学特点及表面抗原鉴定：原代细胞形状多成不规则星形或者短梭形，且可见细胞之间存在突起互相连接。原代细胞分离培养7d后快速增殖并形成集落，呈长梭形。传3~4代后细胞体积比原代细胞增大，细胞形态及生长排列趋向一致。采用流式细胞仪检测BMMSCs表面特异性抗原CD44、CD29和阴性表面抗原CD45，CD44阳性表达率为(91.4±1.2)%，CD29阳性表达率为(89.6±2.7)%，而CD45阳性表达率为(1.8±1.3)%。2.各组诱导分化率和心肌特异性蛋白表达：流式细胞仪测定各实验组细胞分化率，结果如下：5-AZA组分化率为(23.7±2.1)%，Ang-II组为(23.5±1.6)%，BMP-2组为(17.5±2.3)%，PFT-α组为(28.9±0.9)%，而对照组为(1.5±1.4)%。5-AZA组与Ang-II组之间无明显统计学差异(P>0.05)，其余各组之间具有统计学差异(P<0.05)。免疫荧光染色检测各实验组细胞cTn T蛋白表达程度，结果显示除对照组外各组在诱导后1w均有弱表达，诱导后4w均有强表达，而对照组在诱导后1w和4w均为少量表达。Western Blot结果显示在诱导后4w，各实验组均有Cx43蛋白表达，5-AZA组蛋白表达量高于其他实验组(P<0.05)，PFT-α组表达量较BMP-2组和Ang-II组多(P<0.05)，而BMP-2表达量较Ang-II组多(P<0.05)，对照组表达量显着低于各实验组(P<0.01)。同时各实验组均有cTn I蛋白表达，PFT-α较其他各实验组表达量多(P<0.05)，5-AZA组与Ang-II组之间无明显差异(P>0.05)，BMP-2组较其他各实验组表达量较少(P<0.05)，对照组蛋白表达量显着低于实验组(P<0.01)。3.各组诱导SD大鼠BMMSCs分化为心肌样细胞的电生理特性：激光共聚焦显微镜检测fluo3荧光表达水平，结果显示5-AZA组荧光强度为(1686.177±499.122)，Ang-II组荧光强度为(2627.666±407.329)，PFT-α组荧光强度为(2156.606±385.355)，BMP-2组荧光强度为(1301.910±338.681)，而对照组中荧光强度为(824.928±222.399)。荧光强度Ang-II组高于其他实验组(P<0.01)，PFT-α组荧光强度显著比5-AZA组和BMP-2组高(P<0.01)，5-AZA组荧光强度显着较BMP-2组高(P<0.01)，对照组表达显着低于各实验组(P<0.01)。使用膜片钳检测各组细胞钾通道电流密度水平，结果显示，在+70mV时的稳态电流中，电流密度(pA/pF)在5-AZA组中为(24.931±1.421)，Ang-II组为(25.134±1.481)，PFT-α组为(27.102±1.321)，BMP-2组为(20.485±1.236)，而对照组中电流密度为(18.053±1.241)。电流密度PFT-α组最高，较其他组均有显著差异(P<0.01)，其中PFT-α组vs.Ang-II组(P<0.05)；5-AZA组和Ang-II组之间无显着差异(P>0.05)，较BMP-2组和对照组有显着差异(P<0.01)；BMP-2组比对照组电流密度强，具有显着差异(P<0.01)。研究结论1.采用密度梯度离心法和差速贴壁法联合使用可以得到纯化的原代BMMSCs，通过流式细胞仪测定BMMSCs的表面特异性抗原CD29(+)和CD44(+)以及CD45(-)可以鉴定分离培养的原代BMMSCs的纯度。2. BMMSCs经5-AZA (10μmol/L)，BMP-2(10μg/L)，PFT-α (20μmol/L)，Ang-II (0.1μmol/L)诱导可以向心肌样细胞分化。分化率PFT-α最高，5-AZA与Ang-II无明显差别，BMP-2分化率在实验组中最低。3.各实验组细胞游离钙离子浓度变化的荧光强度Ang-II> PFT-α>5-AZA> BMP-2> Control，经不同诱导剂作用后细胞内钙离子代谢水平较未诱导细胞有不同程度的提高。4.各实验组钾电流测定，电流密度PFT-α组最高，5-AZA组和ANG-II组其次，BMP-2组在实验组中最低。各诱导组均比对照组电流密度强，提示经诱导剂诱导之后细胞膜表面可开放钾通道数量分化成熟增多，使电流密度增强。
庞全海[4]2005年在《山羊骨髓间充质干细胞的分离培养及体外分化潜能的研究》文中进行了进一步梳理骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是来自于骨髓的两种干细胞之一,在人、小鼠、大鼠、兔、猪等许多物种的研究证明了该类干细胞具有体外分化为多种细胞表型的能力,有望成为未来细胞/基因治疗、组织工程的主要种子细胞之一。但是,迄今未见关于山羊,特别是成年山羊骨髓间充质干细胞分离、培养、分化等方面的系统研究报道。本研究目的在于阐明山羊骨髓间充质干细胞的生物学性能及其分化潜能,以便未来利用该类细胞作为疾病细胞/基因治疗的模型,以及利用该类细胞作为细胞生物反应器体外生产生物活性物质,进而建立山羊骨髓间充质干细胞细胞系。为此,本试验利用成年关中奶山羊为对象,较为系统全面地研究了其骨髓间充质干细胞的分离、培养、扩增、形态学、生长特性、细胞表面标志,以及体外诱导分化能力。结果如下:1. 本试验应用贴壁分离法或密度梯度离心法成功分离获得关中奶山羊髂骨骨髓间充质干细胞,体外培养到第21 代,仍然保持其干细胞的特性,并已扩增到2.8×108细胞。2. 本试验所分离的关中奶山羊骨髓间充质干细胞呈多角形、叁角形或长梭形,类似于人和其他物种的间充质干细胞。3. 扫描电镜下,山羊骨髓间充质干细胞表面较为粗糙,有多个突起,并有较多微棘和丝突,当多个细胞同时存在时,这些丝突相互搭接成网状。透射电镜下,山羊骨髓间充质干细胞的结构与其他物种基本相似,即表现为细胞内有大量扩张的粗面内质网、线粒体,分泌功能旺盛,具有该类细胞的典型特征:细胞核质比大、胞浆中细胞器少、核仁明显处于功能静息期。4. 免疫细胞化学分析表明,山羊骨髓间充质干细胞能够表达间充质干细胞的表面标志CD29、CD44、CD105、CD106 以及CD166(阳性),而不表达造血干细胞的标志CD14、CD34、CD45、c-kit (阴性),和其他物种的骨髓间充质干细胞相似。这些标志的检测有助于鉴定间充质干细胞。但本试验还发现,山羊骨髓间充质干细胞也表达TGF-α,其意义需要进一步阐明。5. 山羊骨髓间充质干细胞可以在体外用5-氮胞苷诱导分化为心肌细胞表型,能够表达α-actin 抗原,呈PAS 染色阳性,并分泌糖原,从而为未来利用这种细胞进行心脏疾病细胞/基因治疗的模型研究提供了科学依据。同时,这也是和骨髓造血干细胞的区别之一。6. 用HGF 和尼克酰胺向胰岛β-细胞诱导后,山羊骨髓间充质干细胞能够变为较典
白婷婷[5]2016年在《表皮生长因子促进人毛囊间充质干细胞增殖的机制研究》文中进行了进一步梳理毛发的真皮乳头和真皮鞘中存在着间充质干细胞,它不仅与上皮细胞相互作用决定了毛发周期的自我更新,而且也能为疾病的干细胞移植治疗和组织工程器官的构建提供自体或异体多能干细胞来源。临床研究中发现:间充质干细胞移植治疗组织损伤时,单次移植细胞数量高达到1×109个才能有效发挥治疗作用,而短时间内可获得的细胞数量不足是阻碍其临床应用的瓶颈。因此如何高效扩增具有自我更新能力和多向分化潜能的间充质干细胞,成为干细胞再生医学研究和应用的基础和关键。生长因子是一类可以刺激细胞生长活性的蛋白类成分,参与细胞增殖、分化和迁移等一系列生物学过程。成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)均有促进细胞增殖的作用。但生长因子应用于人毛囊间充质干细胞的体外扩增,仍有待解决的问题:需要选择合适的生长因子种类和剂量,使其在促进人毛囊间充质干细胞增殖的同时保持其干细胞的特性,不向分化和癌变的结局发展。此外,生长因子促进人毛囊间充质干细胞增殖的信号通路还不明确。表皮生长因子(EGF)是一种由53个氨基酸残基组成的肽类物质,它与表皮生长因子受体(EGFR)结合后形成同源二聚体,通过胞内激酶区自身磷酸化,激活下游信号通路,将关键信号分子从细胞膜传导到细胞核内,启动相关基因表达,调控细胞的生物学行为。目前发现EGFR下游与细胞增殖相关的信号通路主要有:Ras-Raf-MAPK-ERK、PI3K-AKT和JAK/STAT信号通路。这些信号通路具有细胞特异性:不同的细胞可以通过上述不同的信号通路发挥生物学作用。本课题组之前的研究发现:表皮细胞生长因子(EGF)在人保持毛囊间充质干细胞多潜能分化特性的同时能显着刺激其增殖。但EGF通过哪条信号通路,促进人毛囊间充质干细胞增殖目前尚不清楚。因此,本研究的目的是阐明EGF促进人毛囊间充质干细胞增殖的下游信号通路,并初步探讨与之先关的细胞周期G1-S期的调控因素。我们用拔取毛发的方法,从人的毛囊中获取间充质干细胞,用免疫荧光染色和流式细胞术对其进行了表面标记的鉴定,用多向诱导分化实验鉴定其多潜能性。用EGF和EGFR抑制剂(AG1478)、PI3K-AKT抑制剂(LY294002)、ERK抑制剂(U0126)以及STAT3抑制剂(STA-21)处理细胞,检测EGF以及这几种抑制剂对人毛囊间充质干细胞增殖的影响和对EGFR及其下游信号通路的激活情况。用western blotting检测人毛囊间充质干细胞EGF及其下游信号通路对细胞周期G1-S期调节相关蛋白表达的影响。研究结果显示:我们从毛囊中分离得到的细胞表达间充质干细胞的标记物:CD90、CD105、CD44、CD73,不表达CD31。这些细胞也具有向骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化的能力,因此是毛囊间充质干细胞。免疫荧光染色和流式细胞术结果也显示毛囊间充质干细胞表达EGFR,并且表达率在98%以上。细胞增殖实验证实1-50 ng/m L EGF可以显着提高毛囊间充质干细胞的增殖能力,但没有剂量效应关系。EGFR抑制剂(AG1478,0.2-5μM),PI3K-AKT抑制剂(LY294002,10-50μM),ERK抑制剂(U0126,2-50μM)和STAT3抑制剂(STA-21,20-50μM)显着抑制EGF引起的毛囊间充质干细胞增殖。Western blotting结果显示加入EGF可以上调p-EGFR、p-ERK和p-AKT蛋白的表达,对p-STAT3没有作用。而且AG1478-2μM,LY294002-10μM,U0126-10μM分别抑制p-EGFR,p-AKT和p-ERK1/2的表达。细胞周期相关实验证实EGF(10ng/m L)可以促进毛囊间充质干细胞从G1期向S期转变,同时上调细胞周期蛋白cyclin D1的表达,下调p16蛋白表达。综上所述,我们的结果证实EGF通过ERK、AKT信号通路,促进人毛囊间充质干细胞增殖。EGF促进人毛囊间充质干细胞的细胞周期从G1期向S期转变,与cyclin D1表达上调和p16表达下调有关。这一发现为毛囊间充质干细胞体外大量扩增提供了新的方法和理论依据,也为毛囊发育和毛发周期的研究奠定了基础。
欧书林[6]2016年在《Notch信号系统在人骨髓间充质干细胞向内皮细胞诱导分化中的作用研究》文中研究说明背景:随着当今社会的发展,冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)相关的发生率和致死率较以往明显升高,其中以急性心肌梗死以及心功能不全为重要的死因。由于心肌细胞为不可再生细胞,心肌梗死后坏死细胞由纤维组织增生和瘢痕修复取代,梗死部位失去正常心肌收缩和传导能力,导致心脏肌细胞重构和心脏功能不全,邻近梗死区的心肌细胞由于缺血缺氧成为冬眠心肌。传统心肌梗死的治疗方案包括药物治疗、介入治疗和外科冠脉旁路移植手术,在一定程度上挽救了缺血心肌、改善心梗患者预后,但不能使已梗死心肌细胞重生。特别是部分弥漫性血管病变及微小血管病变患者,介入和外科治疗效果较差,支架植入后需长期口服抗血小板药物,外科搭桥后的桥血管也可能再次粥样硬化甚至闭塞。近年来组织工程和再生医学的进展为心肌梗死的治疗和康复提供了新的希望,通过细胞移植的方法促进血管新生、挽救缺血心肌、冬眠心肌成为缺血相关心脏疾病新的方向,这种新的治疗理念和思路也被称为“治疗性血管生成”。在有关细胞移植及再生治疗的临床和实验室研究中用到过许多种类细胞,其中包括脐静脉内皮细胞、内皮祖细胞、胚胎来源的干细胞、间充质多能干细胞等。其中骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells BMSCs)是一类来源骨髓的,不同于造血干细胞的成体干细胞,具有自我不断更新的能力和向多方向和谱系分化的潜能,在体外合适的条件诱导后,可向多种细胞类型发生分化。而且可以自体移植,易于将外源性的基因片段导入,因此成为热点的种子细胞候选对象。BMSCs在移植后发挥治疗性血管生成作用,主要归因于其向内皮细胞、心肌细胞分化、旁分泌作用促进血管新生,免疫调节作用控制梗死后炎症等。BMSCs向内皮样细胞发生分化的过程受多种因素调节,目前其具体机制仍有待深入探寻。Notch信号通道是一种在各物种、各细胞中广泛存在的高度保守信号途径,主要通过细胞相互直接接触的形式传导,在决定细胞分化方向及命运方面起重要的调控作用。在心血管系统的正常发育中Notch信号系统也起重要作用,它的异常激活或缺失都会导致心血管发育异常甚至是机体死亡。Notch信号通路在内皮血管细胞分化及动静脉选择、缺血诱导的新生血管形成中也扮演关键角色。本课题主要研究了人BMSCs在体外培养中向内皮样细胞诱导分化的可行性及Notch信号在BMSCs向内皮样细胞诱导分化过程中的作用和相关的机制,以便为更好地改进和发展BMSCs移植治疗缺血导致的心血管疾病提供实验和理论的依据。第一部分人BMSCs体外培养及诱导其向内皮细胞分化目的:体外培养人BMSCs,并用内皮细胞诱导剂诱导分化,观察其细胞形态、成血管能力、细胞表面标志物改变,明确BMSCs的内皮分化潜能。方法:(1)体外贴壁培养人BMSCs原代细胞,增殖传代至第叁代(P3)作为研究对象,采用VEGFA165和b FGF联合诱导人BMSCs向内皮细胞分化,显微镜下观察诱导前和诱导后细胞间的形态改变。(2)通过免疫组织细胞化学法,检测诱导分化过程中各组细胞表面内皮细胞相关的标志物Flk-1、v WF的表达情况:实验中各分组为对照组和诱导组,诱导组经过内皮诱导液处理10天后取样做免疫组织化学检测,将诱导前后细胞接种在基底膜基质(matrigel)上观察其血管形成能力,ac-LDL吞噬实验观察细胞吞噬低密度脂蛋白能力。(3)采用蛋白免疫印迹法,观察诱导前后人BMSCs上Notch配体DLL4表达情况,明确DLL4参与BMSCs向内皮分化过程中。结果:(1)人类BMSCs诱导前显微镜下形态为:细长梭状、纺锤形,经VEGFA165和b FGF联合诱导后,部分细胞形态逐渐变为扁平、多角、短梭状。(2)人BMSCs在培养基中由VEGFA165和b FGF联合处理10d后,免疫组化鉴定表明细胞表达内皮细胞相关的标志物Flk-1和v WF。诱导后细胞接种到matrigel后,具备形成毛细血管网样结构能力,并具有吞噬Ac-LDL能力。(3)人BMSCs在内皮细胞诱导液中处理10d后,DLL4的蛋白表达较诱导前明显升高(P<0.01)。结论:1、联合VEGF和b FGF诱导人BMSCs第叁代细胞向内皮样细胞分化的方案是可行的,诱导的最佳浓度:50ng/ml VEGF+10ngb FGF。分化后细胞从形态和部分功能上与内皮细胞相似。2、诱导人BMSCs向内皮细胞分化的过程中,细胞表达的内皮相关细胞标志物随着诱导时间逐渐增加,具备了体外成血管能力和摄取ac-LDL的能力。3、诱导分化处理中,Notch信号的配体DLL4表达上调。第二部分:DLL4干扰质粒和过表达病毒构建及转染h BMSCs目的:采用基因载体技术,将合成的DLL4干扰序列和DLL4 homo序列分别用质粒和慢病毒载体携带,转染h BMSCs,构建DLL4表达干预模型,为后续研究Notch信号通路在MSCs内皮分化中的作用打下基础。方法:1通过聚合酶链反应(PCR)方法克隆得到目的基因片段,然后与骨架载体质粒分别双酶切,将酶切后的PCR产物与剪切后呈线性化的载体连接,进入感受态细胞中,经过筛选阳性菌落,抽取质粒,获得重组后携带目的基因的质粒载体。2采用混合寡核苷酸(oligomix)的方法,分别合成DLL4的两个片段,采用无缝克隆试剂盒连接,在载体LV5中完成重组,感受态细胞中筛选阳性菌落,抽取质粒酶切鉴定,然后进行慢病毒包装、纯化,最后感染h BMSCs。3用蛋白印迹实验验证DLL4干扰质粒和过表达慢病毒的效果。结果:DLL4干扰质粒和过表达慢病毒均可转入h BMSCs,且分别下调和增高DLL4的表达结论:DLL4干扰和过表达载体构建成功,转染h BMSCs并干预DLL4的表达,可用于后续实验。第叁部分:Notch信号系统对人骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化的影响目的:通过基因修饰技术,调高和降低DLL4在人BMSCs中的表达,检测转染干扰和过表达质粒后BMSCs向内皮细胞分化能力改变,明确Notch信号通道的相关下游因子在诱导过程中的改变,研究干预Notch信号的表达和激活对诱导之后细胞的内皮细胞特征的影响,以便提高诱导后内皮细胞增殖能力、迁移能力、促血管生成能力,更好促进BMSCs向内皮细胞诱导分化的临床应用。方法:1、VEGF联合b FGF诱导转染了DLL4干扰质粒和DLL4过表达慢病毒的人BMSCs向内皮细胞分化,免疫组织化学染色检测诱导细胞Flk-1和v WF表达。2、WB检测诱导分化过程中Notch信号通路下游分子Notch胞内片段(NICD)、Hes1、Hes5及内皮标志物Flk-1、v WF的表达,并用Notch1特异性阻断剂DAPT处理诱导中的人BMSCs,观察内皮细胞标志物转录产物水平及细胞成血管能力,吞噬Ac-LDL能力变化。结果:1转染干扰质粒的h BMSC免疫组化染色Flk-1和v WF染色强度为弱阳性,过表达慢病毒转染h BMSC免疫组化Flk-1和v WF中度阳性。2与普通诱导组相比,DLL4过表达h BMSC分化后表达NICD、Hes1、Hes5、Flk-1、v WF增加,DLL4干扰h BMSC分化后表达内皮标志物及下游基因表达下降,阻断Notch信号减少诱导处理后细胞表面内皮细胞标志物及Notch下游基因表达。3与普通诱导组相比,DLL4过表达h BMSC诱导分化后体外成血管能力增强,DLL4干扰h BMSC诱导后体外成血管能力和吞噬ac-LDL能力减弱,诱导晚期加入DAPT促进诱导细胞在胶体基质上形成血管网样结构的能力。结论:DLL4-Notch信号通路激活在VEGF+b FGF诱导h BMSC内皮方向分化过程中起促进作用,在诱导晚期阻断Notch受体后,分化后细胞在体外血管形成实验中生成更多血管网状结构。第四部分:卡诺醇对抗氧化应激促进大鼠骨髓多能成体祖细胞向内皮细胞转化目的:了解抗氧化剂卡诺醇保护间充质干细胞对抗氧化压力并促进内皮样分化的作用和机制,为抗氧化剂和Noch信号通路联合诱导间充质干细胞分化打下基础。方法:(1)大鼠MAPCs的培养及H_2O_2和卡诺醇对细胞增殖和活力的影响,MTT法检测细胞活性;(2)VEGF诱导大鼠MAPCs向内皮细胞分化,分别在卡诺醇预处理和未处理组里加入H_2O_2,检测活性氧簇水平ROS生成和细胞凋亡酶3活性;(3)蛋白印迹法检测诱导10d后的细胞内皮标志物及Nrf-2表达。结果:(1)H_2O_2对大鼠MAPCs的细胞增殖能力和活性产生抑制,MTT分析细胞呈浓度依赖性死亡,在27 um/L浓度达到50%死亡,卡诺醇预处理能呈剂量依赖提高细胞存活,浓度在0.2um/L时保护最强;(2)在MAPCs向内皮诱导分化过程中,H_2O_2明显增加了细胞的ROS水平、细胞凋亡酶3活性以及细胞凋亡率,而卡诺醇预处理可对抗这些作用;(3)检测诱导分化10天后的细胞内皮标志物发现H_2O_2处理组与对照组相比,OCT-4,Flk-1,CD 31表达明显下调。但是卡诺醇预处理后的H_2O_2处理组细胞内皮标志物上调,H_2O_2处理组与对照组相比Nrf-2表达减低,而卡诺醇预处理组与H_2O_2处理组相比明显增加了Nrf-2表达。结论:大鼠MAPCs向内皮分化过程中,H_2O_2增加细胞活性氧蔟水平和细胞凋亡,下调内皮细胞标志物表达,抗氧化剂卡诺醇预处理可促进内皮标志物表达和Nrf-2表达。
屈长青[7]2006年在《猪脂肪间充质干细胞的分离培养及体外诱导分化研究》文中研究指明在动物体内,脂肪组织不仅是重要的能量贮存库和赋形组织,还是保持内环境稳定及具有分泌激素和细胞因子的重要部位。脂肪细胞增殖与分化失常是导致肥胖及Ⅱ型糖尿病的重要因素。因此,脂肪细胞分化的研究一直是国内外医学及生物学领域的研究热点之一。2001年Zuk等发现脂肪中存在脂肪间充质干细胞(adipose mesenchymal stem cells, AMSCs)以来,在人、小鼠、大鼠和兔等多个物种上的研究证明其具有体外分化为多种细胞表型的能力。脂肪组织与骨髓相比,具有易分离,干细胞含量高等优点,在体外培养条件下,AMSCs要比骨髓MSCs具有更高的增殖速率,因此其有望成为未来细胞/基因治疗和组织工程的主要种子细胞之一。猪沉积脂肪能力强,是研究脂肪组织形成与发育较为理想的动物模型。近年来的研究也证明,猪在遗传上比通常使用的其他实验动物如小鼠和大鼠等更接近人类。但是,迄今为止,国内外尚未见关于猪AMSCs分离、培养和多向分化等方面的系统研究报道。本文以1-3日龄仔猪为实验动物,采集颈部及肩胛部皮下脂肪组织,胶原酶消化法获得AMSCs,传代培养,利用免疫组化、流式细胞仪和扫描电镜分析等实验技术研究了猪AMSCs的基本特性;运用免疫组化和RT-PCR法研究了AMSCs在不同因子诱导作用下向成骨细胞、成肌细胞及脂肪细胞分化能力。在此基础上,对比研究了AMSCs成脂诱导与原代培养的基质微管(sromal vascular fraction,SVF)细胞增殖与分化模式,为利用AMSCs研究脂肪细胞形成与分化早期事件奠定了基础。主要结果如下:1.应用胶原酶消化法分离获得猪脂肪基质微管成份(Stromal vascular fraction,SVF),进行原代培养,其中的AMSCs可形成集落。已传21代,并已扩增到1.0×108个细胞。2.本实验所分离的猪AMSCs呈叁角形或长梭形,易形成集落,类似于从人和其他物种所分离获得的AMSCs。3.扫描电镜下,猪AMSCs表面较为粗糙,有多个突起,并有较多微棘和丝突。4.免疫细胞化学与流式细胞仪检测分析表明,猪AMSCs能够表达间充质干细胞的表面标志CD44和CD105(阳性),而不表达造血干细胞的标志CD14、CD34和CD106 (阴性),也不表达成纤维细胞表面标记HLA-DR和前体脂肪细胞与脂肪细胞特异表面标记S-100。5.在体外可诱导猪AMSCs分化为成骨细胞。诱导后,碱性磷酸酶活性提高而呈现阳性反应,产生茜素红染色阳性的矿化结节。RT-PCR在诱导第7天检测到成骨特异基因骨钙素(OCN)和Ⅰ型胶原(COL-Ⅰ)的表达,随诱导时间的延长,两者mRNA水平均呈上升趋势。
耿丹[8]2012年在《人骨髓间充质干细胞体外向心肌样细胞诱导分化机制的研究》文中认为冠心病(coronary heart disease,CHD)是心血管疾病的的一个主要病种，在我国每年导致超过一百万患者死亡。冠状动脉狭窄引起心肌缺血，导致心肌细胞的供氧和供能不足，心肌细胞代谢受阻，不能够支持心脏的正常工作，并引起心绞痛。长期的供氧供能不足导致心肌细胞（Cardiomyocytes,CMs）受损，死亡，数量减少，引起疤痕组织形成，导致心室重构，从而进一步引起心脏功能受损甚至危害生命。传统观念认为心肌细胞是不可再生细胞，一旦发生损害就无法修复，心肌损伤后的心肌细胞如何补充修复是困扰医学界的一个难题。在目前的治疗方案中，药物治疗确实能够延缓心肌细胞的损伤和死亡，减慢心脏的衰竭，但是药物并不能够从根本上解决问题。目前唯一有效的可行的治疗心脏衰竭的途径是心脏移植，然而，供体心脏的不足和移植后免疫排斥反应严重的限制了心脏移植对解决广大患者的应用。心肌细胞再生可以提供一个当前可行的解决方案，是目前科学家和临床医生们解决包含冠心病等多种心血管疾病的希望与挑战。近些年来，随着细胞治疗技术研究的深入，利用细胞移植的方法来替代补充机体损伤或死亡的细胞来修复受损组织的方法，已经成为当今医学研究领域中的一个重点研究方向。大量研究表明，人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs)具有高度增殖、自我更新能力及多分化潜能,在不同的诱导条件下可分化为各种不同类型的组织细胞。BMSCs可以分化为心肌细胞(cardiomyocytes cell，CMs)，但其机制尚不明了。目前体外骨髓间充质干细胞向心肌细胞诱导分化研究主要限于通过5-Aza（5-氮杂胞苷）对其进行成心肌细胞诱导。虽然通过5-Aza的诱导，hBMSCs可以诱导分化为心肌细胞，但间充质干细胞的可塑性依赖于其所处的微环境，然而体外诱导实验并没有完全模拟冠状动脉狭窄后心肌细胞处于缺血缺氧的微环境，这种微环境的变化引起心肌细胞氧化应激损伤。氧化应激时，细胞活性氧的产生与清除之间的平衡被打破，机体内堆积大量的超氧阴离子、羟自由基和过氧化氢(H_2O_2)等自由基，这些氧自由基能够对人体的正常功能产生很大的危害。近些年来随着研究的逐步深入，世界各地的生物医学领域的科研工作者对与冠心病相关的心肌细胞缺血、心肌细胞氧化应激损伤等复杂的病理生理变化进行了更为深入的科学研究。本实验以体外培养人来源骨髓间充质干细胞（hBMSCs）为对象，探讨5-Aza诱导hBMSCs向心肌细胞分化的机制及氧化应激损伤的hBMSCs分化为心肌细胞的可能性。 H2O2可以模拟局部缺氧、氧化应激的微环境，在这种微环境下研究5-Aza还能否继续诱导hBMSCs向心肌细胞分化。本实验将为hBMSCs修复替代受损心肌等的细胞移植提供实验依据及理论基础,从而为冠心病等心血管疾病的治疗开辟新的方法。
彭小娟[9]2014年在《黄芪甲苷对人骨髓间充质干细胞体外增殖及细胞因子表达的影响》文中研究表明目的：探讨补气类中药黄芪的单体成分黄芪甲苷对人骨髓间充质干细胞体外增殖及部分细胞因子表达的影响，并初步探明其作用机制。方法：采用Percoll密度梯度离心法和贴壁筛选法分离、纯化、培养人骨髓间充质干细胞；在倒置相差显微镜下观察原代及传代细胞生长及形态变化；用流式细胞术检测人骨髓间充质干细胞中CD44、CD71、CD45、CD34的表达；选择对数生长期的第叁代人骨髓间充质干细胞，加入不同浓度（0、20、40、80、160、320mg/mL）黄芪甲苷培养72h后，以四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测人骨髓间充质干细胞的增殖指数(OD值)，筛选出对人骨髓间充质干细胞增殖有促进作用的最佳浓度，作为后续实验的干预浓度；依据前期实验结果选取浓度为160mg/mL的黄芪甲苷，将对数生长期的第叁代人骨髓间充质干细胞分为空白对照组及160mg/mL黄芪甲苷组，培养72h后，通过实时荧光定量PCR（Real-time PCR）法检测人骨髓间充质干细胞对干细胞因子（SCF）、血管内皮生长因子（VEGF）、基质细胞衍生因子-1（SDF-1）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）mRNA的表达水平。结果：（1）镜下可见培养细胞贴壁生长，其形态为典型的长梭形，呈网状或漩涡状排列；流式细胞术检测人骨髓间充质干细胞表面抗原,结果显示高表达间充质干细胞表面标志CD44、CD71，而造血干细胞表面标志CD34、CD45表达阴性。（2）不同浓度（20、40、80、160、320mg/mL）的黄芪甲苷均可促进人骨髓间充质干细胞体外增殖(P<0.05)，其中以160mg/mL黄芪甲苷组促增殖作用最明显，当药物达到一定浓度后，人骨髓间充质干细胞增殖不再随药物浓度的增加而增加。（3）黄芪甲苷可促进人骨髓间充质干细胞对SCF、VEGF、SDF-1mRNA的表达，而GM-CSF mRNA表达无明显变化。结论：黄芪甲苷可促进人骨髓间充质干细胞体外增殖，其机制可能与黄芪甲苷促进人骨髓间充质干细胞对SCF、VEGF、SDF-1mRNA表达有关。
张宁坤[10]2016年在《脐带华通胶源间充质干细胞向心肌细胞分化潜能的研究》文中提出目的:通过脐带华通胶源间充质干细胞在体外诱导和体内移植观察其向心肌细胞分化的特性,选择心肌重建新的优良种子细胞,并在体内外分子、细胞、整体水平上,确证华通胶源间充质干细胞向心肌分化潜能,为华通胶源间充质干细胞修复重建心肌临床研究奠定理论基础。方法:提取脐带华通胶,将华通胶剪成细小的组织块,使用贴壁法分离间充质干细胞,组织块贴壁培养12-14天细胞融合为原代细胞,当细胞贴壁生长达到80-90%融合时传代培养。取第二代生长良好的细胞进行流式检测表面标记CD44、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC、CD34、CD45、HLA-DR。使用四甲基偶氮唑盐(MTT)法进行细胞增殖特性检测,取生长良好的第2代WJMSCs进行成骨、成脂肪、成软骨分化鉴定。心肌特异分化基因表达特征检测,应用QT-PCR定量检测WJMSCs心肌早期特异转录因子Isl-1、flk-1、Nkx2.5表达水平;在5-氮胞苷诱导下向心肌细胞分化和心肌细胞特异标志α-actin、Tn T、GATA-4、connexin-43检测。制作大鼠心肌梗死模型,在模型建立14天后在体内进行WJMSCs移植,移植量为0.5ml计2×106细胞,心梗大鼠移植WJMSCs一个月,行超声心动图检测,观察心功能的变化;免疫荧光共聚焦、m RNA水平、蛋白水平进行心肌细胞特异标志α-actin、Tn T、GATA-4、connexin-43检测。结果:脐带华通胶经组织块贴壁法培养,6天WJMSCs从组织块中爬出,呈梭型贴壁生长,12-14天WJMSCs在组织块周围生长并接近融合,经传代后24h,细胞进入对数生长期,6天后,细胞进入平台生长期,增殖减慢,8天后细胞进入衰亡期,取2代生长良好的WJMSCs进行流式细胞仪检测表面标志,WJMSCs表达CD44、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC,不表达CD34、CD45、及HLA-DR,符合间充质干细胞的特性。WJMSCs在成骨、成脂肪、成软骨诱导培养基中培养2周后,细胞碱性磷酸酶、茜素红、油红“O”、亚甲蓝染色呈阳性反应,表明WJMSCs可向成骨、成脂肪、成软骨细胞分化。QT-PCR定量检测WJMSCs表达心肌早期特异转录因子flk-1、Isl-1、Nkx2.5;WJMSCs在5-氮胞苷诱导下可以向心肌样细胞分化,表达心肌细胞特异标志α-actin,Tn T,GATA-4,connexin-43。大鼠经开胸结扎前降支,结扎后出现大面积心肌表面变苍白、且伴有室壁运动紊乱或减弱,心电图检查可见两个或两个以上相邻导联Q波形成且>1/4R波,宽度>0.04 s,左室射血分数≤45%,大鼠心肌梗死模型制作成功;细胞移植后进行超声心动图检查,移植组LVEF治疗后(61.62±8.74%)较治疗前(43.02±3.67%)及对照组治疗后(43.43±4.2%)相比均显着增高(P<0.01);LAVW移植组LAVW治疗后(1.84±0.36 mm)较治疗前(1.28±0.45 mm)及对照组治疗后(1.21±0.31 mm)相比显着增高(P<0.5);免疫荧光共聚焦、m RNA水平、蛋白水平进行心肌细胞特异标志α-actin、Tn T、GATA-4、connexin-43检测,WJMSCs移植组明显高于对照组。结论:研究表明WJMSCs在体外培养具有多向分化的潜能,具有心肌细胞早期转录因子,经5-氮胞苷诱导可向心肌细胞分化,表达心肌细胞所特有的细胞表面标志,证实WJMSCs在体外可以向心肌细胞分化;WJMSCs在体外移植到心肌梗死大鼠体内后,可明显改善大鼠心功能,病理检查心肌特异标志物明显高于对照组,在实验大鼠心梗模型上证实了WJMSCs在体内可以向心肌细胞分化。
参考文献：
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[2]. 5-氮胞苷体外诱导人骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究[D]. 王利霞. 郑州大学. 2005
[3]. 四种方法诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的电生理特性及意义[D]. 刘博武. 第四军医大学. 2012
[4]. 山羊骨髓间充质干细胞的分离培养及体外分化潜能的研究[D]. 庞全海. 西北农林科技大学. 2005
[5]. 表皮生长因子促进人毛囊间充质干细胞增殖的机制研究[D]. 白婷婷. 吉林大学. 2016
[6]. Notch信号系统在人骨髓间充质干细胞向内皮细胞诱导分化中的作用研究[D]. 欧书林. 第叁军医大学. 2016
[7]. 猪脂肪间充质干细胞的分离培养及体外诱导分化研究[D]. 屈长青. 西北农林科技大学. 2006
[8]. 人骨髓间充质干细胞体外向心肌样细胞诱导分化机制的研究[D]. 耿丹. 吉林大学. 2012
[9]. 黄芪甲苷对人骨髓间充质干细胞体外增殖及细胞因子表达的影响[D]. 彭小娟. 甘肃中医学院. 2014
[10]. 脐带华通胶源间充质干细胞向心肌细胞分化潜能的研究[D]. 张宁坤. 吉林大学. 2016
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