李俭杰, 张毅, 张明伟, 侯春梅, 吴英[1]2004年在《小鼠H-2半相合非清髓同种异基因造血干细胞移植模型的建立及其相关研究》文中研究说明为了探讨小鼠主要组织相容性抗原 (H 2 )半相合非清髓移植中预处理方案的可行性、移植后的造血重建、嵌合体水平及GVHD的发生情况 ,以CB6F1小鼠为受鼠 ,分为 3组 ,移植前 5天开始给予预处理 ,A组给予清髓(10 .5Gy)预处理方案 ,B组给予全身照射 (2Gy) +Ara C +Cy ,C组为全身照射 (2Gy) +Ara C +Cy +Flu ,对所有受鼠均未进行GVHD防治。所有受鼠在第 0天经尾静脉注射C5 7BL 6小鼠混合细胞悬液 (2× 10 7骨髓细胞 +1×10 7脾细胞 ) ,然后观察其造血恢复、植入及移植物抗宿主病 (GVHD)的情况。结果表明 :A组植入结果始终为完全供者型嵌合体 ,B和C组则为混合型或完全供者型嵌合体 ,其中B组混合嵌合体保持在 80 %以下 ,且在移植 5 0天以后有下降趋势 ,而C组嵌合体水平保持在 80 %以上 ,其嵌合接近或为完全供者型 ,移植 5 0天以后仍保持稳定。由于没有给予GVHD防治措施 ,各组均发生不同程度的GVHD ,其中A组受鼠GVHD的发生率和死亡率明显高于B和C两组 (P≤ 0 .0 1) ,但B和C两组之间无显着差异。结论 :以氟达拉宾为主的非清髓预处理方案 ,能够在受者体内形成稳定且持久的植入 ,并通过在受者体内形成混合性嵌合体 ,诱导供体对受体的特异免疫耐受 ,减少或避免GVHD的发生。
李剑杰[2]2003年在《小鼠H-2半相合非清髓造血干细胞移植模型的建立》文中认为临床上HLA完全相合的造血干细胞移植GVHD轻，移植成功率高，但随着越来越多单子女家庭的出现，很难找到HLA相合的亲缘供者。HLA半相合或不相合供者来源广泛，但移植后GVHD的发生率和致死率均较高，严重限制了其临床的应用。 非清髓异基因造血干细胞移植(NAST)是在传统清髓性异基因造血干细胞移植的基础上，结合近年来免疫学和移植学研究的新进展而发展起来的新的移植方法，其特点是显着降低了预处理强度并加强了免疫抑制治疗，形成稳定的混合嵌合体或完全供者型嵌合体，通过建立混合嵌合体诱导移植耐受，从而减轻了GVHD的发生。 我们是否可以用非清髓的移植模式进行半相合骨髓移植?既扩大了供者来源，又降低了移植并发症，基于这一设想，本文建立小鼠H-2半相合非清髓造血干细胞移植模型并进行相关研究。 本实验采用P→F1移植模式，分为3组，每组24只，A组(清髓)：10.5Gy TBI；B、C组(非清髓)分别：Ara-C+Cy+TBI(2.OGy)、Ara-C+Cy+Flu+TBI(2.OGy)。根据所输细胞不同，每组进一步分3个亚组：0组：仅给予预处理，不输注供鼠细胞；Ⅰ组：输入2×10~7供鼠骨髓细胞；Ⅱ组：2×10~7骨髓细胞+5×10~7脾细胞的混合悬液。探讨H-2半相合非清髓骨髓移植预处理方案的可行性及移植后GVHD的发生率。 结果显示：清髓组未输注供体造血干细胞的小鼠，均未检测到供体细胞的存在，并早期死亡；而非清髓BO、CO组小鼠未输注供体造血细胞，可在2 军事医学科学院硕士论文 中文摘要 周左右无供体植入恢复自身造血。清髓移植组和非清髓移植组输入供体造血 干细胞者的小鼠均可恢复造血，并有供体细胞植入。其中清髓移植组AI、All 小鼠体内均形成完全供者型嵌合体：而非清髓各移植组则形成混合嵌合体或 完全供者型嵌合体，其中CI、Cll供者嵌合体最高达90％以上，且较稳定， 移植后十50天仍稳定保持在50％以上。而BI、Bll组移植后嵌合体水平在40％～ 70％之间，且有下降趋势，移植后50天下降至30％左右。 除未输注供者造血细胞0组及仅输注骨髓细胞I组，其余清髓组及非清 髓组小鼠均不同程度上发生了 GVHD。其中清髓组为 100％，非清髓B组和 C 组分别75％、62．5％，清髓组GVHD发生率明显高于非清髓组（P＜0．01），而 非清髓各组GVHD发生率无明显统计学差异。但非清髓Cll 组接受接受 CSA＋MTX预防GVHD组的GVHD的发生率明显低于其它各组（P＜0．01）。 上述结果表明：移植小鼠对非清髓预处理方案有较好的耐受性，并且较为 安全。非清髓各组小鼠给予非清髓预处理而不予供体细胞输注能够恢复自身 造血，移植小鼠能够在体内形成稳定的供体细胞植入，而且GVHD较轻。两种 不同的非清髓预处理方案，移植后GVHD发生率无差异，相比较而言，C组供 体植入更好，是更理想的非清髓预处理方案。
李新[3]2003年在《H-2半相合小鼠非清髓骨移植GVHD预防及相关研究》文中指出非清髓造血干细胞移植(NST)采用骨髓非清除性预处理，通过加强移植前后的免疫处理，以诱导供受者双向免疫耐受，使供者细胞稳定植活，逐步替代受者细胞，重建造血和免疫功能，并充分发挥GVL／GVT效应，是异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)研究的最新进展。HLA半相合移植可使更多的患者得到移植的机会，但GVHD发生率和死亡率均很高，严重限制了其临床应用。是否可采用非清髓移植模式进行HLA半相合造血干细胞移植，以跨越MHC屏障，降低GVHD发生率和严重程度，是值得研究的重要课题。 本实验采用P→F1移植模式，以C57BL／6J小鼠为供鼠，C57BL／6J×BALB／C杂交F1代小鼠为受鼠，以氟达拉滨(F1u)、阿糖胞苷(Ara-C)、环磷酰胺(CTX)联合2Gy全身照射组成非清髓性预处理方案，建立了H-2半相合小鼠非清髓骨髓移植GVHD模型。实验小鼠共分5组：第1组仅给予非清髓性预处理，不予供鼠细胞移植；第2组在移植后不予aGVHD预防；第3、4、5组小鼠分别给予环孢霉素(CSA)+甲氨喋呤(MTX)、CSA+霉酚酸酯(MMF)、CSA+MTX+MMF方案预防aGVHD。为利于研究，设H-2半相合小鼠清髓性骨髓移植对照组，预处理为10.5GyTBI，不予GVHD预防。 第1组小鼠在预处理后14天左右完全恢复自身造血。第2-5组小鼠在移植后+4天即可通过流式细胞术在脾细胞中检测到供者源细胞，其比例逐渐升高，+18天时最高，此后逐渐下降，第3-5组在+45天时供者源细胞比例仍稳定在60％以上。H-2半相合清髓性骨髓移植对照组小鼠在移植后+7天即可检测到完全供者嵌合体。并持续至小鼠因GVHD而死亡时。 未予 GVHD预防的第 2组小鼠有 15／20只（75％）平均在 24．5天出现典型的 GVHD症状，临床评分为4．0分，并全部在1周内死亡，皮肤、肝脏及小肠的病理组织学改变符合IllV度GVHD病理变化。GVHD预防组小鼠的GVHD发生率和致死率以及临床评分分别为第3组40％、62．5％、2．6分，第4组33．3％、60％、2．4分，第5组26．7％、50％、2．3分。较未予GVHD预防组显着降低（尸 MO．05＝＝。叁种方案间比较，其差异并无显着性（尸mo．05），但以CSA＋MTX＋MMF方案组的预防效果最好，CSA＋MMF方案组次之。病理学改变亦减轻，多为I二度GVHD病理变化。H－2半相合清髓性骨髓移植对照组小鼠在移植后2周左右均发生GVHD，在3周内全部死亡。 结果表明：我们设计的预处理方案是非清髓性的，可获得稳定的供者细胞植入。MMF联合CSA＋MTX的GVHD预防方案，不仅不会影响小鼠造血功能恢复，而且可显着降低GVHD发生率和致死率，病理改变亦明显减轻。这一研究为临床HLA半相合非清髓造血干细胞移植提供了可靠的实验依据。
李新, 孙万军, 艾辉胜[4]2004年在《H-2半相合小鼠非清髓性骨髓移植模型的建立》文中研究说明目的 建立H 2半相合小鼠非清髓性骨髓移植模型。方法 用氟达拉滨、阿糖胞苷、环磷酰胺联合60 Co 2Gy全身照射组成预处理方案 ,以C5 7BL/ 6J(H 2 b)为供鼠 ,以C5 7BL/ 6J×BALB/c杂交F1代小鼠为受鼠 ,进行H 2半相合骨髓移植 ,采用环孢素A联合甲氨蝶呤预防急性移植物抗宿主病 (aGVHD)。观察移植后小鼠造血恢复、aGVHD发生率及死亡率 ,5 0d内存活率。结果 移植小鼠平均在 (1 2 .0± 1 .6 )d造血恢复 ,仅接受预处理而不输注供鼠细胞的小鼠在 (1 3.5± 2 .0 )d恢复自身造血 ;移植小鼠移植后 +7d到 +45d内均可检测到供、受者混合造血细胞嵌合体 ;移植后 +2 2d～+2 5d小鼠出现典型的aGVHD症状。环孢素A联合甲氨蝶呤预防方案可有效降低aGVHD的发生率 ,并减轻其严重程度 ;aGVHD死亡率为 6 0 %,5 0d内存活率为 70 %。结论 以氟达拉滨、阿糖胞苷、环磷酰胺联合全身照射组成的非清髓性预处理方案 ,可在H 2半相合小鼠间进行成功的骨髓移植 ,并可产生稳定的供、受者混合造血细胞嵌合体。
李新, 张毅, 孙万军, 侯春梅, 张明伟[5]2003年在《环孢菌素A联合霉酚酸酯预防小鼠H-2半相合非清髓性骨髓移植后GVHD的发生》文中研究说明为探讨环孢菌素A(CSA)联合霉酚酸酯 (MMF)方案对小鼠主要组织相容性抗原 (H 2 )半相合非清髓性骨髓移植后急性移植物抗宿主病 (aGVHD)的预防作用 ,建立了H 2半相合小鼠 (供鼠为C5 7BL/6J,受鼠为C5 7BL/6J×BALB/C杂交F1代小鼠 )的非清髓性骨髓移植模型。采用CSA +MMF或CSA +MTX作为aGVHD预防方案 ,观察 5 0天 ,记录受鼠发生aGVHD情况。结果显示 ,未做aGVHD预防的小鼠在移植后 2 2 - 2 5天出现典型的aGVHD症状 ,aGVHD发生率为 75 % (15 /2 0 ) ,致死率为 10 0 % (15 /15 )。接受aGVHD预防的小鼠 ,aGVHD症状和病理表现均明显减轻 ,CSA +MTX方案组aGVHD发生率为 4 0 % (8/2 0 ) ,致死率为 6 2 .5 % (5 /8) ,CSA +MMF方案组aGVHD发生率为 30 % (6 /2 0 ) ,致死率为 5 0 % (3/6 ) ,均显着低于未预防组 (P <0 .0 5 ) ,但两预防组之间无显着性差异。结论 :CSA +MTX预防方案能有效降低H 2半相合非清髓性骨髓移植小鼠aGVHD的发生率和致死率 ,而CSA +MMF方案能进一步减轻aGVHD的症状及病理损害程度。
张诚[6]2008年在《人脐血源基质细胞对HLA半相合造血干细胞移植小鼠GVHD调节作用的探索》文中研究表明造血微环境(hematopoietic inductive microenvironment,HIM)是造血干/祖细胞定殖、分化、发育和成熟的场所。基质细胞作为造血微环境中的重要成分,不仅与造血细胞的自我更新、增殖分化、归巢定位以及在血液系统疾病的发生发展和转归过程中密切相关,在免疫调节中也具有重要的作用。因此,深入探讨基质细胞对造血及免疫的影响,对血液学的研究和发展十分重要。异基因造血干细胞移植是目前治疗血液肿瘤的有效手段之一,但仅有30%的患者能够找到全相合的供者。HLA半相合造血干细胞移植可使90%的患者找到相合的供者,但HLA半相合造血干细胞移植面临植入失败率高、造血重建慢、GVHD重、免疫重建迟、致死性感染发生率发生高、移植相关死亡率高等诸多障碍。因此,调控GVHD,达到降低HLA半相合造血干细胞移植相关死亡率和提高患者的生存率,是目前临床工作亟待解决的问题。本科室在前期工作中证实,脐血中存在基质细胞前体细胞,并能通过特定的细胞因子组合使人脐血源基质细胞(human umbilical cord blood- derived stromal cells, hUCBDSCs)得以有效扩增;扩增后的hUCBDSCs具有支持造血干/祖细胞扩增的作用。研究hUCBDSCs的免疫调节作用是一个新的探索课题。基于上述分析,本课题首先对hUCBDSCs原代培养MNCs的分离条件进行优化,同时体外探讨hUCBDSCs对小鼠GVHD调节作用,并进一步对hUCBDSCs在HLA半相合造血干细胞移植小鼠的造血重建及GVHD调节作用进行初步的探讨。一、本研究的主要内容和研究方法1.采用6%明胶联合Percoll两步分离法,改良Dexter基质细胞培养体系行hUCBDSCs培养,采用倒置显微镜观察不同分离方法培养的hUCBDSCs生长状况,瑞士染色观察细胞形态,细胞化学和免疫细胞化学进行细胞鉴定;CCK-8检测hUCBDSCs的增殖;2.体外进行混合细胞培养,采用CCK-8检测hUCBDSCs对小鼠脾脏淋巴细胞的增殖作用;采用流式细胞仪技术检测淋巴细胞细胞周期的变化;采用流式细胞仪术、荧光免疫细胞化学检测混合细胞培养中CD49b NK细胞、CD3 T细胞及CD49d粘附分子的表达变化,ELISA检测混合细胞培养上清中IL-4和IFN-γ细胞因子表达变化;采用扫描电子显微镜及荧光免疫组织化学进一步研究混合细胞培养中淋巴细胞粘附hUCBDSCs情况,初步探讨hUCBDSCs在体外对小鼠脾脏淋巴细胞的免疫调节作用,并以人骨髓基质细胞(hBMSCs)作为对照;3.以亲代C57BL/6 (H-2d♀)小鼠作为供体鼠,BABL/C (H-2b♂)×C57BL/6 (H-2d♀)的F1代(H-2b×d )为受体鼠,60COγ射线全身照射后,受体鼠接受供体鼠来源的骨髓细胞1×107个/只及脾细胞1×107个/只,进行HLA半相合造血干细胞移植,观察移植后小鼠存活期、嵌合率、GVHD临床表现和病理变化,构建HLA半相合造血干细胞移植小鼠GVHD模型;4.将体外培养的1×106个/只hUCBDSCs输入HLA半相合造血干细胞移植小鼠体内,观察hUCBDSCs对小鼠造血重建及CFU-F、CFU-GM、CFU-E、CFU-Mg形成能力的影响;5.在构建的GVHD模型基础上,加入1×106个/只hUCBDSCs,观察GVHD的发生情况;采用流式细胞仪术检测移植后受体小鼠脾脏不同时项点CD49b NK细胞、CD3 T细胞及CD49d粘附分子的表达,ELISA检测受体小鼠外周血上清中不同时项点IL-4和IFN-γ细胞因子的表达,荧光免疫组织化学检测受体小鼠GVHD靶器官粘附分子CD49d的表达;6.观察CM-DiI标记的hUCBDSCs在HLA半相合造血干细胞移植受体小鼠体内的迁移分布情况。二、实验结果1. hUCBDSCs原代培养MNCs分离条件的优化:采用6%明胶对脐血红细胞的沉降效果明显优于3%的明胶;6%明胶联合Percoll分离法在MNCs和CD34+细胞的回收率上明显优于3%明胶联合Ficoll分离(p<0.05);6%明胶联合Percoll分离法培养的hUCBDSCs在细胞增殖、48 h细胞贴壁数、细胞开始伸展时间、基质细胞集落开始形成及达最大的时间、细胞融合时间及培养成功率上明显优于3%明胶联合Ficoll分离法;两种分离法在细胞化学和免疫细胞化学、细胞形态等生物学特征无差别。2. hUCBDSCs对小鼠GVHD的体外调节作用:hUCBDSCs具有促进混合淋巴细胞培养体系中的淋巴细胞增殖的作用,hUCBDSCs联合rhIL-2促增殖作用更强(p<0.05),hUCBDSCs培养上清无促增殖作用;hUCBDSCs明显增加混合淋巴细胞培养体系中淋巴细胞S期和G2/M期的比例(p<0.05); hUCBDSCs和hBMSCs均促进CD49b NK细胞、降低CD3 T细胞和粘附分子CD49d(VLA-4)的表达,hUCBDSCs的作用更强(p<0.05);hUCBDSCs和hBMSCs均促进IL-4、降低IFN-γ表达,hUCBDSCs的作用更强(p<0.05);hUCBDSCs具有抑制CD49bIFN-γNK1和CD49bIL-4 NK2细胞的表达;随着培养时间的延长,粘附于hUCBDSCs的淋巴细胞越来越少,粘附细胞通过伪足与hUCBDSCs紧密粘附,部分细胞伸到hUCBDSCs下层;在第7天粘附的CD3 T细胞和CD49b NK细胞均明显少于第3天。3.成功构建HLA半相合造血干细胞移植小鼠GVHD模型。4.hUCBDSCs促进HLA半相合造血干细胞移植小鼠造血重建。5. hUCBDSCs对HLA半相合移植小鼠GVHD的调节作用:hUCBDSCs明显降低小鼠的死亡率,延长其生存期(p<0.05);组织病理学评分及GVHD临床积分均显示联合hUCBDSCs移植组小鼠GVHD发生程度明显低于单纯BMT组(p<0.05);联合hUCBDSCs移植明显促进受体小鼠外周血中IL-4表达,抑制IFN-γ表达(p<0.05);联合hUCBDSCs移植增加受体小鼠脾脏CD49b NK细胞、降低CD3 T细胞及粘附分子CD49d的表达(p<0.05);联合hUCBDSCs移植明显降低GVHD靶器官粘附分子CD49d (VLA-4)的表达(p<0.05)。6. CM-DiI标记的hUCBDSCs早期在HLA半相合造血干细胞移植小鼠的大多数器官中表达,其后主要在骨髓、免疫器官脾脏及皮肤、肝脏及小肠等GVHD主要靶器官中持续表达,而在其它器官中,表达逐渐减弱,甚至消失。叁、结论1.在本实验条件下,改良的6%明胶联合Percoll两步分离法是hUCBDSCs原代培养的最佳分离条件;2. hUCBDSCs促进HLA半相合造血干细胞移植小鼠造血重建;3. hUCBDSCs移植后主要迁移到骨髓、脾脏及GVHD的主要靶器官;4. hUCBDSCs具有减轻GVHD的作用;hUCBDSCs通过刺激NK细胞、抑制T细胞增殖,增强IL-4、降低IFN-γ细胞因子的表达及降低粘附分子CD49d (VLA-4)的表达减轻GVHD。
李新, 孙万军, 张毅, 侯春梅, 吴英[7]2004年在《H-2半相合小鼠非清髓骨髓移植后移植物抗宿主病的研究》文中指出非清髓造血干细胞移植(NST)是当前造血干细胞移植领域的研究热点。而移植物抗宿主病(GVHD)仍然是制约临床主要组织相容性抗原(MHC)半相合或不全相合移植成功的主要原因。本研究在建立MHC半相合非清髓骨髓移植(BMT)小鼠模型的基础上,采用环孢菌素A(
李新, 孙万军, 原野, 毛宁, 艾辉胜[8]2005年在《小鼠H-2单倍相合非清髓骨髓移植后细胞因子表达的动态研究》文中进行了进一步梳理为了探讨H-2单倍相合小鼠非清髓骨髓移植后细胞因子表达变化在急性移植物抗宿主病(aGVHD)发生发展中的意义,建立了H-2单倍相合小鼠非清髓骨髓移植模型,环孢菌素A(CsA)联合霉酚酸酯(MMF)预防aGVHD,采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测移植后不同时间点上小鼠脾脏中IL-2、INF-γ、IL-4及IL-10的mRNA的表达。结果显示:仅接受非清髓性预处理小鼠的脾脏中各因子的mRNA表达较预处理前略有升高。未做aGVHD预防给药的小鼠(第2组)IL-2、IFN-γ的mRNA表达水平在移植后急剧升高,分别在21天、14天达峰值,之后显着下降,35天时基本恢复至移植前水平。接受GVHD预防给药的小鼠(第3组)IL-2、IFN-γ的mR-NA表达的变化趋势与第2组相似,但峰值明显低于第2组。第2组和第3组小鼠IL-4的mRNA表达水平均在移植后14天达峰值,但第3组的峰值较第2组为高,且在此后的下降中较第2组缓和。IL-10的mRNA表达水平在移植后逐渐升高,在14天达到一个高峰,21天时下降,之后再次升高直至35天。结论:H-2单倍相合小鼠非清髓骨髓移植后脾脏内IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-10均呈上调表达,应用CsA和MMF则可下调IL-2和IFN-γ的mRNA表达水平,从而降低了aGVHD的发生率和严重程度。
曲建华[9]2007年在《亲属HLA单倍体外周血干细胞移植治疗恶性血液病的临床和实验研究》文中研究说明异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是目前可治愈白血病、骨髓增生异常综合征等恶性血液病的最有效方法,而异基因外周血干细胞移植(allo-PBSCT)的主要优点为移植后造血重建快,感染并发症少,且避免了对供体麻醉及多部位穿刺采集骨髓细胞的不便,使供者更易接受,目前已有取代异基因骨髓移植(allo-BMT)的趋势。但由于找到人类白细胞抗原(HLA)相合供者的几率很低,尤其在我们新疆少数民族地区更为明显,而限制了其广泛的应用,很多患者则因无合适供者失去移植治疗的机会而死亡。如能跨越HLA限制建立HLA单倍体相合移植将使HSCT更广泛应用,会使需要移植的恶性血液病患者基本都能及时在身边找到合适供者。但与HLA相合移植比较,由于HLA不同的免疫学障碍,HEA单倍体相合移植面临植入失败率高、造血重建慢、移植物抗宿主病(GVHD)重、免疫重建延迟、致死性感染发生率高、移植相关死亡率高等诸多障碍。为了克服HLA限制就必须在临床上尽可能地建立免疫耐受,免疫耐受是指机体只对以前接触过的特定抗原不应答,而对不引起耐受的其它抗原仍能进行良好的免疫应答,免疫耐受具有的免疫特异性与免疫缺陷或药物引起的对免疫系统的普遍抑制作用相比具有显而易见的优势,如果能够成功诱导免疫耐受,HLA单倍体相合移植将会取得与全相合移植相同的临床效果,从而显着扩大移植的适应征,提高患者的存活率。所以在器官移植日益发展的今天,对免疫耐受产生的机制及人工诱导免疫耐受方法的研究受到了科学界的广泛关注,是亟待解决的医学课题。目前结合国内外文献报道,造血干细胞移植中诱导免疫耐受的方法许多仍在动物实验或临床实验研究阶段,真正用于临床还需要更多的研究和探索,本研究首先旨在临床上对单倍体相合PBSCT患者采用切实可行的方案实施免疫耐受诱导,并且从临床治疗效果、嵌合体形成、细胞因子及免疫重建等实验角度来探讨是否达到免疫耐受,并与同期进行的全相合PBSCT进行对照研究,以探讨方案的可行性。第一部分亲属HLA单倍体外周血干细胞移植治疗恶性血液病的临床研究目的:探讨应用亲属HLA单倍体相合allo-PBSCT治疗恶性血液病的疗效。方法:亲属供者HLA单倍体相合未去除T细胞(TCD)的allo-PBSCT治疗恶性血液病患者20例,移植后结果与同期连续完成的25例供受者HLA全相合组相比较。用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对供者进行外周血干细胞(PBSC)动员,动员前后检测外周血及单采PBSC移植物中单个核细胞(MNC)及CD34~+细胞数。预防GVHD方案在HLA全相合移植者采用环孢素A(CsA)+氨甲喋呤(MTX)标准方案,HLA一个位点不合者在上述方案基础上加用霉酚酸酯(MMF),2～3个位点不合者在CsA+MTX+MMF方案的基础上又加用抗胸腺细胞球蛋白(ATG)及CD25单抗。结果:单倍体组和全相合组输入的MNC的中位数分别为14.62(8.59-31.78)×10~8/kg体重及14.45(7.62-19.9)×10~6/kg体重,单倍体组和全相合组输入的CD34~+细胞的中位数分别为9.13(4.57-41.78)×10~6/kg体重及6.58(2.31-18.89)×10~6/kg体重。45例患者全部植活,20例单倍体患者中位数植活时间为13(10～20)d,现中位数随访时间21(2～64)个月,无白血病存活17例(85%),25例全相合患者中位数植活时间为14(8～17)天,现中位数随访时间23(6～40)个月,无白血病存活20例(80%)。HLA全相合组及单倍体组2年预期无病生存率分别为77.2%和76.4%(P＞0.05),单倍体组的aGVHD发生率(35%)与全相合组(8%)相比无显着差异(P＞0.05),cGVHD的发生率在两组间(45%,40%)亦无显着差异(P＞0.05),MNC及CD34~+细胞数与aGVHD及cGVHD的发生率均无相关性。结论:1)在CsA+MTX标准方案的基础上依据HLA不合的差异程度适当增加免疫抑制剂可减少和减轻亲属HLA单倍体相合PBSCT中GVHD的发病率及严重性并改善生存率。2)应用亲属HLA单倍体相合PBSCT可以突破HLA障碍,显着扩大移植的适应征。第二部分亲属HLA单倍体外周血干细胞移植供受者嵌合体形成的动态检测目的:建立荧光标记的多重扩增短串联重复序列(STR)结合毛细管电泳定量检测allo-PBSCT供受者嵌合体的方法,并探讨嵌合体形成与免疫耐受及临床预后的关系。方法:采用PE9700扩增仪扩增15个STR位点:D8S1179、D21S11、D7S820、D3S1358、CSFIPO、THO1、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、VWA、TPOX、D18S51、D5S818、FGA位点和一个性别位点Amelogenin,用3130XL型DNA测序仪对上述位点进行基因型分析,并比较供受者移植前后的基因型,确定嵌合体的形成类型,以作为异基因造血干细胞移植中的植活证据,同时用无关个体的DNA混合实验进行可行性和准确性研究。结果:用该方法分析35例移植对的结果显示:其中32例在15个STR位点中均至少有两个可以区分供受者的有信息位点(有3例无移植前受者标本),35例患者均在移植后1个月时STR位点及性别位点转为供者型,形成了完全供者嵌合体(CC),且HLA单倍体相合的15例患者也达到了100%的供者植入,部分患者于14天抽血时即转为供者型,并在随访过程中持久不变。35例患者同时进行移植后红细胞抗原、性染色体及PCR结合聚丙烯酰胺凝胶电泳检测嵌合体形成,对HLA单倍体相合患者同时进行移植后HLA分型检测,上述指标均于移植后不同时间转为供者型。扩增产物中供受者DNA含量的百分比同扩增前混合样本的比例呈显着直线相关(P＜0.01),最小检出DNA百分比为5%。结论:1)用基因分析仪对STR位点进行基因型检测具有快速、无污染和自动化高、可定量及灵敏度高等优点,用于检测allo-PBSCT植活状态是可靠的。2)本组移植患者所采用的诱导免疫耐受的方法可以成功地诱导CC的形成。第叁部分亲属HLA单倍体外周血干细胞移植患者外周血Th1/Th2型细胞因子与GVHD的关系目的:探讨单倍体allo-PBSCT患者外周血淋巴细胞中Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4水平的变化及其临床意义。方法:用流式细胞仪动态检测28例行allo-PBSCT患者外周血淋巴细胞中IFN-γ和IL-4的水平。结果:13例单倍体相合患者移植后IFN-γ的水平逐渐降低,并自+6个月开始显着低于移植前水平(P＜0.05),于+18个月时达最低值;而IL-4的水平在移植后初期呈下降趋势,在+1月至+6月时显着低于移植前水平(P＜0.05),但自+12月至+18月时显着高于移植前水平;15例全相合组患者移植后IFN-γ的水平也逐渐降低,而IL-4的水平在移植后呈上升趋势,在+18月时显着高于移植前水平。两组IFN-γ和IL-4的水平在移植后不同时间均无显着差异。所有患者均获得造血重建,其中5例发生aGVHD,8例发生cGVHD,IFN-γ在aGVHD~+组显着高于aGVHD~-组(P＜0.05),而IL-4的水平在两组间无显着差异(P＞0.05)。IFN-γ和IL-4的水平在cGVHD~+组和cGVHD~-组之间均无显着差异(P＞0.05)。结论:1)IFN-γ在人类aGVHD的发病中起重要的正向调节作用,可干扰免疫耐受的形成,移植后动态检测IFN-γ水平有助于预测aGVHD的发生。2)加强的预处理及预防GVHD方案对单倍体组IFN-γ和IL-4的表达并无显着影响。第四部分亲属HLA单倍体外周血干细胞移植后免疫功能的随防研究目的:探讨HLA单倍体相合allo-PBSCT后免疫功能重建的规律,及时指导移植后感染的防治。方法:采用间接免疫荧光法测定上述15例单倍体相合患者在接受allo-PBSCT后外周血T(CD3、CD4、CD8)、B(CD19)、NK(CD56)细胞亚群的动态变化,结果与同期连续完成的25例HLA全相合患者相比较,以32名健康供者测定的结果作为对照。结果:1)CD3~+、CD4~+、CD4~+/CD8~+在+1月时均比正常对照显着下降,CD3~+细胞在+3月时即恢复正常,CD4~+细胞在+3月时仍显着低于正常对照,在+6～+12月时基本达到正常;CD8~+细胞的恢复较快,在+1月时仅比正常对照略下降,而在+3月、+6月时已显着高于正常对照,于+12月后逐渐恢复正常;CD4~+/CD8~+在移植后逐渐下降,在+1、+3、+6月时均比正常对照显着下降,且在+3月及+6月时呈倒置现象,+12月后逐渐恢复正常;CD19~+B细胞在移植后无下降,且在移植+1月及+18月显着高于正常对照;CD56~+NK细胞在移植后也无明显下降,且在移植+3月时显着高于正常对照。2)全相合和单倍体相合组的T、B、NK细胞亚群在+1月、+6月、+12月时相比均无显着差异,但在移植+3月时,单倍体相合组的CD3~+、CD8~+细胞显着高于全相合组(P＜0.05),而CD4~+/CD8~+显着低于全相合组,且呈倒置。3)在移植后早期+1月和+3月时aGVHD~+组和aGVHD~-组的各淋巴细胞亚群均无显着差异(P＞0.05);在移植后+1月时cGVHD~+组的CD4~+细胞显着高于cGVHD~-组(P＜0.05),其它时间段两组各淋巴细胞亚群均无显着差异(P＞0.05)。结论:1)多种免疫抑制剂的联合应用对HLA单倍体未进行TCD的allo-PBSCT免疫重建的速度无显着影响,值得推广应用。2)aGVHD和cGVHD的发生对allo-PBSCT免疫重建无重大影响。
任秀宝[10]2006年在《活化动员亲缘间HLA半相合异基因单个核细胞治疗恶性实体瘤的基础和临床实验研究》文中研究表明第—部分:活化动员的亲缘间HLA半相合异基因单个核细胞治疗晚期转移或化疗抵抗性 实体瘤初步观察 目的:初步探讨活化动员的亲缘间HLA半相合异基因单个核细胞治疗晚期转移性/化疗抗性实体瘤的可行性。方法:11例晚期转移性/化疗抵抗性恶性实体瘤患者,供者为与患者HLA半相合直亲属。供者经10μg/kg·d G-CSF动员3天后采集haplo-HSCs,体外用大剂量rhIL-2培养激活4h后回输患者。观察治疗后临床反应;采用流式细胞仪、LDH和ELISA试剂盒检测动员、活化前后表型,IL-2短期活化前后的非特异性杀瘤活性以及患者回输前后血清中各种细胞因子的含量变化。结果:11例患者回输的单个核细胞总数达(2.5～4.3)x10~(10)。经G-CSF动员后T细胞,尤其是CD4~+T细胞显着下降,而NK细胞比例显着上升;经大剂量IL-2短期活化后,活化细胞(包括CD69~+和CD25~+细胞)亚群比例显着升高。体外实验中可观察到IL-2短期活化的单个核细胞具有类似LAK样的较高的非特异性杀瘤活性。经过治疗,11例患者血清中Th1类细胞因子,如IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α含量明显升高,而Th2类细胞因子,如TGF-β含量明显下降。治疗后8例观察到临床症状的缓解,或肿瘤标志物的降低,或影像学资料的改善,其中1例治疗后4月时达到临床PR,1例在治疗后9月达到MR,2例无效,截至1年随访期结束时共有6例患者仍病情稳定,而有5例死亡。结论:IL-2短期活化的HLA半相合的单个核细胞具有明显的抗肿瘤效应,为治疗晚期转移性/化疗抗性实体瘤提供了新的希望。
参考文献：
[1]. 小鼠H-2半相合非清髓同种异基因造血干细胞移植模型的建立及其相关研究[J]. 李俭杰, 张毅, 张明伟, 侯春梅, 吴英. 中国实验血液学杂志. 2004
[2]. 小鼠H-2半相合非清髓造血干细胞移植模型的建立[D]. 李剑杰. 中国人民解放军军事医学科学院. 2003
[3]. H-2半相合小鼠非清髓骨移植GVHD预防及相关研究[D]. 李新. 中国人民解放军军事医学科学院. 2003
[4]. H-2半相合小鼠非清髓性骨髓移植模型的建立[J]. 李新, 孙万军, 艾辉胜. 中华器官移植杂志. 2004
[5]. 环孢菌素A联合霉酚酸酯预防小鼠H-2半相合非清髓性骨髓移植后GVHD的发生[J]. 李新, 张毅, 孙万军, 侯春梅, 张明伟. 中国实验血液学杂志. 2003
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[7]. H-2半相合小鼠非清髓骨髓移植后移植物抗宿主病的研究[J]. 李新, 孙万军, 张毅, 侯春梅, 吴英. 解放军医学杂志. 2004
[8]. 小鼠H-2单倍相合非清髓骨髓移植后细胞因子表达的动态研究[J]. 李新, 孙万军, 原野, 毛宁, 艾辉胜. 中国实验血液学杂志. 2005
[9]. 亲属HLA单倍体外周血干细胞移植治疗恶性血液病的临床和实验研究[D]. 曲建华. 新疆医科大学. 2007
[10]. 活化动员亲缘间HLA半相合异基因单个核细胞治疗恶性实体瘤的基础和临床实验研究[D]. 任秀宝. 天津医科大学. 2006