联苯代谢对微生物生长胁迫及分裂抑制的研究

论文摘要

红球菌R04（Rhodococcus sp.R04）是一株可以有效降解联苯/多氯联苯的革兰氏阳性细菌,课题组前期已经对其降解联苯/多氯联苯的功能做了大量研究,在研究中发现,红球菌R04代谢联苯的过程中联苯也反作用于R04细胞,使细胞分裂受阻,无法形成正常的分裂隔膜,且代谢过程中会产生一系列的代谢产物,如2,3-二羟基联苯（DHBP）、2-羟基-6-酮基-6-苯基-2,4-己二烯酸（HOPDA）等,究竟是哪种代谢产物或者联苯自身对红球菌R04细胞分裂产生的强大抑制作用还不清楚;同时在细胞分裂过程中,FtsZ作为重要的分裂蛋白对细胞有重要的意义,联苯胁迫下红球菌R04细胞出现的分裂异常是否与FtsZ蛋白有直接关系这是本研究要重点解决的问题。在本研究中,成功将红球菌R04的FtsZ蛋白在大肠杆菌BL21中进行异源表达,表达量高且为可溶性蛋白,通过钴柱或镍柱亲和层析,得到纯度较高的FtsZ蛋白并制备多克隆抗体。多克隆抗体的成功制备,为进一步深入研究FtsZ蛋白在红球菌R04中的定位以及表达情况提供有力材料,可以通过Western blot检测在联苯培养下红球菌R04细胞内不同时期FtsZ蛋白的表达情况,也可以利用免疫荧光技术观察联苯及其代谢物培养下细胞处于对数期时FtsZ蛋白在胞内的定位情况,为进一步研究FtsZ蛋白与红球菌R04细胞分裂和隔膜形成之间的相互作用关系提供理论基础。为了进一步研究红球菌R04 FtsZ蛋白在大肠杆菌中的表达定位以及对大肠杆菌形态的影响,我们构建了融合表达质粒pET-m3c-ftsZ-rfp,通过IPTG诱导含有融合表达质粒的大肠杆菌发现,随着IPTG浓度的升高,大肠杆菌丝状化明显,细胞分裂受到阻滞,通过对FtsZ蛋白进行荧光标记发现细胞分裂过程中FtsZ定位于Z环处,可以说明FtsZ蛋白作为细胞分裂相关蛋白参与了隔膜环的形成,影响细胞的形态和分裂。其次我们还用联苯及其代谢物培养了含有融合表达质粒的大肠杆菌,研究发现DHBP培养条件下,大肠杆菌细胞体积明显缩小,生长停滞,FtsZ蛋白几乎不表达,所以我们推测联苯代谢物2,3-二羟基联苯（DHBP）对大肠杆菌的分裂以及FtsZ蛋白的表达产生强烈的抑制作用。为了研究是联苯自身还是其代谢物对细胞产生的抑制作用,我们分别用联苯培养代谢酶缺陷型红球菌R04及几种模式菌株,发现与前体-联苯及代谢产物HOPDA相比,DHBP对所有研究对象,不论是G+或是G-细菌,或是酵母细胞分裂都有较强的抑制和形态的改变。DHBP可使代谢酶缺陷型红球菌R04分裂时形成不完整的隔膜,分裂一侧或端部出现肿胀的小结,影响其正常分裂;DHBP导致大肠杆菌BL21生长缓慢,细胞体积缩小,细胞表面发生凹陷,胞质内容物流失;DHBP抑制枯草芽孢杆菌WB600分裂,细胞体积明显缩小,而联苯存在时,枯草芽孢杆菌隔膜异常,菌体比对照长约23倍;用DHBP处理过的金黄色葡萄球菌、红酵母,其分裂受到影响,具有分裂隔膜的金黄色葡萄球菌细胞明显变少,出芽生殖的红酵母细胞比例也从64.2%下降到19.3%。

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第一章文献综述

1.1 细胞分裂

1.2 联苯及多氯联苯

1.2.1 联苯及多氯联苯的危害

1.2.2 联苯及多氯联苯的降解

1.3 红球菌R04概述

1.4 细胞分裂相关蛋白FtsZ

1.4.1 FtsZ蛋白的结构与性质

1.4.2 FtsZ蛋白在细胞分裂中的功能与抑制

1.4.3 几种与FtsZ有相互作用的分裂蛋白

1.4.4 FtsZ蛋白的体外装配

1.5 本课题研究的目的与意义

1.6 参考文献

第二章红球菌R04FtsZ蛋白纯化与抗体制备

2.1 材料

2.1.1 菌株、质粒和培养基

2.1.2 主要试剂和仪器

2.2 方法

2.2.1 引物设计

2.2.2 目的基因ftsZ的扩增

2.2.3 重组质粒的构建及鉴定

2.2.4 FtsZ蛋白的诱导表达

2.2.5 FtsZ蛋白的纯化

2.2.6 FtsZ蛋白多克隆抗体的制备

2.3 结果

2.3.1 FtsZ蛋白基因的克隆

2.3.2 重组表达载体的构建与鉴定

2.3.3 FtsZ蛋白的诱导表达

2.3.4 FtsZ蛋白的纯化

2.3.5 FtsZ蛋白多克隆抗体的制备与检测

2.4 小结与讨论

2.5 参考文献

第三章联苯代谢下红球菌R04FtsZ蛋白在大肠杆菌中的表达定位及其对大肠杆菌分裂的影响

3.1 材料

3.1.1 菌株、质粒和培养基

3.1.2 主要试剂和仪器

3.2 方法

3.2.1 引物设计

3.2.2 目的基因ftsZ的扩增

3.2.3 重组质粒的构建及鉴定

3.2.4 FtsZ-RFP融合蛋白的诱导表达

3.2.5 FtsZ蛋白在大肠杆菌中的表达定位

3.2.6 联苯代谢对FtsZ蛋白及大肠杆菌分裂的抑制

3.3 结果

3.3.1 重组质粒的构建

3.3.2 FtsZ-RFP融合蛋白的诱导表达

3.3.3 FtsZ蛋白在大肠杆菌中的表达定位

3.3.4 联苯及其代谢物对FtsZ蛋白及大肠杆菌分裂的抑制

3.4 小结与讨论

3.5 参考文献

第四章联苯代谢对不同微生物的生长胁迫及分裂抑制

4.1 材料

4.1.1 菌株、培养基和生长条件

4.1.2 主要试剂和仪器

4.2 方法

4.2.1 HOPDA的制备

4.2.2 荧光显微镜观察

4.2.3 扫描电子显微镜观察

4.3 结果

4.3.1 联苯及其代谢物对代谢酶缺陷型红球菌R04分裂的抑制

4.3.2 联苯及其代谢物对大肠杆菌BL21分裂的影响

4.3.3 联苯及其代谢物对枯草芽孢杆菌WB600分裂的影响

4.3.4 联苯及其代谢物对金黄色葡萄球菌分裂的影响

4.3.5 联苯及其代谢物对红酵母分裂的影响

4.4 小结与讨论

4.5 参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简况与联系方式

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘亚妮

导师: 杨秀清

关键词: 联苯代谢,红球菌,蛋白,细胞分裂

来源: 山西大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 山西大学

分类号: Q935

DOI: 10.27284/d.cnki.gsxiu.2019.000728

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