导读:本文包含了基因克隆系统论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:基因,系统,蛋白,核糖体,碱基,线粒体,阳离子。
基因克隆系统论文文献综述
杨丹丹,谢永广,宾石玉,罗华辉,安苗[1]（2019）在《波纹鳜线粒体基因克隆及系统发育信息分析》一文中研究指出为了探讨鳜类线粒体基因组结构特征及系统发育信息,以期为鳜类遗传学研究和分子标记提供参考依据,本文将波纹鳜Siniperca undulata线粒体随机切割成长度为1～3 kb的15个片段,采用PCR产物直接测序法获得波纹鳜线粒体全基因组,并提交至NCBI数据库,获得登录号KJ644783。结果分析发现:波纹鳜线粒体包含13个编码蛋白基因、22个tRNA、2个rRNA以及一个超变区(D-loop),基因排列顺序与其他硬骨鱼类似,不存在基因重排现象。整个基因组存在明显的AC偏好性,其中G碱基含量非常低,仅仅为16.23%。系统发育信息分析结果显示,CO1、ND5、CYTB、ND4基因具有较好的进化适应性,能够较好地反映鳜类的系统发育关系。进一步的进化分析显示,鳜类分成了鳜属和少鳞鳜属。(本文来源于《广西师范大学学报(自然科学版)》期刊2019年04期）
池玉杰,闫洪波,吴书景[2]（2019）在《偏肿革裥菌系统发育与Lg-mnp2和Lg-mnp3基因克隆及结构特征》一文中研究指出白腐菌偏肿革裥菌Lenzites gibbosa能分泌降解木质素的锰过氧化物酶(MnPs),为进一步鉴定试验菌株,对菌株L. gibbosa CB1进行了ITS序列(Gen Bank登录号为JF279440)扩增与测序,并进行了基于ITS序列的比对与系统发育分析,结果表明CB1与桦革裥菌L. betulina和栓菌属Trametes等相关白腐菌的亲缘关系较近而聚类在一起,并与24个同种其他菌株的ITS序列覆盖度在85%～97%期间内的相似性都为99%,说明该菌株为偏肿革裥菌。为了获得该菌株多个编码MnP家族的基因,从而为研究MnP基因的表达调控奠定序列结构的基础,根据已知白腐菌MnPs基因保守区和已经扩增出的基因片段设计引物,以L. gibbosa CB1的基因组DNA和总RNA为模板,采用PCR、RT-PCR、RACE及染色体步移等方法,克隆到该菌株编码MnP2和MnP3的全长c DNA和DNA基因(Gen Bank登录号分别为JQ388597、JN571114; JQ411249、JN571116),分别命名为Lg-mnp2和Lg-mnp3。2个基因DNA全长分别为2 869、3 992 bp,都含有6个外显子和5个内含子;其启动子区域都含有TATA-Box、CAAT-Box、AP2、MRE等顺式作用元件,Lg-mnp2还含有AP1,Lg-mnp3还含有HSE;其c DNA基因分别含有50、52 bp的5'UTR,150、249 bp的3'UTR和1098、1 101 bp的完整开放阅读框ORF,分别编码了365、366个氨基酸的蛋白质多肽前体(Gen Bank登录号分别为AFC37493、AFC37494),成熟的Lg-mnp2蛋白含有339个氨基酸,比Lg-MnP1蛋白(Gen Bank登录号为ACO92620)多1个氨基酸;成熟的Lg-mnp3蛋白含有340个氨基酸,比Lg-MnP2蛋白多1个氨基酸。(本文来源于《东北林业大学学报》期刊2019年02期）
苏强,赵晗,崔百会,宋冰雪,宗成文[3]（2017）在《笃斯越桔rbcL基因克隆与系统发育分析》一文中研究指出以汪清县兰家林场采集的笃斯越桔叶片为样本,采用PCR方法扩增rbcL基因,分析rbcL序列在笃斯越桔及其近缘植物的序列差异,分析其系统发育关系。结果表明:克隆得到的笃斯越桔rbcL基因片段长599bp,编码199个氨基酸残基。核苷酸多序列比对发现,笃斯越桔与欧洲越桔和小叶越桔在第68和390碱基位置有差异,并从构建的系统发育树中得出笃斯越桔和卵叶越桔首先聚为一类,说明笃斯越桔和卵叶越桔亲缘关系更近。(本文来源于《延边大学农学学报》期刊2017年03期）
王志强,张洪波,张君,徐尚荣,彭巍[4]（2017）在《初情期母牦牛下丘脑kiss-1/GPR54系统基因克隆》一文中研究指出应用聚合酶链反应和基因克隆技术,对10头初情期母牦牛下丘脑kiss-1/GPR54系统基因进行扩增和基因克隆。结果表明,kiss-1基因拼接后序列全长为291bp,其中CDS序列长为282bp,序列中碱基组分为腺嘌呤20.62%,鸟嘌呤27.14%,胸腺嘧啶23.37%,胞嘧啶28.87%。共编码95个氨基酸,其中丙氨酸占总氨基酸残基的11.58%,亮氨酸占10.52%,丝氨酸、甘氨酸、脯氨酸各占9.47%。GPR54基因拼接后序列全长为202bp,其中CDS序列长为196bp,序列中碱基组分为腺嘌呤16.34%,鸟嘌呤30.69%,胸腺嘧啶17.82%,胞嘧啶35.15%。GPR54基因共编码66个氨基酸,其中脯氨酸占总氨基酸残基的13.63%,甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸各占10.60%,半胱氨酸占9.09%。(本文来源于《动物医学进展》期刊2017年07期）
杨立娜[5]（2017）在《一个新型Group 2 Mrp系统的基因克隆、功能鉴定及其基因敲除菌株的构建》一文中研究指出松嫩盐单胞菌(Halomonas songnenensis)NEAU-ST10-39~T是从中国的黑龙江省松嫩盐碱地筛选得到的生长范围为0.2-15%(w/v)的NaCl(最适为4%,w/v)和pH 5-10(最适为pH 7)的一株中度嗜盐菌(Moderate halophile)。那么,它可能进化了复杂的耐盐碱基因及其调节机制,以保持其细胞内稳定的渗透压和离子平衡。因此,在该菌株中很可能存在丰富的Na~+(Li+)/H~+逆向转运蛋白在与耐盐碱方面起着重要作用,因此,以松嫩盐单胞菌(Halomonas songnenensis)NEAU-ST10-39~T作为细菌耐盐碱基因挖掘的研究对象,获得重要的或新的耐盐碱基因的几率更大。本论文从基因文库的构建方法入手,结合盐离子耐受特性功能互补的方法,借助大肠杆菌(Escherichia coli)Na~+/H~+逆向转运蛋白缺陷株KNabc(Δnha A,Δnha B,Δcha A),从松嫩盐单胞菌(H.songnenensis)NEAU-ST10-39~T中克隆获得一个编码多亚基单价阳离子/H~+逆向转运蛋白(multisubunit monovalent cation/proton antiporter)的mrp操纵子。耐盐碱实验表明,mrp操纵子能够赋予大肠杆菌KNabc对0.8 M NaCl,120 m M Li Cl和碱性pH的耐受性。序列分析及蛋白同源比对结果表明此mrp操纵子包含有六个完整的开放阅读框,为Group 2型mrp操纵子,我们沿用mrp这一名称,又因其来自松嫩盐单胞菌(H.songnenensis)NEAU-ST10-39~T而被定名为Hs_mrp2。Hs_mrp2操纵子全长6,709 bp,包含6个完整的开放式阅读框架(ORF1-6),并且ORF1-6拥有一个共同的启动子和终止子,每个阅读框上游都有各自的SD序列。蛋白同源性比对结果表明,Hs_mrp2的六个亚基A'~G与来自盐单胞菌(Halomonas zhanjiangensis)中推测的Group 2型Mrp的六个亚基的同源性最高(88.4%to 97.2%)。目前,已鉴定的Group 2型Mrp仅有两个,并且Hs_Mrp2的各亚基与这两个已经鉴定的Group 2型Mrp包括Sm_Pha1(来自Sinorhizobium meliloti)和Vc_Mrp(来自Vibrio cholerae)的Mrp A'~G亚基具有相对较低的同源性,分别为28.7%~50.9%和25.9%~41.8%。以上结果暗示,Hs_mrp2可能编码一个新型的Group 2型Mrp系统,是目前在中度嗜盐菌属中发现的首个Group 2型Mrp。随后,我们用Hs_mrp2与已经鉴定和部分未鉴定的Group 1型Mrp和Group 2型Mrp利用邻接算法构建系统发育树,构建结果表明Hs_mrp2与推测的Hz_mrp2形成一个独立分支而与所有已鉴定的Group 1型Mrp和Group 2型Mrp相距较远,初步证明Hs_mrp2可能编码一个新型的Group 2型Mrp系统。为了证明Hs_Mrp2系统具有Na~+/H~+逆向转运活性。我们利用荧光猝灭法测定大肠杆菌(E.coli)KNabc/p UC-mrp2的反转膜(KNabc/p UC18为负对照)单价阳离子/氢离子逆向转运蛋白活性,结果发现,相对于负对照,KNabc/p UC-mrp2制备的反转膜特别是在pH9.0~9.5均具有Na~+(Li+,K+)/H~+逆向转运蛋白活性。为了进一步分析NEAU-ST10-39~T中Hs_mrp2的耐盐碱能力,我们借助基因敲除质粒p K18mobsac B构建了带有Hs_mrp2同源臂的重组质粒p K18-mrp2-Nco I,利用同源重组技术敲除宿主菌NEAU-ST10-39~T中该Group 2型Mrp基因,通过对原宿主NEAU-ST10-39~T和敲除菌株进行生理生化分析的结果,以证明本实验中所发现的Group 2型Mrp的基因对中度嗜盐菌NEAU-ST10-39~T在耐盐碱方面确实起到一定的作用。基于以上结果,我们认为Hs_Mrp2为一个对宿主NEAU-ST10-39~T在盐碱性方面起主要作用的新型的Group 2型Mrp系统,并且对于中度嗜盐菌中的Group 2型Mrp系统的发现来说尚属首例。(本文来源于《东北农业大学》期刊2017-06-01）
孙开福[6]（2017）在《松嫩盐单胞菌中Group 1型Mrp系统的基因克隆、功能分析及其基因敲除菌株的构建》一文中研究指出松嫩盐单胞菌(Halomonas songnenensis)NEAU-ST10-39~T是一株可在15%的Na Cl及pH 10.0的碱性环境下生长的中度嗜盐菌(Moderately halophile)。本研究首先以构建基因文库的方法为基础结合基因功能互补法,利用大肠杆菌(Escherichia coli)Na~+/H~+逆向转运蛋白基因缺陷型株KNabc(Δnha A,Δnha B,Δcha A),从松嫩盐单胞菌(H.songnenensis)NEAU-ST10-39~T中筛选到1个Group 1 mrp操纵子,它是一个编码多亚基单价阳离子/氢逆向转运蛋白(multisubunit monovalent cation/proton antiporter),并将其定名为Hs_mrp,其编码蛋白命名为Hs_Mrp。Hs_mrp操纵子全长6 Kb,包含6个完整的开放式阅读框和一个截短的ORF融合进Lac Z的阅读框(与同源蛋白只缺少1个氨基酸)(ORF7-13),并且它们拥有一个共同的启动子。通过蛋白同源比对发现,Hs_Mrp与湛江盐单胞菌(H.zhanjiangensis)中推测的单价阳离子/氢逆向转运蛋白Hzj_Mrp的七个亚基具有最高同源性(88.7%-98.9%)。与已鉴定的Group 1 Mrp比对,发现除了与来自H.zhaodongensis的Hz_Mrp同源性较高(83.5-97%)以外,与其他已鉴定的Mrp对应亚基均表现出较低同源性(最高为48.1%,最低28.9%)。同时,基于比对结果构建其系统进化发育树,结果显示Hs_Mrp与一个已鉴定的和几个推测的Group 1型Mrp聚在一起且形成一个独立分支,这说明Hs_mrp的确编码一个Group 1型Mrp系统。为了深入地揭示Hs_mrp的耐盐碱机制,我们分别在异源宿主大肠杆菌(E.coli)KNabc和在同源宿主NEAU-ST10-39~T Hs_mrp基因敲除突变菌株中进行了相关功能鉴定实验。结果如下:(1)在异源宿主中,耐盐碱测定显示:Hs_mrp可使(E.coli)KNabc在0.8 M Na Cl、一定浓度Li Cl(5 m M)及p H 8.0的碱性环境中恢复生长;阳离子/H~+逆向蛋白活性测定显示,KNabc/p UC-mrp制备的反转膜在p H 7.5-9.5的范围内表现出了较高的Na~+(Li~+,K~+)/H~+逆向转运活性,且在p H 9.5下活性最高,表观K0.5值分析显示,Na~+、Li~+和K~+的K0.5值分别是0.64、1.05和0.76。结果说明Hs_Mrp是pH依赖性的Na~+(Li~+,K~+)/H~+逆向转运蛋白且即Na~+是最适底物,其次是K~+和Li~+。(2)首先成功构建了基因敲除质粒pK18-mrp-Nco I和携带庆大霉素抗性的pK18-mrpGm;其次,敲除质粒p K18-mrp-Nco I通过电转化方法顺利进入NEAU-ST10-39~T;然后利用反向筛选成功地获得了两株Hs_mrp基因敲除菌株,我们将其命名为NEAU-ST10-39~T-?mrp-7和NEAU-ST10-39~T-?mrp-23;最后,我们成功将携带有完整Hs_mrp操纵子的重组穿梭质粒p MCS5-mrp转入到敲除突变株中,将其互补突变菌株命名为NEAU-ST10-39~T-?mrp/p MCS5-mrp。(3)在同源宿主中,对Hs_mrp敲除突变株进行了相应生理测试。耐盐测试结果发现:NEAU-ST10-39~T-?mrp/pMCS5-mrp(互补突变株)表现出与野生型菌株类似的耐盐能力,既Hs_mrp操纵子可以互补敲除菌株;处于pH 7的中性条件下,存在2%和3%的NaCl浓度时,敲除菌株与野生型菌株和互补突变株的生长情况没有差异;然而,随着盐浓度的升高,敲除菌株的生长明显受到抑制。在pH8或pH9的碱性条件下,从2%或3%的NaCl浓度开始,敲除菌株生长就已经受到了明显的抑制。以上表明:在中性条件下,Hs_mrp对宿主菌在高盐下的生长具有重要作用;而在碱性条件下,Hs_mrp对宿主菌在较低盐浓度下的生长就已经起到作用。鉴于以上结果,我们认为Hs_Mrp是一个具有Na~+(Li~+,K~+)/H~+逆向转运活性的Group 1型Mrp系统;并成功地构建了NEAU-ST10-39~T的Hs_mrp基因敲除突变菌株。(本文来源于《东北农业大学》期刊2017-06-01）
贺美玲[7]（2017）在《嗜吞噬细胞无形体Ⅳ型分泌系统效应蛋白和无形体病新型诊断抗原的基因克隆、原核表达和鉴定》一文中研究指出目的:嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum,Ap)是一种专性细胞内寄生的以蜱为传播媒介的革兰氏阴性菌,能导致人粒细胞无形体病(Human granulocytic anaplasmosis,HGA)。HGA是一种可致命的新型传染性疾病,已在世界范围内流行,成为威胁公众健康的重要公共卫生问题。为探究Ap的致病机制,本研究第一部分通过生物信息学方法筛选出35个Ap Ⅳ型分泌系统(type Ⅳ secretion system,T4SS)潜在效应蛋白,克隆、表达及纯化了其中8个蛋白及Ap外膜蛋白P44,并制备了相应的多克隆抗体;为进一步鉴定效应蛋白是否依赖T4SS,分别构建了traG-virD4和5’-cat-loxp-tet融合基因,化学合成了cre基因片段,以期为后续建立T4SS效应蛋白报告系统奠定基础。本研究第二部分利用血清学筛查的方法对17个Ap种属特异性蛋白开展相关研究,旨在发现可提高HGA诊断灵敏度的新型抗原。方法:一、嗜吞噬细胞无形体T4SS潜在效应蛋白的基因克隆、原核表达和鉴定1.Ap T4SS潜在效应蛋白的筛选、基因克隆、原核表达、纯化及抗体制备1.1生物信息学方法筛选Ap T4SS潜在效应蛋白利用生物信息学技术,以Ap基因组编码的610个未知功能蛋白为靶标,根据Ap T4SS潜在效应蛋白的共同特征(种属特异性、蛋白羧基末端带电情况、GC含量和Coiled-coil结构域等),筛查Ap T4SS潜在效应蛋白。1.2 Ap T4SS潜在效应蛋白原核表达载体的构建根据Gene Bank中各效应蛋白的基因序列,设计含有DNA限制性内切酶位点和6×His标签序列的特异性引物,以Ap基因组DNA为模板,PCR扩增各潜在效应蛋白的基因序列。将扩增的目的基因和原核表达载体pET28a(+)或pGEX-4T-1分别用DNA限制性内切酶双酶切,酶切产物在T4 DNA连接酶的作用下定向连接后转化至感受态细菌E.coli TOP10中,提取质粒测序,将阳性质粒转化至感受态细菌E.coli BL21(DE3)中,保藏菌种。1.3 Ap T4SS潜在效应蛋白的原核表达及纯化将含重组质粒的E.coli BL21(DE3)在37 ~oC培养,加入IPTG诱导潜在效应蛋白表达并采用镍柱亲和层析纯化后,通过SDS-PAGE电泳检测各重组蛋白的表达水平及纯度。1.4多克隆抗体的制备以纯化的潜在效应蛋白为抗原,免疫健康的ICR小鼠,10周后通过心脏采血的方式收集小鼠血清,制备各潜在效应蛋白的多克隆抗体,Western Blot检测各多克隆抗体的特异性。2.Ap T4SS效应蛋白CRAFT系统的前期构建Ap作为胞内菌,目前无合适的基因修饰方法,其T4SS效应蛋白的鉴定需要依赖于报告系统在替代宿主中进行。本研究拟借助大肠杆菌作为替代宿主,构建CRAFT系统(Cre reporter assay for translation)以检测依赖T4SS的Ap效应蛋白。该系统由供体菌(E.coli S17-1 lamp pir)和受体菌(E.coli K-12 MG1655)构成接合体系,主要包括转运通道,偶联蛋白和报告基因叁部分。转运通道为供体菌的T4SS;偶联蛋白为TraG氨基端和VirD4羧基端构成的融合蛋白TraG-VirD4,后者可捕捉Ap效应蛋白并传递至供体菌的T4SS;报告基因由Cre重组酶与效应蛋白的融合基因cre-aph和抗生素融合基因5’-cat-loxp-tet-loxp-cat-3’构成,两组融合基因分别克隆于供体菌和受体菌中。导入5’-cat-loxp-tet-loxp-cat-3’的受体菌由于cat插入失活,仅表现出Tet抗性。若效应蛋白依赖于T4SS,则其融合蛋白Cre会随其分泌至受体菌,介导Lox P位点两端的cat重组,使受体菌转变为Cat抗性。最终通过受体菌的抗性转变鉴定Ap潜在效应蛋白是否依赖T4SS。2.1构建融合基因traG-virD4根据traG基因序列设计含有DNA限制性内切酶位点(Mfe I+Pci I)的特异性引物,以E.coli S17-1 lamp pir的基因组DNA为模板,PCR扩增traG。根据virD4基因序列设计含有DNA限制性内切酶位点(Pci I+BamH I)的特异性引物,以Ap的全基因组DNA为模板,PCR扩增virD4。利用连接PCR构建重组基因traG-virD4。进一步将连接产物克隆至pMAL-c5x载体并转化至供体菌。2.2化学合成cre基因化学合成cre基因片段,后期进一步扩增各效应蛋白基因aph后构建融合基因cre-aph,并将其导入供体菌。2.3构建融合基因5’-cat-loxp-tet根据5’-cat基因序列设计4对特异性引物(上游引物与cat的5’端序列匹配,下游序列含有LoxP(34 bp)位点及tet 5’端的匹配序列),以质粒pACYC184为模板,PCR扩增5’-cat-loxp。根据cat-3’基因序列设计4对特异性引物(上游引物包含LoxP位点及tet 3’端的匹配序列,下游引物与cat的3’端序列匹配),以质粒pACYC184为模板,PCR扩增loxp-cat-3’。根据tet基因序列设计1对特异性引物,以质粒pACYC184为模板,扩增tet。利用连接PCR构建重组基因5’-cat-loxp-tet,进一步将loxp-cat-3’基因连接至5’-cat-loxp-tet基因。二、人粒细胞无形体病新型诊断抗原的鉴定为寻找HGA的新型诊断抗原,对生物信息学技术筛选出的17个Ap种属特异性蛋白(APH1153、Ats-1、APH1127、APH0812、APH0847、APH1067、APH0653、APH1384、APH1345、APH1386、APH0832、APH0615、APH1235、APH1157、APH0261、APH1068、APH0833)开展以下研究。1.Ap阳性血清的鉴定以Ap外膜蛋白P44为抗原,通过Western Blot技术从600份临床标本中筛查阳性血清,并通过免疫荧光技术(IFA)对其中部分阳性血清进行鉴定。2.强抗原性特异性重组蛋白的鉴定利用已鉴定的Ap阳性血清通过Western Blot技术从17个Ap种属特异性蛋白中筛选强抗原性的重组蛋白;应用100份临床血清分析筛查到的强抗原性重组蛋白与P44的血清差异性反应。3.多肽的合成及其抗原性验证应用生物信息学在线软件Antibody Epitope Prediction(http://tools.immune epitope.org/tools/bcell/iedb_input)中的Kolaskar&Tongaonkar Antigenicity程序预测P44、APH1384和APH0812的抗原表位,在北京赛百盛公司化学合成多肽抗原。应用Dot Blot技术,检测多肽与阳性血清的反应,同时分析APH1384多肽与P44多肽的血清差异性反应。4.APH0812片段的分段克隆、表达、纯化及抗原表位的鉴定由于前期合成的APH0812多肽抗原不与阳性血清反应,为确定抗原表位的分布,本研究分段克隆、表达并纯化APH0812片段(APH0812-1、APH0812-2、APH0812-3、APH0812-4、APH0812-4-5)(各片段的氨基酸序列范围见附表)通过检测各片段与阳性血清的反应以鉴定抗原表位的分布。附表APH0812各片段的氨基酸序列范围效应蛋白APH0812APH0812-1 APH0812-2 APH0812-3 APH0812-4 APH0812-4-5氨基酸范围258-490258-318298-358338-398378-438378-4904.1分段克隆、表达并纯化APH0812根据Gene Bank中aph0812的基因序列,设计含有DNA限制性内切酶位点和6×His标签序列的5对aph0812特异性引物,以Ap的全基因组DNA为模板,PCR扩增aph0812各基因片段。将目的基因克隆至原核表达载体pMAL-c5x并转化至感受态细菌E.coli DH5α中,测序正确后,保藏菌种。将含重组质粒的E.coli BL21(DE3)于37 ~oC培养,加入IPTG诱导蛋白的表达,SDS-PAGE检测蛋白表达水平。采用镍柱亲和层析的方法纯化APH0812的各蛋白片段。4.2 APH0812抗原表位的初步鉴定利用Western Blot技术检测APH0812各蛋白片段与阳性血清的反应,从而确定APH0812抗原表位的分布。在线软件Antibody Epitope Prediction预测APH0812-4-5蛋白片段(氨基酸全长:378-490)的多肽表位,分别包括以下氨基酸片断:APH0812(365-389),APH0812(395-416),APH0812(450-485)。由北京赛百盛公司重新合成APH0812-4-5蛋白片段的3段多肽序列,利用Dot Blot技术检测其与阳性血清的反应。结果:一、嗜吞噬细胞无形体T4SS效应蛋白的基因克隆、原核表达和鉴定1.Ap T4SS潜在效应蛋白的筛选、基因克隆、原核表达、纯化及抗体制备1.1生物信息学方法筛选Ap T4SS潜在效应蛋白通过生物信息学方法筛选出35个Ap T4SS潜在效应蛋白,对其中8个潜在效应蛋白(APH1153、APH0819、APH1384、APH1386、APH1235、APH1068、APH1157、APH1345)和Ap外膜蛋白P44进一步作后续研究。1.2 Ap T4SS潜在效应蛋白的基因克隆、原核表达及纯化菌落PCR鉴定及测序结果显示各潜在效应蛋白及p44的基因片段均克隆至pET28a(+)。SDS-PAGE电泳检测结果显示各重组潜在效应蛋白均表达,且大小与预期一致。1.3多克隆抗体的制备用纯化的潜在效应蛋白免疫健康的ICR小鼠10周后,获取血清,Western Blot检测结果显示,制备的多克隆抗体均可与相应效应蛋白特异性结合。2.Ap T4SS效应蛋白CRAFT系统的前期构建2.1构建融合基因traG-virD4PCR鉴定和测序结果显示,融合基因traG-virD4已成功构建。进一步将连接产物克隆至pMAL-c5x载体上。2.2化学合成cre基因测序结果显示,cre基因片段已化学合成。进一步将连接cre与aph基因片段。2.3构建融合基因5’-cat-loxp-tetPCR鉴定和测序结果显示,融合基因5’-cat-loxp-tet已成功构建。PCR结果显示,loxp-cat-3’基因序列已扩增。进一步将loxp-cat-3’连接至5’-cat-loxp-tet,以构建融合基因5’-cat-loxp-tet-loxp-cat-3’。二、人粒细胞无形体病新型诊断抗原APH1384及APH0812的鉴定1.Ap阳性血清的鉴定Western Blot技术筛查出若干份P44阳性血清;IFA的检测结果进一步确定阳性结果。2.强抗原性特异性重组蛋白的鉴定Western Blot检测结果显示,Ap阳性血清筛查到5个抗原性较强的特异性重组蛋白,分别为APH1127、APH0812、APH0847、APH1067和APH1384。利用100份临床血清进一步从5个蛋白中筛查到2个与P44血清反应差异蛋白,分别为APH1384和APH0812,二者与P44可协同检测Ap阳性血清,提高HGA诊断的灵敏度。3.多肽的合成及其抗原性验证在线软件预测并合成P44、APH1384和APH0812的多肽序列,Dot Blot技术检测各多肽与阳性血清反应,结果显示P44及APH1384多肽与阳性血清反应明显,而APH0812多肽与阳性血清未见明显反应,且APH1384多肽与P44多肽的血清反应有差异。4.APH0812片段的分段克隆、表达、纯化及抗原表位的鉴定4.1分段克隆、表达并纯化APH0812菌落PCR结果显示,APH0812-1、APH0812-2、APH0812-3、APH0812-4、APH0812-4-5均克隆至载体pMAL-c5x中。SDS-PAGE电泳结果显示,APH0812的5个片段均表达且大小与预期一致。4.2 APH0812抗原表位的初步鉴定Western Blot结果显示,APH0812-4、APH0812-4-5与阳性血清反应明显,但利用Dot Blot检测结果显示,新合成的3段位于APH0812-4-5片段的多肽与阳性血清均无明显反应,结果提示APH0812的抗原表位可能存在于APH0812-4-5片段的其他区域。结论:1.本研究克隆、表达及纯化了8个Ap T4SS潜在效应蛋白及外膜蛋白P44,并制备了相应的多克隆抗体,为后期研究Ap T4SS效应蛋白的生物学功能提供重要工具。2.本研究构建了traG-virD4和5’-cat-loxp-tet融合基因,并化学合成了cre基因片段,为后期构建CRAFT系统以进一步鉴定效应蛋白是否依赖T4SS奠定了基础。3.本研究从Ap种属特异性蛋白中鉴定出2个强抗原性蛋白(APH1384和APH0812),有望作为HGA的新型诊断抗原。(本文来源于《苏州大学》期刊2017-04-01）
杨青,杨志刚,魏帮鸿,施秋燕,刘启斌[8]（2017）在《中华绒螯蟹Δ9-脂肪酸去饱和酶基因克隆和真核表达系统的构建》一文中研究指出Δ9-脂肪酸去饱和酶是多不饱和脂肪酸合成途径的关键酶之一,可催化脂肪酸链上特定位置形成双键。本研究在已克隆到中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的Δ9-脂肪酸去饱和酶(Δ9 fatty acyl-Co A desaturase,Δ9-FAD)基因基础上,为进一步了解其功能,根据中华绒螯蟹Δ9-FAD基因c DNA序列(accession number:JQ693685)以及真核表达载体p PIC3.5K,设计引物并在其上下游分别加入Bam HⅠ和Eco RⅠ酶切位点;利用反转录PCR(RT-PCR)技术,克隆其开放阅读框(open reading frame,ORF)片段,构建重组质粒p PIC3.5k-Δ9-FAD;利用电穿孔仪将经限制性内切酶SacⅠ线性化后的重组质粒p PIC3.5k-Δ9-FAD转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115菌株中。经筛选与PCR验证,得到含有重组质粒p PIC3.5k-Δ9-FAD的毕赤酵母转化株。本实验成功构建了中华绒螯蟹Δ9-脂肪酸去饱和酶的毕赤酵母表达系统,为深入研究Δ9-脂肪酸去饱和酶的功能做了基础性的工作。(本文来源于《基因组学与应用生物学》期刊2017年02期）
梁梓强,梁士可,刘婷婷,李广宏,王方海[9]（2017）在《白背飞虱18S核糖体基因克隆及系统发育》一文中研究指出以白背飞虱Sogatella furcifera长翅雌虫为材料,提取其基因组DNA,以已知的半翅目昆虫18S rDNA全序列和白背飞虱18S rDNA部分序列为参考,通过PCR扩增出白背飞虱18S rDNA的未知部分序列,最后通过拼接,首次得到了白背飞虱18S rDNA的全长序列,长度为1 891 bp,碱基组成比例均衡,分别为:24.1%A;23.7%C;27.7%G;24.5%T。将此全长序列与分属6个目(半翅目、双翅目、膜翅目、直翅目、鞘翅目、等翅目)昆虫的18S rDNA序列进行比较,一共发现有4个保守区域,其中第二个区域发生插入或缺失的情况最少。以18S rDNA第二保守区域进行系统发育分析,发现原同翅目昆虫多数均与半翅目昆虫菜蝽亲缘关系较近,但原同翅目飞虱科昆虫,如白背飞虱、褐飞虱则与半翅目昆虫菜蝽的亲缘关系较远,表明近年来将原同翅目昆虫全部划归为半翅目还有待商榷之处。(本文来源于《中山大学学报(自然科学版)》期刊2017年01期）
何卫,赵靓,赵银河,王云月[10]（2016）在《莲瓣兰大雪素FT基因克隆和系统发育分析》一文中研究指出控制植物开花的途径有光周期现象、GA、春化途径、自主途径,在光周期途径中,CO基因促进开花通过直接上调FT和SOC1基因表达,FT(FLOWERING LOCUS T)是光周期途径植物开花时间决定关键基因,并认为FT基因表达产物可能就是长期追寻的开花刺激物质,这种开花刺激物质经过叶片到茎尖的长距离运输,最终引起茎顶端花器官分化的起始。本研究以莲瓣兰大雪素作为实验材料,用RACE方法快速地克隆全长cDNA,生物信息学分析全长cDNA为662bp,含有编码框和3′UTR,具有完整的开放阅读框(ORF)522bp,编码173氨基酸的蛋白质。通过系统发育分析获得一个FT同源基因。本研究为进一步对这个基因的功能研究奠定了基础。(本文来源于《种子》期刊2016年08期）
基因克隆系统论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
白腐菌偏肿革裥菌Lenzites gibbosa能分泌降解木质素的锰过氧化物酶(MnPs),为进一步鉴定试验菌株,对菌株L. gibbosa CB1进行了ITS序列(Gen Bank登录号为JF279440)扩增与测序,并进行了基于ITS序列的比对与系统发育分析,结果表明CB1与桦革裥菌L. betulina和栓菌属Trametes等相关白腐菌的亲缘关系较近而聚类在一起,并与24个同种其他菌株的ITS序列覆盖度在85%～97%期间内的相似性都为99%,说明该菌株为偏肿革裥菌。为了获得该菌株多个编码MnP家族的基因,从而为研究MnP基因的表达调控奠定序列结构的基础,根据已知白腐菌MnPs基因保守区和已经扩增出的基因片段设计引物,以L. gibbosa CB1的基因组DNA和总RNA为模板,采用PCR、RT-PCR、RACE及染色体步移等方法,克隆到该菌株编码MnP2和MnP3的全长c DNA和DNA基因(Gen Bank登录号分别为JQ388597、JN571114; JQ411249、JN571116),分别命名为Lg-mnp2和Lg-mnp3。2个基因DNA全长分别为2 869、3 992 bp,都含有6个外显子和5个内含子;其启动子区域都含有TATA-Box、CAAT-Box、AP2、MRE等顺式作用元件,Lg-mnp2还含有AP1,Lg-mnp3还含有HSE;其c DNA基因分别含有50、52 bp的5'UTR,150、249 bp的3'UTR和1098、1 101 bp的完整开放阅读框ORF,分别编码了365、366个氨基酸的蛋白质多肽前体(Gen Bank登录号分别为AFC37493、AFC37494),成熟的Lg-mnp2蛋白含有339个氨基酸,比Lg-MnP1蛋白(Gen Bank登录号为ACO92620)多1个氨基酸;成熟的Lg-mnp3蛋白含有340个氨基酸,比Lg-MnP2蛋白多1个氨基酸。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
基因克隆系统论文参考文献
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