林长发[1]2003年在《水稻叶特异表达基因及苹果酸脱氢酶基因的克隆和功能分析》文中认为为了研究水稻叶组织特异基因及其表达，利用抑制消减杂交法（SSH）建立了水稻叶对根的差减文库。经筛选，获得171个差异克隆。其插入片段分别输入GenBank中进行同源搜索，发现其中水稻中已克隆基因有85个，未克隆的功能基因有45个，未知基因片段有41个。它们涉及水稻光合作用、代谢、膜运输、信号传导以及抗病性等生理活动。利用SSH分离得到的片段。我们分别克隆了水稻磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）、蔗糖转化酶（invertase）及Lon蛋白酶等基因的全长cDNA，并对它们的基因组序列及功能进行了初步研究。同源性搜索发现Ospepc与植物许多已知的PEPC具有很高的同源性（84%－86%），它还含有许多PEPC特异的保守功能域。定量PCR分析证实Ospepc在叶中的表达明显强于在根中的表达。对Osinv的同源性搜索发现它与植物其它中性/碱性转化酶也具有较高的同源性（71%－80%）。RT-PCR分析，结果发现Osinv在叶中增强表达，而且盐处理和低温处理会提高它的表达水平。Oslon推测编码水稻线粒体Lon蛋白酶，可特异降解线粒体中的异常蛋白质。同源性搜索显示该蛋白质与其它Lon蛋白酶具有较高的同源性（77%－92%），Conserved Domain Search分析它具有Lon蛋白酶的保守功能域。Northern杂交分析证实Oslon在叶中增强表达。分析还发现该基因在不育系珍汕97A的生殖器官（幼穗和花药）中存在可变剪接，RNA原位杂交初步显示该可变剪接可能发生在绒毡层中，可能与细胞质雄性不育有关。原核表达显示该基因可正常翻译出符合推测分子量的蛋白质。另外，基因组搜索表明它还存在两个同源基因。此外，我们通过筛选水稻幼苗cDNA文库分别克隆到细胞质和线粒体苹果酸脱氢酶基因。以Actin基因为内对照进行RT-PCR分析发现二者组织表达模式较为一致，在幼穗和未成熟胚中表达较高，而在叶和根中较低。原核表达证实二者都能编码与预期大小相符的蛋白质。进一步的检测表明OscMDH具有苹果酸脱氢酶活性。
耿丽华[2]2004年在《稻瘟菌诱导性水稻OsFd和OsFNR基因的cDNA克隆与诱导表达》文中研究指明对受病原物诱导的植物基因的研究有助于我们进一步了解植物—病原物互作机理,并可以将这些防卫相关基因应用到植物抗病基因工程中。本研究开展了受稻瘟菌侵染诱导表达的水稻OsFd和OsFNR的cDNA克隆与诱导表达工作;并进行了OsFd和OsFNR的水稻转化和原核表达。植物Fd(Ferredoxin,铁氧还蛋白)和FNR(Ferredoxin- NADP+ Reductase,铁氧还蛋白-NADP+还原酶) 都是多基因家族,在植物体中可分为光合作用与非光合作用两个类型。光合型的位于植物叶绿体内,其作用是将来自于光合系统I的电子传递给NADP+,生成NADPH。非光合Fd和FNR,主要分布在根和成熟果实等非光合器官中,可能参与亚硝酸还原酶,亚硫酸盐还原酶,谷氨酸合成酶等的还原作用。本文以从非亲和性稻瘟菌小种131侵染的、水稻品种爱知旭的稻叶中获得的、2个cDNA片段20A03和21C01作探针,筛选非亲和性稻瘟菌侵染的水稻稻叶cDNA文库,获得了相应的全长cDNA克隆OsFd、OsFNR。OsFd是新发现的水稻Fd基因,其cDNA全长为848bp,完整的ORF为459bp,推定的蛋白产物有153个氨基酸,分子量16KD。该基因的cDNA序列及其推定的氨基酸序列与玉米FdIII基因同源性最高,分别为83%和81%。Northern杂交分析表明:非亲和性稻瘟菌小种131能在6小时内强烈诱导OsFd转录,亲和性稻瘟菌小种在48小时内开始诱导OsFd转录;在SA(水杨酸)喷洒的稻叶中,OsFd基因转录物在处理后6个小时内明显地诱导积累,而且在处理后的6个小时至72个小时范围内,OsFd转录物的积累量逐渐增加。与水稻基因组序列的同源性分析表明:OsFd在水稻基因组的第叁条染色体上,只有一个拷贝,有一个内含子。OsFNR基因全长1495bp,开放阅读框为1137bp(103-1238bp)。该基因编码378个氨基酸、分子量为41.6KD的蛋白。 BLAST序列同源性分析表明,该基因cDNA序列与水稻胚中的FNR同源,后者仅有电子登记,但没有进一步的研究报道。Northern杂交分析表明,在亲和性稻瘟菌007小种处理中,在接种后的60小时内<WP=12>OsFNR被诱导转录;在131接种的处理中,接种6小时内OsFNR就大量转录积累,一直到接种后的72小时OsFNR转录物积累的水平持续不减弱;在SA处理下,6个小时内已经有转录物积累,而且在取样的72个小时范围内,OsFNR基因转录物的积累量逐渐增加。水稻基因组序列分析结果表明OsFNR在水稻基因组的第七条染色体上,只有一个拷贝,有6个内含子。通过与发表的植物Fd、FNR的同源性分析,推断OsFd和OsFNR属于非光合类型。根据OsFd、OsFNR受稻瘟菌诱导表达动态特征:受亲和性稻瘟菌诱导转录在48小时后,时间晚、表达量低;受非亲和性稻瘟菌浸染6小时内就高水平转录积累,直到72小时水平不降低,另外受SA诱导在6小时内就高水平转录积累,直到72小时水平持续升高,SA被证明是许多防御基因表达和植物表现系统获得抗性所必需的。综合以上分析,推断OsFd和OsFNR都与水稻抗稻瘟病的防卫反应密切相关;它们是催化同一氧化还原反应的相邻的两个电子供体,这个氧化还原反应可能是水稻抗稻瘟病的防卫反应的关键组成部分。为证明OsFd和OsFNR的生化特性,构建了它们的重组原核表达载体pGEX-4T-3/OsFd和pGEX-4T-3/OsFNR,并分别诱导其在大肠杆菌中表达,均诱导出大小与期望相符的特异蛋白,初步证明OsFd和OsFNR的推定蛋白产物是正确的。为进一步证明OsFd和OsFNR在水稻抗稻瘟病中的作用,构建了它们的sense和hairpin表达载体:pCAMBIA1301/OsFd-sense、pCAMBIA1301/OsFd-hairpin、 pCAMBIA1301/OsFNR-sense 、pCAMBIA1301/OsFNR-hairpin,并通过农杆菌介导法将这四种表达载体分别转入水稻品种爱知旭中,分别获得83、110、43和121株转基因水稻。为抗病性检测等进一步的研究打下基础。此外,克隆四个水稻乙醛酸循环酶基因:OsICL(异柠檬酸裂解酶)、OsCS(柠檬酸合成酶)、OsMS(苹果酸合成酶)和OsMDH(苹果酸脱氢酶)。通过分析水稻乙醛酸循环的标志酶OsICL在稻瘟菌侵染条件下的转录积累动态,认为乙醛酸循环受亲和性稻瘟菌侵染的诱导。
程玉祥[3]2005年在《水稻NADP-苹果酸酶与逆境关系的研究》文中认为NADP-苹果酸酶(NADP-ME)是在二价金属离子存在下催化对苹果酸氧化脱羧生成丙酮酸、CO_2、NADPH反应的酶,它广泛地存在于动物、植物、细菌等生物体中,参与多种代谢,是生物体生命活动中重要的酶之一。本研究室在前期的研究中,针对我国东北地区的苏打盐碱地的碳酸盐逆境(NaHCO_3,Na_2CO_3)为研究对象,采用分子生物学手法,在碳酸盐逆境下克隆了水稻的NADP-ME_2基因(GeneBank Accession No.AB053295)。本论文以水稻(Oryza sativa L.)为材料,对水稻的NADP-ME与逆境关系做了探讨研究。目前报道水稻的NADP-ME有四种同工酶,为了深入了解各同工酶与逆境的关系,本研究对水稻NADP-ME的四种同工酶在逆境下的表达特性及差别进行了比较性研究,也探讨了在逆境下水稻的地上部与地下部NADP-ME的酶活性的变化规律。为了进一步明确NADP-ME同工酶之间特性的差异,本研究利用大肠杆菌表达体系,通过GST融合蛋白纯化了二个水稻NADP-ME蛋白,在体外对其酶的生物化学特性进行了比较研究。在酵母表达体系中表达水稻的NADP-ME基因后,初步对其抗逆性进行了探讨。主要得到了如下结果: 1、分析得到四种水稻NADP-ME同工酶之间的同源性都超过75%,氨基酸序列有较高的相似性。利用PSORT(Prediction of protein localization sites)分析的结果:NADP-ME_1在N-末端带有质体转酶肽,被预测存在于叶绿体;而NADP-ME_2、NADP-ME_3被分别预测定位于细胞膜、内质网,NADP-ME_4是定位细胞质中。我们用绿色荧光蛋白(GFP蛋白)分子标记方法在遗传转化的拟南芥中探讨了NADP-ME_2在细胞的的定位情况,结果表明,NADP-ME_2-GFP融合蛋白在遗传转化的拟南芥根细胞的细胞膜部位大量表达,这表明了NADP-ME_2在植物体中存在于细胞膜。预测及实验的结果表明水稻的NADP-ME四种同工酶存在于细胞内不同的亚细胞内起着功能,各自扮演着不同的角色。 2、用Northern杂交方法对水稻NADP-ME基因的表达特性研究。首先对水稻NADP-ME_2的表达做了解析,在正常的条件下,水稻的叶、茎中NADP-ME_2的mRNA表达量较高,而在根中则较低,NADP-ME_2基因的mRNA表达不受光的诱导,表明NADP-ME_2可能是水稻非光合型的NADP-ME。然而,水稻质体型NADP-ME_1(C_3植物质体型NADP-ME)基因的表达却受光的诱导,这些结果未见报道。在NaCl、NaHCO_3、Na_2CO_3、10%PEG逆境处理下,水稻NADP-ME_2基因的表达量明显地增高,表明水稻的NADP-ME_2基因表达与逆境存在着应答关系。用半定量RT-PCR的方法对四种水稻NADP-ME基因与逆境应答关系进行了探讨,表明水稻不同NADP-ME基因对环境逆境信号产生了不同应答反应特性。 3、通过天然活性电泳及NADP-ME特异酶活性染色方法,从水稻中检测出四种NADP-ME同工酶,这一结果和以前报道的不完全相同(在C_3植物中仅检测出一条NADP-ME特异带)。在NaHCO_3、Na_2CO_3、NaCl及PEG_(6000)逆境下,水稻NADP-ME特异酶活性都明显的增高,从蛋白表达水平上进一步表明了水稻的NADP-ME与逆境存在着显着的应答关系。
鲍永美[4]2007年在《水稻SNARE蛋白基因的克隆与功能分析》文中研究说明水稻是世界上最重要的粮食作物。在一些水稻产区,病原菌、高盐、干旱等逆境胁迫严重影响了水稻的生长和生产,因此阐明植物耐受逆境胁迫的分子机制和改良植物的抗逆性已经成为当前农业研究的主要目标之一。本论文的主要研究内容分为两个方面:一、从水稻中分离了4个与植物逆境胁迫信号传导途径相关的SNARE蛋白家族基因,并对它们的功能进行了初步研究;二、采用蛋白质组学方法分析了水稻抗稻瘟病质膜相关蛋白的诱导表达情况。真核生物细胞囊泡运输过程中的膜融合主要是由SNARE蛋白介导的,SNARE蛋白的结构高度保守。研究发现,植物中的SNARE蛋白促进植物细胞板形成,能与离子通道蛋白相互作用,有利于植物的正常生长发育,能提高植物的抗病性及参与植物的向重力性作用。本研究从水稻中克隆了水稻中的SNAP25类蛋白基因OsSNAP32,并对其功能进行初步研究。OsSNAP32基因编码蛋白含有283个氨基酸,在N端和C端分别存在一个Qb-SNARE结构域和一个Qc-SNARE结构域。洋葱表皮瞬时表达亚细胞定位结果表明,OsSNAP32基因的编码蛋白定位于细胞质膜上。半定量RT-PCR的结果表明,该基因的表达受到H_2O_2、PEG6000、SA、ABA、冷、热、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)和白叶枯病菌(Xanthomonas campestris pv.vesicator)这8种胁迫处理的诱导。对T_1代转基因植株进行稻瘟病菌接种处理,发现转正义OsSNAP32基因植株的抗瘟性与对照相比明显增强,转反义OsSNAP32基因植株的抗瘟性与对照相比无明显变化。综上研究结果表明OsSNAP32基因在水稻各种胁迫应答反应中起着重要的调节作用。本研究还克隆了Qb-SNARE蛋白家族成员基因OsNPSN11～13,这3个基因的序列同源性为80%-85%,具有相似的基因组结构,均含有10个外显子和9个内含子,分别定位于水稻第6、3和7条染色体上,多重序列比对结果表明这3个基因与拟南芥的AtNPSN11～13基因的同源性较高,所编码的蛋白均含有一个Qb-SANRE结构域和一个跨膜结构域。洋葱表皮瞬时表达亚细胞定位结果表明,这3个基因均定位于细胞质膜上。将OsNPSN11基因构建到表达载体pET-30a中进行原核表达,并进一步得到纯化蛋白制备多克隆抗体,用该抗体与水稻细胞的不同提取组分进行Western blot,结果表明该基因的编码蛋白定位于质膜上。为了研究水稻中OsNPSN11～13这3个基因的功能,我们用半定量RT-PCR的方法分析这3个基因在H_2O_2、NaCl和PEG6000处理下的表达情况,发现OsNPSN11～12基因在用H_2O_2进行处理时表达量均有所增加,而在用NaCl和PEG6000处理时,OsNPSN11-12基因的表达量有所下降,OsNPSN13基因的表达在各种处理情况下变化并不明显。进一步研究基因的功能,将这3个基因转入酿酒酵母细胞中,对转基因酵母细胞和对照酵母细胞进行H_2O_2、NaCl和甘露醇处理,结果发现,无论是在固体培养基上还是液体培养基上,在用H_2O_2进行处理时,转基因酵母细胞比对照酵母细胞长势好,而在用NaCl和甘露醇进行处理时,转基因酵母细胞比对照酵母细胞长势差表现为更加敏感。为进一步研究基因在植物中的功能,将基因转入烟草中,T_1代转基因幼苗在1/2MS培养基上进行H_2O_2、NaCl和甘露醇处理,结果发现H_2O_2处理后,转基因烟草比未转基因对照烟草长势好,用NaCl和甘露醇处理后,转基因烟草比未转基因对照烟草长势差。由上可知,OsNPSN11～13可能参与酵母和烟草的抗H_2O_2胁迫过程,而在NaCl和甘露醇胁迫过程中可能不起作用。进一步分析OsNPSN11～13这3个基因在抵御生物胁迫过程中的功能。通过半定量RT-PCR的方法分析了水稻植株在接种白叶枯病菌和稻瘟病菌处理后的表达情况发现,在白叶枯病菌接种处理后,OsNPSN11～12基因的表达受到诱导,在稻瘟病菌接种处理后,抗病品种黑壳子粳中OsNPSN11～12基因的表达受到诱导,感病品种苏御糯中OsNPSN11～12基因的表达在处理前后没有明显变化,OsNPSN13基因的表达在两种病原菌处理前后均没有明显变化。鉴于OsNPSN11～12基因在抗稻瘟病品种和感病品种中的表达差异,我们将OsNPSN11基因转化感病品种苏御糯受体,对T_0代转基因植株进行PCR、RT-PCR和Southern blot检测得到阳性植株后,对T_1代转基因植株进行苗期抗瘟性鉴定,结果发现转正义OsNPSN11基因植株的抗性明显增强。以上实验结果表明,OsNPSN11基因在水稻植株抗病过程中起着一定的作用,具体的抗病机制有待进一步的实验证明。植物质膜蛋白在植物抵御病原物侵染早期信号传导途径中起着重要的作用。本文采取改进的质膜蛋白提取、纯化和双向电泳方法,分析了太湖流域地方抗病品种黑壳子粳在稻瘟病菌菌株北1接种处理前后质膜相关蛋白的诱导表达情况。比较分析了未处理和接种处理8h和24h后质膜蛋白的双向电泳图谱,发现有23个蛋白点受到了不同程度地诱导,并对这23个蛋白点进行了质谱鉴定,其中7个蛋白点进行二级串联质谱(MS/MS)结果表明这23个诱导表达蛋白可分为四类:1)与植物生长代谢相关的酶类,如与植物糖酵解相关的丙糖磷酸异构酶(TIM)、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPD),与脂类代谢相关的烯酰CoA水合酶(ECH),与能量代谢相关的苹果酸脱氢酶(MDH)、乙醇脱氢酶(ADH)、1,4苯醌还原酶(QR)和苯醌氧化还原酶(QR2),与氨基酸代谢相关的甲酰四氢叶酸合成酶(FTHFS);2)与植物物质合成分解调节有关的蛋白,如调控质膜多肽(DREPP)、可逆糖基化多肽(RGP)、Remorin蛋白和20S蛋白酶体;3)与抗氧化系统相关的蛋白,如脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)、超氧化物岐化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX);4)与信号传导有关的蛋白,如膜连蛋白(Annexin)和谷胱甘肽转移酶(GST)。本研究发现了一些新的抗病防卫反应早期响应质膜相关蛋白,为了解水稻抗稻瘟病防卫反应机理提供了新的线索。
陈晓峰[5]2011年在《稻瘟病菌NAD（H）激酶MoPos5功能分析及其互作蛋白的筛选》文中进行了进一步梳理由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是世界范围内水稻生产上的重要病害之一,严重制约着世界粮食安全保障。尽管对稻瘟病菌的生长发育和侵染致病等各个阶段都已开展了长期且较为系统的研究,但是迄今为止对其定殖和扩展的分子机制仍然知之甚少。由寄主防御反应产生的活性氧物质是稻瘟病菌定殖、扩展过程中的主要障碍之一,而NAD(H)激酶能通过调节胞内NAD(H)与NADP(H)之间的动态平衡参与活性氧胁迫的防御反应,因此,对稻瘟病菌NAD(H)激酶生物学功能的研究及其相关信号传导途径的探索将有助于为揭示该病原菌定殖、扩展的分子机制提供理论参考依据。MoPos5是稻瘟病菌叁个NAD(H)激酶编码基因中的主效基因,具有NAD(H)激酶典型的保守基序和功能结构域,能够异源互补酿酒酵母POS5缺失突变的氧胁迫生长缺陷。该基因在稻瘟病菌的各个生长发育阶段和侵染致病过程中都有稳定的转录,MoPos5-GFP融合蛋白的亚细胞定位初步断定在线粒体中。MoPos5与稻瘟病菌菌丝体生长、产孢及致病性密切相关。MoPos5缺失导致稻瘟病菌菌丝体生长速度减慢,大约仅有野生型的50%,由于突变体中与胞内活性氧产生有关的MoNox1转录下调,因此推测MoPos5缺失影响了胞内NADPH的合成、打破了胞内活性氧动态平衡,最终影响菌丝体正常生长；MoPos5的缺失也导致稻瘟病菌产孢量下降约45%,主要原因在于分生孢子梗产量减少,而至于分生孢子梗产量减少的原因目前仍不知晓。虽然产孢量下降,但是产生的分生孢子形态结构正常,也能正常地萌发、产生具有功能的附着胞侵入寄主组织,可是侵入寄主组织后,缺失突变体因无法及时清除由寄主防御系统产生的活性氧物质而无法在寄主组织内进一步定殖、扩展,DAB染色可见在其侵染的叶鞘细胞中有大量活性氧物质积累,最终导致突变体致病性严重减弱。此外,MoPos5也是稻瘟病菌利用亚麻酸作为碳源时所必需的,因其催化产生的NADPH参与了过氧化物酶体中偶数位不饱和肪酸β-氧化。MoPos5的过量表达对稻瘟病菌的生长发育、细胞分化及致病性并无明显影响,只是产孢量略微有所增加、MoNox1的转录水平略微上调。稻瘟病菌中的另两个NAD(H)激酶编码基因MoNADK2和MoNADK3在Mopos5缺失突变体中表达上调,表明叁个NAD(H)激酶间在一定程度上存在功能互补关系,MoNADK2和MoNADK3可能部分弥补着MoPos5缺失造成的功能缺陷,比如维持胞内必需的NADPH水平。借助酵母双杂交系统,共获得了9个MoPos5的互作蛋白,其中6个是通过酵母双杂交筛选稻瘟病菌Guy11菌丝体阶段cDNA文库获得的,另3个则属于Pos5p互作蛋白在稻瘟病菌中的同源蛋白。通过生物信息学预测分析,并结合相关同源蛋白的研究报道,MoPos5的互作蛋白很可能参与调控了细胞骨架建成、细胞运动、细胞分裂、细胞老化与死亡、线粒体功能维持、胁迫防御反应、物质与能量代谢和信号传导等多种多样的生物学进程。综上所述,NAD(H)激酶MoPos5可能通过多种多样的效应蛋白调节着胞内外的活性氧物质水平,从而调控了稻瘟病菌的生长发育及其在寄主组织内定殖、扩展。
谢金水[6]2012年在《生育后期养分胁迫对水稻衰老进程影响的蛋白质组学研究》文中研究指明水稻既是世界重要的粮食作物之一,又是基因组学研究的模式材料,在生产实践和科学研究中都占有极其重要的地位。杂交水稻具有适应性广、多抗、高产、优质等特点,但部分杂交稻组合存在早衰现象,水稻早衰不仅影响后期干物质的生产和积累,也会影响前期积累的干物质转化为产量的实现,影响籽粒灌浆和干物质的运输与分配,最终阻碍产量潜力的发挥。杂交水稻早衰是一个相对复杂的生理生化过程,除受遗传因素影响外,环境条件也是水稻发生早衰的重要诱导因子。本研究采用双向电泳分离技术、蛋白质质谱分析技术以及生物信息学等手段,对养分胁迫下易早衰杂交早稻威优916灌浆期根、叶、叶鞘及籽粒蛋白质组的差异表达进行分析,探讨杂交水稻早衰机理及在不同组织器官中的代谢特征,是学科前沿与实际应用的有机结合,在科研和生产实践中都具有重要的意义。首先,不同处理下易早衰杂交早稻威优916根、叶、叶鞘及籽粒的四个时期可溶性蛋白经双向电泳分离,构建了相应器官的蛋白质组表达图谱,并对发生了差异表达的121个目的蛋白质点进行了MALDI-TOF-MS/MS分析和数据库检索鉴定,共有89个蛋白质功能得到鉴定,成功率为73.55%。这些被鉴定的蛋白质根据其功能可以分为6个不同类别,其中绝大数为光合作用、抗性及逆境信号传递、特定器官生长发育相关蛋白质。生育后期持续的养分胁迫,诱导了威优916剑叶中的部分蛋白质发生了差异表达,其中绝大部分为光合作用、信号传导及胁迫抗性相关蛋白质。与光合作用相关蛋白质如转酮醇酶、核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基、核酮糖磷酸盐羧化酶主链蛋白前体等在整个养分胁迫期间表达量均是大幅下降,表明叶片的光合能力显着下降,光合产物减少。信号传导及胁迫抗性相关蛋白质包括丝氨酸蛋白激酶、半胱氨酸合成酶及S-腺苷甲硫氨酸合成酶等,养分胁迫诱导了叶片中大量该类蛋白质的积累,表明叶片能够感知并传递外界胁迫信号,使其能够迅速启动逆境防御系统,最大限度的减少逆境伤害,而类胚素蛋白的高表达和过氧化氢酶类的低表达,会导致叶片中大量H202积累,从而破坏叶片的正常生理活动。叶鞘中受养分胁迫影响的蛋白质大部分为信号传导及胁迫抗性相关蛋白质,其次为光合作用相关蛋白质。信号传导及胁迫抗性相关蛋白质包括铁蛋白、分泌型过氧化物酶及谷胱甘肽硫转移酶等,养分胁迫导致叶鞘中这些保护酶类在处理两周后的表达量逐渐下调,而充分的养分供应则使叶鞘中保护酶表达量持续上调,意味着养分胁迫导致叶鞘的抗逆性减弱,而逆境响应蛋白质V型ATP酶和乙醇脱氢酶表达量上调表达,叶鞘感知胁迫加剧并传递信号。养分胁迫导致叶鞘中叶绿素合成受阻,直接参与光合作用蛋白质表达量下调,叶鞘光合能力下降。因养分胁迫而发生差异表达的根系蛋白质中,绝大部分为根系生长发育和逆境胁迫响应相关蛋白质。养分胁迫前中期诱导了威优916根系中包括阿拉伯呋喃糖苷酶、RGP蛋白、几丁质酶等根系生长类蛋白质的上调表达,从而促进了根系的快速分化和生长,是植物根系养分缺乏环境下的一种自我调节机制,通过增大根系吸收面积来提高吸收效率。逆境胁迫响应相关蛋白质包括甘油-3-磷酸脱氢酶、过氧化物酶植物凝集素等,这些蛋白质均为胁迫应激反应类蛋白质,这些蛋白质在根系中的上调表达,表明根系感知胁迫反应剧烈。养分胁迫对水稻的影响最终都会通过籽粒这个特定的器官表现出来,养分胁迫导致籽粒的结实率和千粒重显着下降。通过对籽粒的蛋白质组表达变化分析发现,养分胁迫诱导了威优916籽粒中的部分蛋白质发生了差异表达,其中绝大多数为籽粒充实发育相关蛋白质,如谷蛋白、WD40结构域蛋白、胚蛋白等,这类蛋白质在快速灌浆的前中期表达量下调,导致籽粒灌浆和胚发育不良。而籽粒中热激蛋白质Hsp70、半胱氨酸合成酶、分支酸变位酶等逆境抗性及信号传递蛋白质的差异表达,表明籽粒作为最终的“库”器官同样能够感知胁迫信号,但保护类蛋白质的下调表达也意味着植株的抗性减弱。本研究利用蛋白质组学方法来揭示养分胁迫对易早衰水稻不同器官组织的衰老进程影响,鉴定了一些发生了差异表达的蛋白质,通过对其功能及表达量变化的分析,为更好的理解水稻早衰生理代谢机理提供依据。
彭振英[7]2008年在《小麦渐渗系耐盐抗旱的蛋白质组学比较研究》文中研究说明近年来,由于环境变化加剧,对世界范围内的作物生长带来了巨大的影响.据统计,在世界范围内,适于耕种的土地不足10%,大部分土地处于干旱、盐渍、沼泽、冷土等逆境中。因而对植物盐、旱胁迫应答机制进行深入研究,培育耐盐、抗旱作物新品种,是现代农业的一项重要任务。本实验室已通过不对称体细胞杂交方法成功育成世界首例体细胞杂种耐盐、抗旱、高产小麦新品种山融3号,该品种为含有少量供体亲本高冰草遗传物质的小麦渐渗系。本试验通过双向电泳(2-DE)方法获得了山融3号及其亲本普通小麦济南177幼苗根和叶的盐、旱胁迫差异蛋白质组图谱,并利用质谱(MALTI-TOF-TOF MS)技术鉴定了差异表达蛋白质,再采用RT-PCR方法分析这些差异表达蛋白编码序列的表达方式,从蛋白质组学和转录水平上系统分析了杂种及其亲本小麦不同组织器官对盐、旱胁迫的应答特征,探讨了山融3号可能的耐盐、抗旱机制。1.在济南177与山融3号幼苗根中发现了93个差异表达蛋白质,并通过MS鉴定了88个。首先,山融3号与济南177根蛋白质组本身具有差异。在山融3号和济南177根中特异表达的蛋白分别有13个和21个。其次,山融3号和济南177中的盐、旱胁迫诱导蛋白存在显着差异,在鉴定的20个盐、旱诱导型蛋白中,3个在山融3号中被特异诱导,5个在济南177中被特异诱导,其余12个在济南177与山融3号均被诱导;第叁,盐、旱胁迫响应蛋白在盐、旱胁迫下的表达模式有较大差异。盐胁迫诱导上调和下调的蛋白数量分别比旱胁迫增加19.2%和11.7%,表明盐胁迫可能引起细胞更剧烈更广泛的胁迫应答过程和更多胁迫响应蛋白的表达变化。而另外一些蛋白如醌还原酶(根90)与翻译起始因子5A3(根74)在济南177根中旱胁迫下表达下调而盐胁迫下被抑制,则表明盐胁迫与旱胁迫的信号转导和效应特征存在一定的差异。第四,根中盐、旱胁迫响应蛋白的表达模式具有品种差异,表现为同种蛋白在济南177与山融3号根中的表达模式不同。如核苷切除修复蛋白(根21)在盐、旱胁迫下济南177根中表达下调而山融3号根中表达不变,醛缩酶(根8)在旱胁迫下济南177根中表达不变而山融3号根中表达上调,盐胁迫下根74在济南177根中的表达被抑止而在山融3号根中的表达下调。表明体细胞杂交改变了胁迫响应蛋白对盐、旱胁迫的应答模式。2.在济南177与山融3号叶中发现了65个差异表达蛋白质,并通过MS鉴定了63个。比较分析显示,它们表现出与根中相似的各种差异。例如:叶中盐、旱胁迫响应蛋白的表达模式也有较大差别:叶绿素a/b结合蛋白CP24前体(叶1)在山融3号叶中旱胁迫下表达上调12.7倍而盐胁迫下表达上调6.1倍,过氧化氢酶(叶23)在济南177叶中盐胁迫下表达被抑止;超氧化物歧化酶(叶51)在济南177叶中旱胁迫下表达上调而盐胁迫下表达不变,这些差异反应了盐与旱胁迫信号途径调节机制的差异。而叶中盐、旱胁迫响应蛋白的表达模式也具有品种差异:如叶绿素a/b结合蛋白CP24前体(叶1)在盐、旱胁迫下济南177叶中表达下调而在山融3号的叶中表达上调,2—半胱氨酸氧还蛋白类似蛋白(叶21)在旱胁迫下的济南177叶中表达不变而在山融3号叶中表达上调,盐胁迫下过氧化氢酶(叶23)在济南177叶中表达被抑止而山融3号叶中表达上调。但是,山融3号与济南177叶蛋白质组间的差异没有根蛋白质组间明显;山融3号和济南177叶中盐、旱胁迫诱导蛋白差异也比根中小,在发现的14个盐、旱诱导型蛋白中,只有1个是山融3号特异性的盐胁迫诱导型蛋白,其余13个在济南177与山融3号中均被盐、旱诱导。3.对28个蛋白(包括25个差异表达蛋白和叁个已知的盐胁迫密切相关蛋白SOS1/2/3)进行RT-PCR检验,结果表明:第一,11个蛋白编码序列的转录本在各处理之间没有显着差异,其余17个在各处理间表现出不同的差异表达特征。这表明基因的转录和翻译是两个相对独立的过程,胁迫响应蛋白在转录和翻译水平上的表达特征没有直接相关性,其表达在不同水平上受到多样而立体的调控。第二,在转录水平上没有发现以上根与叶蛋白质组中的品种特异性表达蛋白,也就是说,没有一个蛋白在转录水平是品种特异性的。由此推测,山融3号与亲本济南177的品种特异性蛋白的表达调控主要发生在转录后水平,体细胞杂交抑制某些mRNA翻译成蛋白,而激活另一些原本不能翻译的mRNA产生新蛋白。第叁,盐胁迫下在转录水平发生改变蛋白的比例明显高于旱胁迫(根中高7.1-14.3%,叶中高28.6-32.2%),说明盐胁迫能引起细胞更大范围的胁迫应答过程,使更多的胁迫响应蛋白在转录水平发生变化,这与蛋白水平的状况是一致的。4.根和叶中盐、旱胁迫的差异表达蛋白的类型明显不同。1)光合作用相关蛋白差别明显,在叶中占25.81%,在根中没有发现这类蛋白。在根中鉴定了另外3种叶绿体蛋白,分别是谷氨酰氨合成酶叶同工酶,叶绿体前体(根45)、铁氧还蛋白硝酸还原酶,叶绿体前体(根29)、转酮酶,叶绿体(根4),有关这些叶绿体蛋白在根中的作用有待进一步研究。2)抗氧化相关蛋白有较大差异,山融3号根中的品种特异性抗氧化相关蛋白有6个而叶中只有1个。济南177根中的品种特异性抗氧化蛋白有3个而叶中没有。说明根的抗氧化作用远比叶大,而且山融3号的抗氧化能力比济南177强。3)物质转运相关蛋白差异显着。在根中共鉴定了6个而在叶中鉴定了3个。根中的液泡质子ATP酶亚基(根70)和钾离子通道β亚基(根86)在维持液泡质子动态平衡和离子的跨膜运输中具有重要作用。从本实验结果来看,在应对盐、旱胁迫时根的作用比叶大。5.体细胞杂交对小麦蛋白质组产生显着影响:1)体细胞杂交影响叶绿体和线粒体中蛋白质的表达;2)相对于亲本济南177,山融3号中有些蛋白的表达被抑制,同时合成一些新蛋白或使蛋白发生翻译后修饰;3)体细胞杂交改变某些胁迫应答蛋白的表达模式:如脱氢抗坏血酸还原酶(根38)在旱胁迫下,济南177根中表达上调20.3倍而山融3号中表达不变;在盐胁迫下,济南177根中表达上调14倍而山融3号根中表达上调25.1倍。过氧化氢酶(叶23)在旱胁迫下济南177中表达不变而山融3号表达上调7.8倍,在盐胁迫下济南177中不表达而在山融3号中上调表达9.4倍。总之,在蛋白质组水平上,体细胞杂交使小麦幼苗根与叶蛋白质组与转录组发生了全局性变化,使得山融3号光合作用系统、能量转化系统、抗氧化系统以及离子动态平衡调节系统远远优于其亲本济南177。正是这些系统性的变化提高了杂种中由多基因控制的数量性状耐盐、抗旱能力。无论在蛋白质组水平还是在转录水平,盐胁迫与旱胁迫信号途径既有重迭又有区别,表现为一部分胁迫响应蛋白对盐、旱胁迫的应答模式不同。通过根与叶蛋白质组的比较分析表明,根在对抗盐、旱胁迫时能够发挥更重要的作用,根蛋白质组比叶蛋白质组能够更准确地反应植物的耐盐、抗旱能力。
夏冰[8]2013年在《非生物胁迫下SICMO基因在辽宁碱蓬和pC-CMO转基因烟草中表达特性分析》文中进行了进一步梳理甜菜碱是生物体内一类小分子渗透调节物质，在植物受到非生物胁迫时起着重要的作用。胆碱单加氧酶（choline monooxygenase，CMO）是植物甜菜碱合成过程中的关键酶，了解CMO基因在植物中的表达特性对研究植物的抗逆性有着重要的作用。本研究使用半定量RT-PCR和荧光实时定量PCR的方法，分析SlCMO基因及对比在盐生植物辽宁碱蓬（Suaeda liaotungensis K.）和pC-CMO（SlCMO启动子驱动SlCMO基因）转基因烟草中的表达特性，主要结果及结论如下：非胁迫条件下，SlCMO基因在辽宁碱蓬叶、茎、根中均有表达，在茎、叶中的表达量远高于其在根中的表达。盐、干旱、低温、ABA胁迫条件下，SlCMO基因在辽宁碱蓬叶、茎、根中的表达量基本呈现先升高后降低的趋势，胁迫解除后，其表达量基本回到未处理时水平。SlCMO基因在辽宁碱蓬叶、茎、根中的表达均响应盐、干旱、低温胁迫。同时，SlCMO基因在辽宁碱蓬叶、茎、根中的表达均受ABA诱导，SlCMO基因的表达是ABA依赖的。非胁迫条件下，SlCMO基因在pC-CMO转基因烟草叶、茎、根中均有表达，在叶、茎中的表达量高于其在根中的表达。盐、干旱、低温胁迫条件下，SlCMO基因在pC-CMO转基因烟草叶、茎、根中的表达量基本呈现先升高后降低的趋势，胁迫解除后，其表达量基本回到未处理时水平。表明pC启动子含有盐、冷、干旱胁迫诱导启动元件，是诱导启动子。ABA处理后，SlCMO基因在pC-CMO转烟草叶、茎、根中的表达量基本呈现降低的趋势，解除ABA胁迫后，其表达量未回到非胁迫时水平。SlCMO基因在pC-CMO转基因烟草叶、茎、根中的表达不受ABA诱导，表明pC启动子缺少ABA诱导元件，与其在辽宁碱蓬叶、茎、根中的表达方式不同。SlCMO启动子驱动的SlCMO基因在pC-CMO转基因烟草中的表达特性与其在辽宁碱蓬中的表达特性大体相同，SlCMO启动子可用于提高作物抗逆性的基因工程育种中。
王经源[9]2008年在《杂交稻苗期杂种优势的比较蛋白质组学研究》文中进行了进一步梳理杂种优势是一种普遍存在的生物学现象，指两个遗传性不同的亲本杂交产生的杂交种在生长势、生活力、抗逆性以及产量、品质等方面优于其双亲的现象。杂种优势的利用获得了巨大的经济和社会效益。但对杂种优势机理的探索远远落后于对它的实践应用。近年来对杂种优势分子基础的研究成为一个热点，在mRNA转录水平发现了许多杂种基因表达偏离亲本平均水平的非加性表达(nonadditive expression)现象，但在蛋白质水平的研究却很少。本研究采用荧光差异凝胶电泳，双向电泳和MALDI-TOF-MS技术，对强优势杂交水稻——汕优63及其亲本的胚、苗期第3叶以及根系的蛋白质组进行比较研究，探寻它们在蛋白质组水平上的基因表达特征，研究结果如下：(1)对强优势杂交水稻——汕优63及其亲本的成熟胚蛋白质组进行分析。从不育系珍汕97A、保持系珍汕97B、恢复系明恢63及杂种一代汕优63的胚中分别分离到965．7±19．2，964．7±16．7，961±18．7，982．7±19个蛋白质点。发现同核异质的珍汕97A与珍汕97B的胚蛋白质组电泳图谱基本相同，珍汕97A有19个稳定可重复的蛋白质点不同于恢复系明恢63，明恢63有17个稳定可重复的蛋白质点不同于珍汕97A，这些亲本间的差异蛋白质都在F_1汕优63中表达，表现为共显性或显性效应，未发现杂种特异表达的蛋白质，这些蛋白质主要呈加性表达，少数为非加性表达。经MALDI-TOF-MS／MS鉴定了其中20个差异蛋白，9个获得有显着性意义的鉴定结果。其中2种与代谢相关，分别为推定的磷酸甘油酸变位酶和二氢硫辛酸脱氢酶；1种可能与防御相关的几丁质酶；另有1种蛋白质含晚期胚胎丰富蛋白序列，其余为推定的球蛋白。(2)对汕优63组合3叶1心期地上部分性状进行了观察分析，发现汕优63在苗期的株高、叶长和叶宽表现为不同程度的中亲优势，分别为13．14％、14．79％和5．95％，均未超亲。但叶面积表现为显着的超高亲优势，达15．72％。分析认为叶面积的超亲优势与叶长和叶宽两个子性状间的乘数效应有关。对汕优63及其双亲苗期第3叶蛋白质组进行DIGE定量比较分析，分离到1667个以上的蛋白质点。发现有23个蛋白质点在叁个品系间存在显着差异(p＜0．01)。其中16个双亲间的差异表达蛋白质在汕优63的丰度接近于双亲均值，占全部69．6％；2个蛋白质点的丰度对双亲均值偏离超过20％，其余5个蛋白质点偏离幅度在10-20％之间，表现为不同程度的非加性表达效应。经MALDI-TOF-MS分析，有22个差异蛋白得到成功鉴定，包括9对存在差异的等位基因。其中2种与呼吸代谢相关，分别为推定的磷酸甘油酸变位酶以及二氢硫辛酸脱氢酶；1种蛋白质与基因表达调控有关，为RPS5包含蛋白；1种铁氧还蛋白-NADP还原酶是光合作用的重要酶类；1种推定的β-羟基类固醇脱氢酶/异构酶，可能与类固醇代谢有关；另3种蛋白质可能与保护防御相关，分别是肽-甲硫氨酸亚砜还原酶、推定的肽-甲硫氨酸亚砜还原酶和GSH依赖脱氢抗坏血酸还原酶。其中铁氧还蛋白-NADP还原酶的正向非加性表达，可能与F1光饱和点较高等优良光合性状有关。(3)对汕优63及其亲本3叶1心期根系蛋白质组进行比较分析，通过双向电泳和考马斯亮蓝染色，发现23个可重复的差异蛋白质点。双亲间所有的差异点均在F_1汕优63中出现，有4个蛋白质表现为明显的非加性表达效应，未发现杂种特异表达的蛋白质，差异点19在杂种中的表达受到明显抑制。对23个蛋白质点进行MALDI-TOF-MS／MS鉴定，均得到有显着性的结果．有7种蛋白质与物质能量代谢相关，分别为推定的磷酸甘油酸变位酶，烯醇化酶，甲基丙二酸半醛脱氢酶以及脱氢抗坏血酸还原酶，胞浆苹果酸脱氢酶以及一种推定的β-1，3-葡聚糖酶；有2种酶与信号转导有关，分别是腺苷甲硫氨酸合成酶和N-氨甲酰腐胺酰胺酶；腺苷甲硫氨酸合成酶及槲皮素3-o-甲基转移酶1与次生物质代谢相关。还发现可能与蛋白质相互作用有关的kelch重复片段包含蛋白，推测其可能与上位性效应有关。(4)探讨了杂种优势理论无法充分解释育种实践上的杂种优势的现象及原因。认为局部优势并不一定导致整体的杂种优势，已有的理论可以解释局部优势，但无法解释做为整体的杂种优势。对局部优势与整体优势的关系做初步分析，提出局部性状优势主要通过乘数关系组织为整体杂种优势的观点，认为乘数关系和乘数效应是杂种优势形成的重要基础。对这一观点做初步的展开论述，并得出一些与杂交水稻高产育种工作相关的推论。本研究首次利用蛋白质组学的方法对杂交水稻不同器官的蛋白质组进行比较分析，得到杂交水稻在蛋白质组水平上的基因表达特点和有关数据，鉴定了一些有价值的蛋白质，并发现一些双亲间的新等位基因，包括一些功能尚未完全明确的水稻基因。此外还分析了局部优势与整体优势的关系，提出局部性状优势主要通过乘数关系组织为整体杂种优势，乘数关系和乘数效应是杂种优势形成的重要基础的观点。这些工作为了解强优势杂交水稻杂种优势在蛋白质组水平上的基因表达基础积累了一些必要资料，是前人在转录水平上的研究的必要互补，为更好地阐明杂种优势的机制提供依据。
曾凡荣[10]2010年在《水稻铬毒害和耐性的生理与分子机理研究》文中认为土壤铬污染已对农业生产和人类健康造成了严重的威胁。环境中的铬主要以Cr3+和Cr6+两种氧化形态存在。虽然Cr3+是人类和动物必需的营养元素,但Cr3+和Cr6+对植物都具有严重的毒害作用,且Cr6+的毒性远强于Cr3+。与镉、铅、铝等重金属相比,铬的电子化学结构更为复杂,在自然条件下Cr3+与Cr6+极易通过氧化还原反应发生相互转化,这些特性使铬毒害和耐性研究相对迟缓。迄今,铬在植物生长发育和生理代谢上的毒害作用虽已有一定的了解,但有关铬毒害和耐性的机理尚缺乏深入研究。本研究以铬耐性与积累差异显着的水稻基因型(秀水113和单K5)为材料,从铬的环境化学、铬的毒害效应、水稻对铬的吸收和积累、铬在水稻组织的亚细胞分布以及水稻铬胁迫响应的蛋白质组学等方面系统地研究了水稻铬耐性的生理和分子机理,并探索了缓解铬毒害的化学调控途径。主要研究结果如下：1.土壤pH值和有机质含量对土壤重金属有效态以及水稻籽粒中重金属含量的影响植物对重金属的吸收一方面与植物的遗传和生理特性有关,另一方面主要受土壤中重金属迁移性和有效性的影响,而它们则由土壤的各种理化特性决定。本试验通过测定Cr、Cu、Fe、Mn、Pb和Zn等重金属在不同土壤中的有效态含量和水稻植株与籽粒中的浓度,研究了土壤pH值和有机质含量对稻田重金属有效性和水稻吸收重金属的影响。结果显示,土壤中有效态重金属含量与土壤pH值呈显着负相关,而与有机质含量呈显着正相关。多元回归分析表明,土壤pH和有机质含量对Cu、Pb和Zn的有效性变化均有显着影响,而Cr、Fe的有效性主要受有机质含量的影响,Mn的有效性受土壤pH的影响较大。结果还显示,土壤中有效态重金属含量高的试验点水稻植株重金属含量相对较高,说明土壤重金属的有效性影响着水稻对重金属的吸收和积累。相关分析表明,水稻植株和籽粒中重金属的含量与土壤pH值呈负相关,而与土壤有机质含量呈正相关。多元回归分析结果揭示,土壤pH值是影响水稻植株中重金属含量的重要因素。由此推测,大田生产上通过相关农艺措施调节土壤的酸碱度,可有效降低稻米的重金属含量。2.水稻籽粒中铬、镉、铅含量的基因型和环境差异重金属的吸收和积累在不同作物种类之间以及同一作物不同基因型之间存在着显着差异,选育或培育具有重金属低积累特性的作物品种是降低重金属污染地区作物产品重金属含量的有效途径。在低积累重金属作物品种的筛选上,有效地评估和鉴定食用器官的重金属含量是关键技术。本试验以138份水稻品种(品系)为材料,分析了它们种植在不同污染程度土壤中的植株和籽粒重金属含量。结果显示,水稻籽粒Cr、Cd和Pb含量随土壤污染程度的加重而增加,同时不同基因型之间存在着显着的差异。在叁种污染程度下,138份水稻材料的籽粒Cr浓度最大值／最小值比均达20倍以上,基因型间的变异系数超过55%。水稻基因型与环境(污染程度)对籽粒中Cr、Cd以及Pb含量有显着的互作效应。本研究筛选到一批籽粒Cr、Cd、Pb含量在叁种污染程度下始终保持高水平或低水平的水稻品种(品系),如HG-5、单K5和湖优-1的籽粒在叁种污染程度下均具有高Cr含量；而秀水113、秀水09和明珠1号的籽粒则具有低Cr含量；秀水11、嘉02-5和明珠1号为籽粒高镉积累材料,而春江026、春江11和湖97-98为籽粒低镉积累材料；单K5、单K8、嘉单繁18为籽粒高铅积累材料,而嘉02-5、嘉C1和单K15为籽粒低铅积累材料。3.铬胁迫对水稻抗氧化系统和养分吸收积累的影响本试验以两个前期筛选出的籽粒铬积累特性不同的水稻品种(秀水113和单K5)为材料,分析了铬胁迫对水稻抗氧化系统和养分吸收积累的影响。低水平铬处理(10μM Cr)对MDA含量影响不大,但增加SOD和POD的活性。在高铬水平(100μM)下,水稻叶片和根系的MDA含量显着增加,SOD和POD活性则显着降低,说明高水平铬处理对水稻幼苗造成了严重的氧化胁迫。另外,高浓度铬处理显着降低水稻根、茎、叶、籽粒中营养元素的含量,说明铬胁迫干扰植物养分的吸收和分配。水稻单株养分积累量在10μM Cr处理下最高,在100μM Cr处理下最低,其原因与铬胁迫造成水稻植株生长受阻和根细胞损伤有关。铬对养分积累的影响因基因型而异,铬胁迫下单K5中N、P、K、Ca、Zn的单株积累量均显着高于秀水113。4.铬胁迫对水稻根际pH值变化和有机酸分泌的影响本试验通过测定水稻培养液的pH值和检测水稻根系分泌的有机酸含量,研究了不同铬处理水平下根际pH值和有机酸分泌的变化。结果表明,水稻根际的pH值随铬处理浓度的增加和处理时间的延长而显着升高。当营养液中铬处理浓度增加到100μM时,根际pH值明显高于初始调节的pH值(5.10),说明100μM Cr处理严重影响水稻的根系活力以及阴阳离子的吸收平衡。随着铬胁迫水平的升高,根系分泌的有机酸含量显着增加。在测定的六种有机酸中,草酸和苹果酸含量明显高于柠檬酸、乙酸、乳酸和琥珀酸,可以认为前两种是铬胁迫下水稻分泌的主要有机酸。相关分析显示,铬在水稻体内的积累量与根际pH值、草酸、苹果酸、柠檬酸含量呈显着正相关,说明根际pH值升高以及草酸、苹果酸和柠檬酸分泌量增加导致水稻植株中铬积累量增多。另外,根际pH值也与草酸、苹果酸和柠檬酸分泌量呈显着正相关,表明这叁种有机酸的分泌对根际pH值的变化可能起有重要作用。5.水稻铬吸收的动力学研究无论Cr3+还是Cr6+对各种生物都具有显着的毒害作用,而且Cr6+的毒性远高于Cr3+。植物对铬的吸收是铬植物体内积累和对植物造成毒害的前提,但是,迄今为止植物对铬的吸收动态及模式尚缺乏研究。本试验以水稻为材料,研究了溶液培养条件下水稻根对Cr3+和Cr6+吸收的动力学特征。结果显示,在Cr3+0-250μM和Cr6+0-500μM范围内,水稻根系对Cr3+和Cr6+的吸收速率均随着溶液中铬浓度的提高而增加,并逐渐在高铬浓度处理下趋于饱和。拟合分析表明,Cr3+和Cr6+的吸收均可用Michaelis-Menten动力学方程描述,Cr3+具有较低的Km值和较高的Vmax值,水稻根系对Cr3+的亲和力和吸收能力均大于Cr6+。在0.5-48 h处理时间内,水稻根系中铬浓度随着时间的推移而增加。但是, Cr3+含量在t=12h后趋于饱和,而Cr6+含量仍持续增加。水稻根系对Cr3+和Cr6+的响应速率表现不同,100μM Cr3+处理0.5h后,水稻根中铬含量可达400 mg g-1 DW,而100μM Cr6+处理0.5h后,水稻根中铬含量不到20 mg g-1 DW,说明Cr3+比Cr6+更易被水稻根系吸收,且其达到吸收饱和较快。另外,Cr吸收的动力学特征显示两供试基因型存在着差异,单K5对Cr3+和Cr6+的Km值和Vmax值都明显高于秀水113,说明单K5对Cr的亲和力虽不如秀水113,但其铬吸收潜力较大。营养液中添加正钒酸盐和2,4-DNP(代谢抑制剂),Cr6+的吸收显着降低,而Cr3+的吸收影响较小,说明Cr6+的吸收需要能量参与,而Cr3+的吸收需能较少由此可见Cr6+与Cr3+分别具有不同的吸收途径或方式。6.铬在水稻组织和亚细胞水平上的分布和化学形态特征分析重金属在植株体内过量积累是植物受重金属毒害的重要原因,而植物组织中重金属的亚细胞水平分布与重金属毒害关系密切。本试验以铬积累特性不同的水稻品种为材料,采用同步辐射微束X射线荧光光谱分析μ-SRXRF)、差速离心以及逐步化学提取法研究了铬在水稻组织和亚细胞水平上的分布特点和化合形态特征,试图阐明铬在水稻植株体内的吸收、积累的机理以及水稻的耐性机制。μ-SRXRF结果显示,水稻根系中的Cr绝大部分累积在表皮细胞中；水稻茎和叶中的铬则主要分布于表皮和维管束组织,其他组织中的铬含量非常低,说明表皮层细胞对铬的阻隔作用可能是植物体内铬迁移受到限制的重要原因,而水稻根系吸收的Cr则主要通过木质部导管向地上部组织运输。在亚细胞水平上,不管在何种Cr处理浓度下,水稻根系中的Cr绝大部分都分布在细胞壁上；而在水稻茎秆和叶片细胞中,随着Cr处理水平的升高,Cr在可溶性组分中的分配比例显着增加。以上结果表明,细胞壁和液泡是水稻细胞内Cr的主要分布部位,而细胞中具有重要代谢功能的细胞器(如：叶绿体、线粒体等)Cr分布相对较少。另外,逐步化学试剂提取法对水稻植株体内铬的化学形态研究表明,低铬处理下,水稻组织中铬以乙醇和去离子水提取态为主,说明硝酸盐、氯化物和氨基酸以及某些水溶性有机酸对铬的吸收和转运具有重要作用；而高铬处理下,乙醇和去离子水提取态比例显着下降,盐酸和残渣提取态转为铬的主要存在形态,表明磷酸盐、草酸盐以及难溶性高分子量化合物在阻止铬在水稻根系中移动、缓解铬毒害上发挥着一定的作用。7.水稻叶、根在不同铬处理下蛋白质差异表达的研究为了深入阐明植物铬毒害和耐性的分子机理,本研究利用双向电泳和MALDI-TOF质谱技术对Cr积累特性不同的两个水稻基因型(秀水113、单K5)叶片和根在0、2、200μM Cr处理条件下蛋白质组表达的变化进行了分析。水稻叶片中鉴定成功41个蛋白点,其中秀水113有21个,单K5有20个,这些蛋白以RuBisco和能量代谢相关蛋白为主。水稻根系中仅14个蛋白点质谱鉴定成功,其中秀水113有4个,单K5有10个,它们大多数与环境胁迫相关。本研究检测到一批对铬胁迫有响应且表达上调的蛋白,如NADP-异柠檬酸脱氢酶、热激蛋白(Hsp90)、乙二醛酶Ⅰ、蛋白质糖基化多肽、S-腺苷甲硫氨酸合成酶、谷氨酰胺合成酶、ATP合成酶以及两个信号分子,G蛋白β亚基和信号识别颗粒54蛋白等。这些蛋白质中,大部分已被证实与盐害、冷害等环境胁迫的耐性有关,但在铬胁迫的耐性研究中涉及非常少,而蛋白质糖基化多肽与重金属等环境胁迫的关系为首次报道。本研究鉴定到的铬胁迫响应蛋白可为深入阐明水稻铬耐性机理提供新的契机。8.外源还原型谷胱甘肽(GSH)对水稻铬毒害的缓解效应本试验通过分析Cr胁迫下不同浓度GSH处理后水稻植株生长、叶绿素和可溶性蛋白质含量、抗氧化酶活性以及膜脂过氧化程度的变化,研究了外源GSH处理对铬胁迫的缓解效应。结果显示,100μM Cr处理下,植株生长、叶绿素和可溶性蛋白含量显着降低,添加外源GSH后,铬胁迫造成的抑制效应得到明显缓解,说明外源GSH可减轻了Cr胁迫对水稻幼苗的毒害。100μM Cr处理导致水稻叶片和根系中MDA含量的急剧增加以及某些抗氧化物酶活性的降低,说明对水稻幼苗产生了严重的氧化胁迫,而外源GSH的加入显着提高叶片和根系的抗氧化物酶活性,降低叶片和根系中的MDA含量,表明GSH可通过增强水稻的抗氧化能力而减轻铬的毒害。此外,外源GSH的加入虽然显着增加根的铬含量,但显着降低水稻地上部组织中的铬含量,即降低了铬由地下部向地上部的转运,说明外源GSH促使更多的铬滞留在水稻根系,这可能与GSH的还原以及对金属离子的螯合区室化效应有关。9.硅营养对水稻铬毒害的缓解效应本试验研究了施硅对铬胁迫下水稻植株生长、可溶性蛋白质含量、抗氧化酶活性以及膜脂过氧化的影响。结果表明,100μM Cr处理显着降低水稻株高和干重、可溶性蛋白含量和根系抗氧化酶活性,而明显增加组织中Cr含量和MDA含量。水培液中添加硅营养,铬胁迫对水稻植株生长造成的抑制效应得到有效缓解。硅营养加入也显着降低水稻植株对铬的吸收及向地上部组织的转运。另外,硅营养可通过增高叶片和根系中抗氧化物酶活性和降低MDA含量缓解Cr毒害引起的氧化胁迫。试验结果还显示,硅营养对氧化胁迫的缓解有一定的基因型效应,单K5叶片中SOD、POD、CAT以及AXP活性在低浓度Si处理(75mg L-1)即可快速增加,而秀水113则需高浓度Si处理(150mg L-1),说明硅营养对单K5氧化胁迫的缓解效应要比秀水113更为有效。
参考文献：
[1]. 水稻叶特异表达基因及苹果酸脱氢酶基因的克隆和功能分析[D]. 林长发. 复旦大学. 2003
[2]. 稻瘟菌诱导性水稻OsFd和OsFNR基因的cDNA克隆与诱导表达[D]. 耿丽华. 山东农业大学. 2004
[3]. 水稻NADP-苹果酸酶与逆境关系的研究[D]. 程玉祥. 东北林业大学. 2005
[4]. 水稻SNARE蛋白基因的克隆与功能分析[D]. 鲍永美. 南京农业大学. 2007
[5]. 稻瘟病菌NAD（H）激酶MoPos5功能分析及其互作蛋白的筛选[D]. 陈晓峰. 福建农林大学. 2011
[6]. 生育后期养分胁迫对水稻衰老进程影响的蛋白质组学研究[D]. 谢金水. 江西农业大学. 2012
[7]. 小麦渐渗系耐盐抗旱的蛋白质组学比较研究[D]. 彭振英. 山东大学. 2008
[8]. 非生物胁迫下SICMO基因在辽宁碱蓬和pC-CMO转基因烟草中表达特性分析[D]. 夏冰. 辽宁师范大学. 2013
[9]. 杂交稻苗期杂种优势的比较蛋白质组学研究[D]. 王经源. 福建农林大学. 2008
[10]. 水稻铬毒害和耐性的生理与分子机理研究[D]. 曾凡荣. 浙江大学. 2010
标签：农作物论文; 水稻论文; 转基因植物论文; 蛋白质结构论文; 水稻稻瘟病论文; 水稻品种论文; 基因合成论文; 同源重组论文; 蛋白质合成论文; 同源基因论文; 基因工程论文;