基于FnBPA和CD11c单链抗体的侵入型乳酸菌构建及其分子免疫机制研究

论文摘要

猪流感（Swine influenza,SI）是由猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病,其特征为突发咳嗽、呼吸困难、发热及迅速转归。SIV是一种球状结构的单股负链RNA分节段的病毒。其中血凝素（Hemagglutinin,HA）是SIV重要的膜蛋白,可以刺激机体产生中和抗体。目前,流感疫苗主要有灭活疫苗、减毒疫苗、基因工程活疫苗等,以乳酸菌作为粘膜疫苗递送载体也有研究,但递送抗原效率有待加强。本研究以植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum,L.plantarum）NC8株作为宿主菌,构建两种侵入型L.plantarum表达载体:一种是表达金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的侵袭素,即纤连蛋白结合蛋白A（Fibronectin binding protein A,FnBPA）;另一种是表达针对CD11c的单链抗体（single-chain variable fragment against CD11c,scFv-CD11c,简称aCD11c）。使用两种新型侵入型乳酸菌递送载体,以SIV的HA作为保护性抗原,探索其分子免疫机制。首先,我们构建了一株表面展示FnBPA的侵入型L.plantarum NC8-pSIP409-FnBPA。使用该菌株感染猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）后,发现其对细胞的粘附与侵袭率分别为1.41%和0.15%,大约是空载体组的2倍和5倍。同时,将上述菌株与小鼠骨髓源树突状细胞（Bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs）共培养,使用流式细胞术（Flow cytometry,FCM）检测菌株对BMDCs活化并以荧光定量PCR检测相应mRNA的表达情况。结果表明菌株NC8-pSIP409-FnBPA显著增强了BMDCs表面CD40和CD80表达水平（P<0.001）,同时基因IL-6和MyD88 mRNA的表达水平也显著提高（P<0.001）。同样,使用上述菌株免疫BALB/c小鼠,评价其免疫调节特性。结果显示NC8-pSIP409-FnBPA显著刺激派尔氏淋巴集结（Payer’s patches,PPs）中DCs的活化（P<0.001）以及提高脾脏CD4+T细胞中IL-4+（1.72%,P=0.0037）和IL-17A+（2.07%,P=0.0079）细胞百分比;ELISA结果表明血清中IL-4（P=0.0012）和IL-17A（P<0.001）的含量也显著增加。同时与空载体相比,NC8-pSIP409-FnBPA显著增加了小鼠肠系膜淋巴结（Mesenteric lymph nodes,MLN）（P<0.001）和PP结（P<0.001）中B220+B细胞数量并提高了FnBPA特异性IgG（1.72倍）和分泌型IgA（sIgA）（2.41倍）抗体滴度。其次,我们又构建一株表面展示表达aCD11c的靶向DCs的L.plantarum（NC8-pSIP409-aCD11c）。使用该菌株刺激BMDCs,发现该菌株对BMDCs的粘附与侵袭率分别为36.17%和2.23%,为空载体组的1.56倍和2.42倍。进而将携带真核质粒pValac-GFP的NC8-pSIP409-aCD11c菌株与BMDCs共培养36h后,使用FCM检测BMDCs中GFP表达以确定菌株对pValac-GFP的递送效率,结果表明:该菌株能显著增强BMDCs中GFP表达（P=0.0110）。将上述携带pValac-GFP的菌株口服免疫小鼠,免疫后PP结和MLN中GFP的表达在不同时间点均有所升高。此外,NC8-pSIP409-aCD11c菌株也能有效促进MLN中DCs的分化、成熟以及增加CD4+T细胞中IL-4+和IL-17A+细胞的百分比,同时提高PP结中B220+IgA+B细胞的含量。再次,我们使用上述两种侵入型载体表达了SIV的HA抗原,构建了三株乳酸菌分别为NC8-pSIP409-pgsA’-HA（HA）、NC8-pSIP409-FnBPA-pgsA’-HA（FnBPA-HA）和NC8-pSIP409-aCD11c-pgsA’-HA（aCD11c-HA）。将上述菌株免疫BALB/c小鼠,结果发现,与空载体组相比,HA组、FnBPA-HA组和aCD11c-HA组均能促进脾脏中DCs的活化和成熟,脾脏和MLN CD8+T细胞中IFN-γ+和穿孔素的表达以及PP结中B220+IgA+B细胞的产生;同时ELISA结果表明:与空载体组相比,表达HA的三株菌株免疫后均能显著提高小鼠血清中特异性IgG（2.28倍）及粪便（2.37倍）和气管冲洗液中sIgA（2.39倍）的抗体滴度,且均能产生中和抗体;将BALB/c小鼠感染10×LD50的流感病毒A/PuertoRico/8/1934（H1N1）,在感染后第7天,与HA组和FnBPA-HA组相比,aCD11c-HA组显著提高MLN中CD8+T细胞中IFN-γ+（P<0.001）和穿孔素（P<0.001）的表达,具有一定的抗病毒作用;FnBPA-HA组和aCD11c-HA组对IV的保护率为60%,HA组为40%。最后,探讨了aCD11c-HA乳酸菌在抗H1N1亚型IV中的分子免疫机制。以aCD11c-HA乳酸菌刺激BMDCs 12 h后,使用FCM检测菌株对BMDCs分化的影响,结果表明aCD11c-HA菌株显著促进BMDCs的活化。ELISA检测上述细胞上清中细胞因子的表达,发现aCD11c-HA菌株促进IL-12P70、抑制IL-6的分泌;分选未免疫小鼠脾脏的CD4+和CD8+T细胞,与上述激活的BMDCs共培养48 h后,使用FCM和ELISA分别检测细胞内IFN-γ+和穿孔素的表达及细胞分泌上清中IFN-γ的含量,发现aCD11c-HA菌株增强了分选CD4+T细胞中IFN-γ+（4.33%）以及CD8+T细胞中IFN-γ+（7.68%）和穿孔素（17.50%）的表达,同时促进细胞因子IFN-γ的分泌。与上一致,体内检测了脾脏和MLN中HA特异性CD8+T细胞中IFN-γ+（P<0.001）和穿孔素（P<0.001）的表达,aCD11c-HA组显著升高;并且aCD11c-HA组能显著促进脾脏T细胞的增殖（P<0.001）。使用磁珠分选免疫后各组小鼠的脾脏CD8+T细胞尾静脉回输NOD/Lt-SCID小鼠,24 h后感染5×LD50的IV,结果显示aCD11c-HA组的CD8+T细胞与HA组相比能延长NOD/Lt-SCID小鼠寿命2天,具有一定的保护作用。本研究构建了基于FnBPA蛋白及scFv-CD11c的两种侵入型植物乳杆菌,分别共表达了SIV的HA蛋白,与单表达HA的菌株相比,上述菌株免疫BALB/c小鼠后能显著增加对IV的攻毒保护率,尤其以scFv-CD11c共表达组在增强机体免疫反应方面更佳。进而通过FCM、流式分选、过继回输NOD/Lt-SCID小鼠等手段证实了aCD11c-HA菌株可增强病毒特异性CD8+IFN-γ+T细胞及穿孔素表达,初步揭示了靶向DCs的侵入型乳酸菌载体疫苗引起机体免疫反应的分子机制,为开发新型乳酸菌载体疫苗奠定了基础。

论文目录

文章来源

类型: 博士论文

作者: 刘晶

导师: 王春凤,姜延龙

关键词: 植物乳杆菌,猪流感,侵袭,纤连蛋白结合蛋白,树突状细胞

来源: 吉林农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 吉林农业大学

基金: 国家重点研发计划项目(2017YFD0501000,2017YFD0500400),国家自然科学基金项目(31672528,31602092),吉林省教育厅科学技术研究项目(JJKH20170316KJ),吉林省科技发展计划项目(20160519011JH,20170204034NY,20180201040NY)

分类号: S852.4

DOI: 10.27163/d.cnki.gjlnu.2019.000001

总页数: 140

文件大小: 9424K

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