谭晓红[1]2004年在《成骨细胞特异性Smad4基因剔除导致小鼠早期发生骨质疏松》文中进行了进一步梳理转化生长因子-β(TGF-β)超家族分子通过调节细胞的增殖、分化、移行和凋亡而在脊椎动物发育过程中起重要的作用。大量的TGF-β贮于骨基质之中，是骨骼发育和骨重建的重要调节者。Smad4是TGF-β信号的中心介导者，在胚胎期和成体的许多组织中广泛表达。完全剔除Smad4基因导致小鼠胚胎发育早期死亡，其在成骨细胞中的作用尚无明确报导。为了深入研究Smad4基因在成骨细胞增殖和分化过程中的作用，我们利用Cre-loxP系统构建了成骨细胞特异性Smad4基因剔除小鼠。成骨细胞特异性．Smad4基因剔除的纯合型小鼠出生时表型正常，从2周起生长比对照小鼠延迟，体型矮小，牙齿短小，钙化不良，在3周以后表现更加明显。青春期和成年纯合型小鼠的骨密度显着降低，特征为骨小梁减少，顶骨菲薄。16日龄小鼠可见破骨细胞数量减少，并随着小鼠的生长日趋明显。3周龄小鼠的生长板比对照小鼠缩窄，体内荧光标记提示骨形成减弱。体外细胞培养提示纯合型小鼠成骨细胞的分化并未受到明显的影响。分别用TGF-β1和BMP2处理成骨细胞，发现在成骨细胞中剔除Smad4基因阻断了这两条信号通路。原位杂交的结果显示纯合型小鼠骨组织中Runx2／Cbfa1和多种细胞外基质基因的表达下调，提示在成骨细胞中剔除Smad4基因影响了细胞外基质的沉积，导致骨形成下降，成骨细胞明显减少。另一方面，在成骨细胞中剔除Smad4基因也影响了破骨细胞的形成和分化，表现为破骨细胞数量减少，从而使骨吸收减弱。我们的实验结果证实在成骨细胞中剔除Smad4基因同时影响了骨形成和骨吸收，使小鼠在早期出现了骨质疏松的表型，揭示了Smad4基因在维持成骨细胞正常功能和骨量中具有重要作用。成骨细胞特异性Smad4基因剔除骨质疏松小鼠模型可用于深入研究Smad4介导的FGF-β信号通路在维持正常成骨细胞功能以及骨质疏松发生中的作用及其分子机制，并可用于骨质疏松治疗药物的筛选和治疗方案的评价。
张军芳[2]2009年在《异补骨脂素结合锌对大鼠成骨细胞生物活性影响的实验研究》文中认为目的:骨质疏松症是一种多病因的增龄性病变,随着老龄化社会的到来越来越受到人们的重视。它的基本病理机制是骨代谢过程中破骨细胞(osteoclast,OC)骨吸收增加与成骨细胞(osteoblast,OB)骨形成减少,导致人体内的钙磷代谢不平衡,骨密度(Bone mineral density,BMD)逐渐减小而引起的。病因主要与年龄、内分泌紊乱、钙吸收不良以及免疫、营养等因素有关。雌激素替代疗法(estrogen replacement therapy,ERT)可以抑制骨质丢失,是目前临床防治绝经后妇女骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)的首选疗法。但长期使用可能增加子宫内膜癌及乳腺癌的发病几率。目前人们将寻找雌激素替代药物的目光放在了植物雌激素上。实验发现用含有一定浓度补骨脂注射液的DMEM培养成骨细胞有显着的促增殖作用,能影响骨的合成代谢,具有防治骨质疏松的作用。异补骨脂素是从补骨脂中提取的香豆素类化合物,属于植物雌激素的一种。本课题组前期研究的结果显示异补骨脂素对于促进大鼠成骨细胞增殖和提高碱性磷酸酶活性有较好的作用。锌,是维持机体正常生理功能和机体内环境正常生化代谢所必需的微量元素,也是骨代谢中的重要微量元素之一,可以有效刺激成骨细胞的骨形成和抑制破骨细胞的骨吸收作用。有研究显示微量元素锌可维持细胞周期的正常进行,促进细胞增殖分化;其对成骨细胞增殖及分化的原理可能是锌通过氨酰基转移核糖核酸合成酶刺激体外成骨细胞的蛋白质合成,从而促进体外培养大鼠成骨细胞的增殖与分化。大量研究报道某些药物因素和营养因子可以防治骨质流失,目前我们对于有效化合物联合应用的了解还比较少。那么植物雌激素与营养因子结合是否对骨质疏松症有增效或协同作用呢?这在预防增龄性骨质流失可能有重要意义。目前已有研究证实大豆异黄酮加钙对绝经后大鼠的骨流失有预防作用,联合应用金雀异黄素和锌对大鼠股骨组织的骨成分有协同增效作用。异补骨脂素和锌结合对骨代谢有加强和/或协同效应的这种细胞机制尚未见报道,本研究即着眼于测定异补骨脂素与营养因子锌联合应用对成骨细胞的增殖与分化是否有协同增效的作用。实验采用体外培养成骨细胞的方法,观察异补骨脂素和锌对成骨细胞增殖与分化的影响。采用RT-PCR的技术,检测了异补骨脂素和锌对成骨细胞分泌的蛋白COLI mRNA,Smad4 mRNA,Runx2 mRNA,Osterix mRNA表达的影响。从细胞和分子水平来探讨异补骨脂素及其与锌配伍的补肾中药防治骨质疏松的机制,以期为提高骨质疏松症的临床疗效以及抗骨质疏松新药的开发提供实验依据。方法:1采用改良的组织块法分离培养新生(24 h内)SD大鼠颅骨成骨细胞。将不同浓度的异补骨脂素(10-8 mol/L~10-9 mol/L)与锌(10-4 mol/L~10-5 mol/L)加入到培养成骨细胞的培养基中,用倒置显微镜观察细胞形态和数量的改变。2采用噻唑蓝比色(MTT)法,以雌激素(estrogen, E2)为阳性对照,检测加药后,异补骨脂素和锌及其配伍组24 h,48 h,72 h对大鼠成骨细胞增殖的影响。3采用对硝基苯二钠基质动力学法(pNPP)法,以雌激素为阳性对照,检测了异补骨脂素和锌及其配伍组在24 h,48 h和72 h ,96 h对大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响。4采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR,reverse transcriptase PCR)方法,以雌激素为阳性对照,检测含有异补骨脂素和锌培养基的大鼠成骨细胞在48 h时I型胶原(COL I) mRNA,Smad4 mRNA,Osterix mRNA,Runx2/Cbfa1 mRNA的基因表达。结果:1阳性对照雌激素对成骨细胞增殖与分化的影响1.1阳性对照雌激素组细胞形态学观察刚接种的成骨细胞成球形,悬浮于培养液中,逐渐沉降贴壁,24 h细胞贴壁展开。展开细胞形态不规则,呈多角形,培养72 h～96 h,细胞为长梭形、条索状,融合成片,分界较为模糊。培养96 h～120 h,细胞呈铺路石状态。如果再继续培养,细胞逐渐聚集形成细胞小结,随后胶原堆积,钙盐沉积,形成不透光的矿化结节。连续培养20代,可见细胞体积增大,胞质稀薄,细胞分裂速度下降等一系列细胞衰老的表现。雌激素组与空白对照组相比,在72 h～96 h时,细胞更加密集,细胞间隙少,形态无明显差异。1.2阳性对照雌激素组对大鼠成骨细胞增殖的影响大鼠成骨细胞在含有不同浓度雌激素培养基中培养24 h,在雌激素浓度为(10~(-5) mol/L,10~(-7) mol/L和10~(-8) mol /L)时有促大鼠成骨细胞增殖作用(P<0.05);培养48 h,在雌激素浓度为(10~(-6) mol/L, 10~(-8) mol/L和10~(-9)) mol/L)有促大鼠成骨细胞增殖作用(P<0.05);72 h,在雌激素浓度为(10~(-5) mol/L~10~(-7) mol/L)与空白对照组相比有显着的促进大鼠成骨细胞增殖的作用(P<0.05)。1.3阳性对照雌激素组对大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响培养48 h ,与空白对照组比较,雌激素组浓度为(10~(-5)mol/L~1×10~(-6) mol/L)有明显的促进碱性磷酸酶活性的作用(P<0.05);培养72 h,雌激素浓度为(10~(-6) mol/L ~ 1×10~(-9)) mol/L)有促进碱性磷酸酶活性的作用(P <0.05)。2异补骨脂素、锌及其配伍组对成骨细胞增殖与分化及分泌的蛋白I型胶原(COL I) mRNA和TGF-β)1细胞信号转导因子Smad4 mRNA,核心结合因子1(Cbfa1) mRNA / Runx2 mRNA以及Osterix mRNA表达的影响。2.1异补骨脂素组、锌组、异补骨脂素加锌配伍组细胞形态学观察与雌激素组类似。2.2异补骨脂素和锌各配伍组对大鼠成骨细胞增殖的影响大鼠成骨细胞分别在含异补骨脂素、硫酸锌以及异补骨脂素加硫酸锌培养基中培养24 h,异补骨脂素(10~(-8) mol/L～10~(-9) mol/L)、异补骨脂素(10~(-9) mol/L)加硫酸锌(10~(-5) mol/L)有促增殖作用;异补骨脂素(10~(-9) mol/L)加硫酸锌(10~(-5) mol/L)与单纯异补骨脂素组或锌组相比增殖作用明显。培养48 h,异补骨脂素10~(-8) mol/L、异补骨脂素(10~(-8) mol/L)加硫酸锌(10~(-4) mol/L)、异补骨脂素(10~(-9) mol/L)加硫酸锌(10~(-5) mol/L)与空白组比较有促增殖作用,其中异补骨脂素(10~(-8) mol/L)、异补骨脂素(10~(-9) mol/L)加硫酸锌(10~(-5)) mol/L)组的增殖作用更为显着。2.3异补骨脂素和锌各配伍组对大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响大鼠成骨细胞在含异补骨脂素、硫酸锌以及异补骨脂素加硫酸锌培养基中培养48 h,异补骨脂(10~(-9) mol/L)、硫酸锌(10~(-4) mol/L)、异补骨脂素(10~(-9) mol/L)加硫酸锌(10~(-5) mol/L)与空白组比较提高成骨细胞碱性磷酸酶的活性,其中异补骨脂素(10~(-9) mol/L)加硫酸锌(10~(-5) mol/L)的促分化作用更明显。培养72 h异补骨脂素(10~(-8)和10~(-5) mol/L)、异补骨脂素(10~(-8) mol/L)加硫酸锌(10~(-4) mol/L)、异补骨脂素(10~(-9) mol/L)加硫酸锌(10~(-5) mol/L)组有促进碱性磷酸酶活性的作用,异补骨脂素(10~(-9) mol/L)加硫酸锌(10~(-5) mol/L)对碱性磷酸酶活性的影响更加显着。2.4异补骨脂素加锌对大鼠成骨细胞分泌的I型胶原(COL I) mRNA表达的影响与空白对照组相比,能显着促进COL I mRNA的表达(P<0.01);与雌激素组相比也有统计学意义,能明显提高COL I mRNA的相对表达量(P<0.01)。2.5异补骨脂素加锌对大鼠成骨细胞分泌的Smad4 mRNA表达的影响异补骨脂素、异补骨脂素加锌和空白组相比明显促进转化生长因子的信号转导因子Smad4 mRNA的表达(P<0.01)。2.6异补骨脂素加锌对大鼠成骨细胞分泌的Runx2/Cbfa1 mRNA表达的影响异补骨脂素加锌组能明显促进Runx2/Cbfa1 mRNA的表达(P<0.05);其表达量高于单纯使用异补骨脂素组。2.7异补骨脂素加锌对大鼠成骨细胞分泌的Osterix mRNA表达的影响异补骨脂素组,异补骨脂素加锌组均能增强Osterix mRNA的表达(分别为P<0.05,P<0.01),异补骨脂素加锌组表达量高于雌激素组和异补骨脂素组。结论:1一定浓度配伍的异补骨脂素加锌可以促进成骨细胞的增殖与分化。异补骨脂素、及其与锌的配伍组促进成骨细胞分泌蛋白I型胶原(COL I) mRNA的表达,上调Smad4 mRNA的表达,并且能够上调Runx2/Cbfa1mRNA和Osterix mRNA的表达,说明异补骨脂素及其配伍组可能通过促进骨形成途径来防治骨质疏松。2植物雌激素异补骨脂素很可能是补肾中药补骨脂发挥补肾壮骨作用的物质基础之一。3说明异补骨脂素加锌有可能是通过促进细胞分泌I型胶原(COL I),Smad4,Runx2/Cbfa1和Osterix蛋白来发挥其促进骨形成作用。4研究异补骨脂素和锌配伍对骨质疏松的防治作用为抗骨松的药物开发和临床用药提供了实验依据。
李正[3]2012年在《BMP-7在雷奈酸锶促进骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用》文中指出[研究背景和目的]骨质疏松(Osteoporosis)主要是由于骨吸收与骨形成之间的平衡被打破,骨吸收量大于骨形成量,从而引起骨量减少的一种疾病。一般认为,破骨细胞活性增强,导致骨吸收增加,是形成骨质疏松的重要原因。骨髓间充质干细胞(Bone marrow stromal stem cells, BMSCs)在特定的诱导条件下,可以向不同的细胞方向分化,包括成骨细胞、神经细胞、心肌细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。鉴于BMSCs具有定向成骨分化的潜能,骨髓间充质干细胞也成为人工骨材料的主要来源之一。BMSCs的研究也逐渐引起人们的关注。BMSCs成骨转化过程中有多种成骨标志物,其中碱性磷酸酶(ALP)活性的提高是成骨分化的重要标志之一,另外ALP也参与成骨细胞的结节钙化。骨形态蛋白(Bone morphogenetic protein, BMP)是多功能生长因子,属于转化生长因子-p(TGF-β)超家族,是一组具有类似结构的保守的功能蛋白组成,能够在体内诱导骨和软骨形成,并在肢体生长、软骨内骨化、骨折早期软骨修复及骨骼的胚胎发育和再生修复等方面起重要作用。已知的已经被克隆出的BMPcDNA有17种,目前的研究表明能有效地促进BMSCs向成骨细胞分化,诱导骨的形成的BMP主要是BMP2/3/4/5/7。BMP-7是骨形态发生蛋白家族中的一员,主要在骨组织和肾组织中表达,特别在骨发育和骨折愈合过程中高表达。研究发现BMP-7在自体骨表面可以生成关节软骨面,还可以在某些特定的环境下修复软骨、肌腱和韧带。国内外研究表明给予外源性BMP-7可促进BMSCs向成骨转化。国外研究表明应用BMP-7治疗骨损伤的治愈率明显高于对照组。因此BMP-7作为促进骨形成的重要骨形成蛋白因子,引起越来越多人的关注。Osterix(OSX)是最新由Nakashima等人发现的一种含锌指结构的转录因子,属于Sp/XKLF家族,它是一个由428个氨基酸组成的蛋白质,研究表明OSX蛋白分布于细胞核中,其作用与组织的分化成熟密切相关。在OSX基因剔除的小鼠胚胎中,膜性骨骼的致密间充质和软骨内骨骼的骨膜及间充质中,成骨细胞分化的各种标志物的表达水平严重降低或者缺如,可见成骨细胞的分化被完全阻断。OSX基因剔除细胞可表达软骨细胞的特征性标志物,因此OSX可能具有抑制骨／软骨祖细胞向软骨细胞分化的功能。雷奈酸锶(Strontium ranelate, Sr)是新型的抗骨质疏松药物,具有促进骨形成,抑制骨吸收的作用,它能保护去卵巢大鼠的骨流失,并且可促进成骨细胞ALP活性的表达。给予Sr治疗能明显促进成骨细胞转录因子水平的增高。此外越来越多的研究者关注分子水平上Sr促进骨形成的机制。本实验通过观察BMSCs成骨细胞转化过程中ALP、BMP-7、钙结节、OSX基因表达,探讨Sr促进骨形成的作用。通过添加BMP-7阻断剂noggin观察Sr促进骨形成过程中ALP、BMP-7、钙结节、OSX基因表达的变化,探讨Sr促进BMSCs向成骨细胞转化过程BMP-7所起作用,为临床上应用Sr防治骨质疏松等疾病提供新颖的实验依据。[实验方法]1、SD大鼠骨髓间充质干细胞培养本实验拟采用步骤相对简单的全骨髓贴壁法将BMSCs从骨髓中分离出来,并在体外进行培养和扩增,倒置显微镜下观察其增殖和生长特性。以此建立一套稳定有效、重复性好的BMSCs体外分离、培养和扩增的方法。并取生长良好的第3-4代BMSCs用做实验。2、分别用细胞碱性磷酸酶标法、茜素红染色法、免疫印迹法(Westernblotting)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测不同浓度Sr作用下ALP活性的表达、钙结节的表达、BMP-7的表达水平及特异转录因子OSX基因的表达情况；相同浓度Sr作用不同时间作用下BMP-7及OSX基因的表达情况。3、加入BMP-7阻断剂noggin预处理BMSCs2小时后再加入Sr处理培养细胞并用碱性磷酸酶标法、茜素红染色法、Western blotting方法、RT-PCR方法检测对照组及各实验组的ALP活性、钙结节的表达、BMP-7及OSX基因的表达情况。4、统计学方法：计量资料数据以均数x±S表示,应用SPSS17.0统计软件进行统计学分析,结果可采用两独立样本T检验和单因素方差分析(One-way ANOVA)方法,方差齐性用LSD法进行组间多重比较,方差不齐时用Dunnet-t检验。P<0.05被定为有统计学差异。[实验结果]1.细胞学形态观察细胞接种后随即在倒置显微镜下观察,培养液中存在着很多大小不等的圆形细胞,其中造血细胞为主要成分。原代BMSCs接种24小时,仅见少量贴壁细胞,近似圆形或短梭形,48小时贴壁细胞逐渐增多,细胞渐变长。3天后更换培养液,除去绝大部分悬浮细胞,可见分散的BMSCs小集落,集落细胞呈放射状生长。随培养时间延长细胞集落增大,细胞形态为长梭形,9-10天细胞集落彼此融合,呈旋涡状生长。2.不同浓度Sr对BMSCs成骨分化过程中ALP活性的影响BMSC分别给予Sr浓度为0.1、1、3、5和7mmol/L,诱导分化细胞连续培养7天后检测ALP活性,发现ALP活性增强,其中在0.1-3mmol/L浓度范围内,Sr呈浓度依赖性地增加ALP活性。浓度为3mmol/L是ALP活性表达最高。3.Sr促进BMSCs向成骨细胞转化过程中钙结节表达实验组BMSCs加入浓度为3mmol/L Sr,对照组BMSCs不加Sr,共同培养21d后,行茜素红染色。结果显示,实验组钙结节表达高于对照组,表明Sr明显促进BMSCs向成骨细胞转化。4.Sr对BMP-7表达的影响0.1-5mmol/L Sr在促进BMSCs向成骨细胞转化过程中可上调BMP-7的表达,在0.1-3mmol/L浓度范围并呈浓度依赖性地促进BMP-7的表达,其中浓度为3mmol/L时BMP-7表达最多,浓度为5mmol/L时促进作用下降,但与对照组相比,差异仍具有统计学意义(P<0.001)。相同浓度Sr作用下,在1-7天范围内可呈现时间依赖性地促进BMP-7的表达。与对照组相比,作用第7天时,BMP-7表达最多,差异有统计学意义(P<0.001)。Sr作用10天与第7天相比BMP-7表达虽减少,但与对照组相比,差异仍有统计学意义(P<0.001)。5.Sr对OSX表达的影响Sr浓度在3mmol/L以内可上调OSX基因的表达,其中浓度为1mmol/L时OSX表达最多,当Sr浓度为5mmol/L时,对OSX基因的表达成抑制作用,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.001)。1mmol/L Sr处理BMSCs不同时间(30分钟-14天)后呈现时间依赖性地促进OSX基因的表达。与对照组相比,其中Sr处理7天时,OSX基因表达最多,差异有统计学意义(P<0.001),Sr作用14天与第7天相比OSX基因表达虽有减少,但与对照组相比,差异仍有统计学意义(P<0.001)。6.BMP-7阻断剂noggin对抗Sr诱导的BMSCs成骨分化过程中BMP-7表达浓度为3mmol/L Sr作用BMSCs7天可促进BMP-7表达,差异具有统计学意义(P<0.001),在Sr处理BMSCs2小时前,应用100ng/mlnoggin预处理细胞可使BMP-7表达减少,与Sr组相比差异有统计学意义(P<0.001)。7.BMP-7阻断剂noggin对抗Sr诱导的BMSCs成骨分化过程中ALP活性表达与对照组相比Sr组ALP活性增高,差异具有统计学意义(P<0.001)；在Sr处理BMSCs前2小时,应用100ng/mlnoggin处理细胞可使ALP活性较Sr组减少,差异有统计学意义(P<0.001)；noggin及PBS本身与对照组相比ALP活性无影响,差异无统计学意义(P>0.05)。8.BMP-7阻断剂noggin对抗Sr诱导的BMSCs成骨分化过程中钙结节表达与对照组相比Sr(3mmol/L处理21天)组钙结节表达增多,在Sr处理BMSCs前2小时,应用100ng/mlnoggin可使钙结节较Sr组减少,noggin及PBS本身对钙结节表达无明显作用。9.BMP-7阻断剂noggin对抗Sr诱导的BMSCs成骨分化过程中OSX基因表达1mmol/L Sr作用BMSCs7天明显地促进OSX基因表达,差异具有统计学意义(P<0.001),在Sr处理BMSCs2小时前,应用100ng/m1noggin预处理细胞可使OSX基因表达减少,与Sr组相比差异有统计学意义(P<0.001)。[结论]本实验证实在BMSCs向成骨转化过程中,Sr能促进各成骨标志物的表达如：ALP活性、钙结节、成骨基因(OSX)等,进一步证实雷奈酸锶可促进BMSCs向成骨细胞转化。Sr促进BMSCs向成骨细胞转化能浓度及时间依赖性地使BMP-7蛋白及OSX基因表达明显增加。为探讨Sr在促进BMSCs向成骨细胞分化过程中与BMP-7表达的关系。本实验在Sr作用BMSCs前加用BMP-7阻断剂noggin,实验结果表明,noggin可明显地阻断Sr对BMP-7表达的上调作用,并使ALP活性、钙结节形成减少,BMP-7及OSX基因的表达降低,因此我们推断Sr促进BMSCs向成骨转化可通过BMP通路,并与BMP-7的表达有相关性。
王建华, 张军芳, 吕萍, 王雅楠[4]2010年在《异补骨脂素加锌对大鼠成骨细胞相关细胞因子表达影响的实验研究》文中研究表明为探讨异补骨脂素加锌对体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞相关基因表达的影响,用改良的组织块培养法分离培养新生大鼠颅骨成骨细胞,在成骨细胞体系中加入异补骨脂素与锌,以雌激素为阳性对照,空白组为阴性对照。结果显示:异补骨脂素加锌较单纯应用异补骨脂素或硫酸锌在48 h时促体外大鼠成骨细胞Ⅰ型胶原的表达;异补骨脂素加锌组可以明显上调大鼠成骨细胞TGF-β1的细胞信号转导因子Smad4 mRNA的表达(P<0.01);能促进Runx2/Cbfa1 mRNA的表达(P<0.05)。与空白对照组相比,异补骨脂素组,异补骨脂素加锌组均能增强Osterix mRNA的表达(P<0.05)。与单纯应用异补骨脂素或者锌相比,异补骨脂素与锌联合应用能够协同增效,对促进体外培养的成骨细胞相关转录因子的表达更加明显,探讨了异补骨脂素及其与锌配伍调节骨代谢的分子机制,为提高骨质疏松症的临床疗效以及抗骨质疏松新药的开发提供了实验依据。
钱康琦[5]2014年在《葛根素对小鼠成骨细胞TGF-β/Smad基因蛋白表达影响的研究》文中研究指明目的：探究葛根素干预液对小鼠胎鼠成骨细胞TGF-β1及Smad2/3基因表达的影响,从细胞学层面和分子生物学层面研究葛根素治疗骨质疏松症的机理,为葛根素治疗骨质疏松症提供理论依据及实验依据。方法：取小鼠胎鼠成骨细胞体外培养并进行传代。分别用lug/ml,0. lug/ml,0. Olug/ml浓度的葛根素干预组及空白DMEM对照组作用于成骨细胞,在成骨细胞生长成熟后,运用碱性磷酸酶法(AKP法)及四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测各组干预后成骨细胞的活性。检测出最适宜的干预时间作用细胞活性最高的组别后,提取出成骨细胞内mRNA,通过实时荧光定量PCR法及WesternBloting法检测葛根素干预液对成骨细胞内信号转导通路TGF-β1以及Smad2/3基因表达的影响。结果：细胞AKP实验和MTT实验结果显示出葛根素干预液能够促进成骨细胞生长,并且该活性的促进与浓度及时间相依赖性。实时定量荧光PCR及WesternBloting结果均显示不同浓度的葛根素干预液能明显促进成骨细胞生长转化因子TGF-β1基因表达,而且在促进Smad2及Smad3的表达时与TGF-β1相平行,与干预液的浓度相依赖。结论：葛根素可以促进成骨细胞的增值及TGF-β1的表达,其下游信号Smad2/3的表达也得到促进。Smad2/3的信号表达与TGF-β1的表达相一致。说明葛根素能够通过TGF-β1及Smad2/3系统促进成骨细胞的生长,促进骨量增殖,进而治疗骨质疏松。
郭常军[6]2010年在《成骨生长肽对OPG基因剔除小鼠骨质疏松治疗作用的分子机制》文中提出目的：骨质疏松症是骨科常见疾病之一,随着我国进入老龄化,骨质疏松性骨折的发生率逐年上升,是老年人致残的主要因素。既往在研究骨质疏松症的动物模型中,骨保护素(osteoprotegerin,OPG)基因剔除小鼠模型符合高转换型骨质疏松症表现。成骨生长肽(osteogenic growth peptide,OGP)是一种在体外具有促进成骨细胞或间质细胞增殖、分化、成熟的作用,在体内也能促进全身骨量增加的多肽。本研究通过体外培养OPG基因敲除小鼠(OPG-/-)骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs),并与骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)对照,探讨OGP对体外培养的OPG-/-小鼠BMSCs的增殖和分化作用,分析OGP对其作用的分子机制,为OGP治疗骨质疏松症提供理论依据。方法：1. BMSCs分离培养：取12 w龄雄性OPG-/-小鼠,采用贴壁法培养BMSCs,给予10%FBS的LG-DMEM(Low Glucose-Dulbecco modified eagle medium)和矿化液(10-8mol/L地塞米松+10-2mol/Lβ-甘油磷酸钠+50 ug/ml L-抗坏血酸)的培养条件,进行BMSCs形态特征和生长特性观察。2.细胞增殖率观察和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)含量测定：取第一代骨髓间充质干细胞(passage first,P1)分为OGP组、对照组和BMP-2组,各组分别取1 d、3 d、5 d、7 d四个时间点。在各个时间段,分别在所需检测的培养孔内,按照二甲基噻唑二苯基四唑溴盐法(methyl thiazolyl tetrazolium method, MTT)和磷酸对硝基苯法(ρ-nitrophenylphosphate, PNPP)分别测定细胞增殖率和碱性磷酸酶含量,与BMP-2对比,比较OGP对OPG-/-小鼠的BMSCs增殖率和ALP含量的变化。3.定量Real-Time PCR:按以上条件培养P1 BMSCs 3 d后,分为叁组,提取RNA,定量分析细胞周期指标Cyclin A和CDK2、分化指标Runx2和Osterix的基因水平表达,比较叁组在mRNA水平的变化。4. Western-blot分析：按以上条件培养P1 BMSCs 7 d后,分为叁组,观察BMSCs增殖和向成骨细胞分化的相关蛋白水平的表达,与BMP-2比较,分析OGP对其作用的可能机制。结果：1.OPG-/-小鼠的BMSCs形态特征和生长特性方面：在传第叁代的情况下,细胞生长速度很慢,很难融合,故我们选择P1代细胞进行实验。但在BMSCs形态上,显微镜下观察未见明显差异。2.在含10%FBS的LG-DMEM和矿化液的培养的第3 d、5 d、7 d, OGP对OPG-/-BMSCs增殖作用均高于空白对照组和BMP-2组(P 逄键梁[7]2006年在《人牙本质基质蛋白1基因转录调控机制的研究》文中研究表明牙本质形成和矿化是牙齿发育和牙齿损伤修复过程中的重要组成部分。近年来，牙本质非胶原蛋白(Non-collagenous proteins，NCPs)在成牙本质细胞诱导分化和牙本质形成中作用的研究已成为牙齿发育生物学和牙髓生物学研究的热点。到目前为止，大多数的研究集中于牙本质特异性蛋白，而关于矿化组织特异性蛋白在牙胚发育中作用的研究较少。牙本质基质蛋白1(Dentin matrix protein 1，DMP1)是一种重要的矿化组织特异性蛋白，在成牙本质细胞诱导、分化和牙本质形成中的作用越来越受到关注。但是DMP1在牙本质形成和牙髓损伤修复中的功能和调控的分子机制报道甚少。成牙本质细胞是如何形成DMP1?在形成时受哪些因子调控?它们间存在什么样的相互作用?其作用机制又是如何?这些问题亟待解决。 DMP1是一种主要表达于牙本质和骨等矿化组织的基质蛋白，是一种新的富含丝氨酸的酸性磷酸化蛋白，组成中有1／3为门冬氨酸和谷氨酸，等电点为3.68。在不同的物种中，DMP1的基因结构相似，具有高度同源性，并有一些高度保守区。现有的研究表明：DMP1在体内发挥多重功能，既作为矿化调节蛋白，又作为一信号分子；过表达DMP1的细胞能够诱导分化和促进矿化结节的形成；能够结合钙离子和胶原组织，在矿化过程中发挥启动矿化的作用。DMP1基因敲除小鼠已经建立，并且表现出牙髓腔增大，前期牙本质带增宽，牙本质层变窄和矿化不全等症状。鉴于DMP1在牙本质矿化中的重要作用，研究其在牙本质形成中的具体作用机制，明确DMP1基因表达的调控方式，对深入了解牙胚发育和牙髓损伤修复机 黄猛[8]2014年在《健康老年人群Scr、ALT和PG参考区间的建立及其参考改变值的研究》文中研究表明第一部分健康老年人群与健康成年人群生物学参数差异的研究目的探讨健康老年人群与成年人群的生物学特征的差异,为老年人群临床常规检验项目参考区间的建立提供理论依据。方法测定948名(其中男487名,女461名)18～59岁健康成年人和743名(其中男369名,女374名)汉族60～89岁健康老年人BMD. SBP、DBP、ALB、Hb、ALT、ALP的水平,并比较两个人群这些生物学特征的差异。结果不同性别及年龄组(60～69,70～79,80-89岁叁个年龄组)健康老年人BMD、SBP、DBP、ALB、Hb、ALT、ALP的水平；与成年人相比,健康老年人BMD、SBP、DBP、ALB、Hb、ALT、ALP的水平都存在着显着的差异,p<0.05。结论本研究中老年人群与成年人群生物化学特征存在着显着的差异,临床实验室要针对成年人和老年人的差异,建立不同的临床检验项目参考区间。第二部分健康老年人群Scr、ALT和PGⅠ、PGⅡ及PGⅠ/Ⅱ参考区间建立目的建立健康老年人群Scr、ALT、PG Ⅰ、PG Ⅱ及PG Ⅰ/Ⅱ的参考区间。方法按照CLSI文件C28-A3《医学实验室参考区间的定义、建立和确认》中参考区间研究模式及参考人群筛选标准的要求,测定健康老年人Scr、ALT、PG Ⅰ和PGⅡ水平。以非参数95%百分位数法计算健康老年人Scr、ALT、PG Ⅰ、PG Ⅱ及PGⅠ/Ⅱ的参考区间。结果健康老年人Scr水平需按照性别和年龄划分制定参考区间；不同性别及年龄组(60～69,70～79,80～89岁叁个年龄组)的Scr参考区间：男性分别为53.4～95.6,58.2～105.6,60.0-111.3μmol/L;女性分别为43.8～76.2,46.7～87.2,48.1-92.2μmol/L;ALT水平需要按照性别和年龄分组制定参考区间：男性60～79岁组为7.5～26.8IU/L,80～89岁组为7.2～17.2IU/L；女性60～89岁组为6.0～18.8IU/L; PGⅠ需要按照性别和年龄分组：男性50～79岁组为29.72～196.31ng/mL,80～89岁组为33.01～220.69ng/mL;女性40～79岁组为25.78～150.09ng/mL,80～89岁组为34.55～167.42ng/mL;PGⅡ需要按照性别和年龄分组：男性50～79岁组为7.14～30.56ng/mL,80～89岁组为7.62～39.13ng/mL;女性40～79岁组为5.46～38.21ng/mL,80～89岁组为6.14～46.72ng/mL;PG Ⅰ/Ⅱ不需按照年龄和性别分组为2.06～6.56。结论健康老年人群Scr、ALT、PGⅠ、PGⅡ及PGⅠ/Ⅱ的参考区间与成年人存在差异,本研究初步建立了健康老年人Scr、ALT、PGⅠ、PGⅡ及PGⅠ/Ⅱ的参考区间。第叁部分基于Scr的eGFR公式适用于健康老年人群的评估以及ALT ULN在临床中应用的研究目的评估基于Scr的eGFR公式在健康老年人群的适用性以及新建立ALT ULN在老年人群HBV和NAFLD诊断效能。方法利用MDRD、Japan-MDRD、CKD-EPI、EPI-Asia, c-a eGFR(中国公式)五个方式来计算不同年龄段健康老年人群的eGFR;利用ROC曲线计算新建立ALT ULN在老年人群HBV和NAFLD诊断效能。结果MDRD、Japan-MDRD、CKD-EPI、EPI-Asia, c-a eGFR计算的健康老年人eGFR,超过50%以上的eGFR低于90ml/min/1.73m2;建立ALT ULN诊断老年人群HBV敏感度分别为：男性60～79岁组为42.81%,80-89岁组为47.22%；女性60～89岁组为40.35%；诊断NAFLD的敏感度分别为：男性60～79岁组为66.09%,80～89岁组为72.34%；女性60～89岁组为55.01%；明显较采用WS/TULN时的敏感度,而特异度仅略有降低。结论MDRD、Japan-MDRD、CKD-EPI、EPI-Asia, c-a eGFR方程式并不适合评估所有健康老年人群的GFR；而新建立ALT ULN诊断老年人群HBV和NAFLD患者有较好的敏感度。第四部分健康老年人群Scr、ALT的RCVs研究及在临床中的初步应用目的计算健康老年人群Scr、ALT的RCVs,探索健康老年人群Scr、 ALTRIs的临床适用性。方法固定日期采集受试者血清标本,连续采样4次,进行Scr和血清ALT的检测,并根据Fraser RCVs公式计算健康老年人群Scr、ALT的RCVs和Ⅱ。结果健康老年人不同性别及年龄组(60-69,70～79,80-89岁叁个年龄组)的Scr的RCVs:男性分别为20.25、18.43、17.40；Ⅱ分别为0.41、0.46、0.39；女性Scr的RCVs分别为：18.94、18.68、18.17；Ⅱ分别为0.45、0.45、0.44。健康老年人不同性别及年龄组(60-69,70-79,80～89岁叁个年龄组)的ALT的RCVs:男性分别为50.22、52.59、52.06；Ⅱ分别为0.34、0.34、0.38；女性ALT的RCVs分别为：69.98、71.06、71.60；Ⅱ分别为0.47、0.57、0.51。结论健康老年人群Scr和ALT的变化具有明显的个体特征指数,故临床中Scr和ALT的RCVs明显优于RIs用于疾病的监测。 [1]. 成骨细胞特异性Smad4基因剔除导致小鼠早期发生骨质疏松[D]. 谭晓红. 中国人民解放军军事医学科学院. 2004 [2]. 异补骨脂素结合锌对大鼠成骨细胞生物活性影响的实验研究[D]. 张军芳. 河北医科大学. 2009 [3]. BMP-7在雷奈酸锶促进骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用[D]. 李正. 南方医科大学. 2012 [4]. 异补骨脂素加锌对大鼠成骨细胞相关细胞因子表达影响的实验研究[J]. 王建华, 张军芳, 吕萍, 王雅楠. 天然产物研究与开发. 2010 [5]. 葛根素对小鼠成骨细胞TGF-β/Smad基因蛋白表达影响的研究[D]. 钱康琦. 南京中医药大学. 2014 [6]. 成骨生长肽对OPG基因剔除小鼠骨质疏松治疗作用的分子机制[D]. 郭常军. 复旦大学. 2010 [7]. 人牙本质基质蛋白1基因转录调控机制的研究[D]. 逄键梁. 第四军医大学. 2006 [8]. 健康老年人群Scr、ALT和PG参考区间的建立及其参考改变值的研究[D]. 黄猛. 中南大学. 2014 标签：内分泌腺及全身性疾病论文; 对照组论文; 细胞增殖论文; 细胞分化论文; 骨质疏松论文; 特异性论文; 雌激素论文; 补骨脂论文; mol论文; 参考文献：