阪崎克罗诺杆菌毒力相关基因研究

论文摘要

阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)属肠杆菌科,克罗诺杆菌属,为革兰氏阴性菌,周生鞭毛,能运动,无芽孢,兼性厌氧,是一类能够在人和动物肠道内生存的机会性致病菌。阪崎克罗诺杆菌广泛存在于环境和食物中,通过环境接触和摄食等途径进入动物和人体。感染阪崎克罗诺杆菌可能危及新生儿、婴幼儿的生命,对老年人和免疫功能低下的成年人同样具有较强的致病性,该菌对人类危害性较大,已广泛引起人们的关注。目前,对该菌的致病机理和重要的毒力因子研究尚不完善,因此,本课题旨在蛋白和基因水平上研究阪崎克罗诺杆菌毒力相关机制。本研究利用比较蛋白组学筛选阪崎克罗诺杆菌的毒力相关蛋白。首先利用MLST对38株阪崎克罗诺杆菌进行分型,结果显示,38株菌分布于17个ST型。依据分型结果以及实验室前期的毒性测定实验,本研究选取同属于ST327型、但是毒力差异明显的两株阪崎克罗诺杆菌(高毒力菌株SAKA80220和低毒力菌株SAKA80221)进行比较蛋白组学分析。共鉴定出2319个蛋白,其中2203个蛋白可以进行准确定量。以丰度比≥3,≤0.33且P<0.05进行差异蛋白筛选,共筛选得到210个差异表达的蛋白质,其中高毒菌株高表达的差异蛋白67个、低表达的差异蛋白143个。将差异蛋白进行代谢途径分析,发现高毒菌株中高表达的差异蛋白主要与阪崎克罗诺杆菌鞭毛的合成与组装、核糖体合成、脂多糖的合成与转运、能量代谢等相关;低表达的差异蛋白主要与细胞膜和精氨酸的代谢相关。选取1 1个蛋白所对应的编码基因,利用实时定量PCR验证转录水平与翻译水平是否一致,结果显示,9个基因在转录水平和翻译水平表达趋势一致,另外2个基因在翻译水平上表达量高,但在转录水平未表现出显著的上调表达。依据毒性相关基因方面的文献报道,本研究选取阪崎克罗诺杆菌毒力相关基因nlpD、adh以及菌膜形成相关基因deoB,利用基因敲除研究其功能。在NCBI数据库中获取三个基因的序列,设计引物扩增上下游同源臂,并将各个基因的上下游同源臂以与卡那霉素基因序列连入缺失载体中,并通过普通PCR和测序验证缺失载体,结果显示,缺失载体构建成功。将构建成功的载体线性化以后转入含有pKD46的野生菌中,利用抗性筛选基因敲除突变株,经过多轮筛选没有获得敲除突变株,说明这三个基因在阪崎克罗诺杆菌中可能发挥着重要作用,缺失后可能导致菌株的死亡。本研究为进一步认识阪崎克罗诺杆菌的毒性机制奠定了基础,并为这一致病菌的针对性控制及有效减少其对粮食、油脂的污染提供了一定的参考。

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摘要

ABSTRACT

1 前言

1.1 研究背景

1.1.1 克罗诺杆菌属

1.1.2 阪崎克罗诺杆菌简介

1.1.3 阪崎克罗诺杆菌致病机制及毒力相关基因的研究

1.1.4 基因敲除技术

1.1.5 阪崎克罗诺杆菌的分型研究

1.1.6 蛋白组学技术在阪崎克罗诺杆菌中的应用

1.2 本课题的研究意义

1.3 本课题主要研究内容

2 材料与方法

2.1 实验材料与仪器

2.1.1 实验所用菌株

2.1.2 实验所用试剂

2.1.3 实验所用仪器

2.1.4 实验中所用试剂的配制

2.2 实验方法

2.2.1 38株阪崎克罗诺杆菌的活化及培养

2.2.2 阪崎克罗诺杆菌的MLST分型

2.2.3 不同毒力菌株的蛋白组学分析

2.2.4 实时定量PCR验证蛋白组学分析结果

2.2.5 敲除载体的构建

2.2.6 基因敲除

3 结果与讨论

3.1 38株阪崎克罗诺杆菌的MLST分型结果

3.2 比较蛋白组结果

3.2.1 蛋白提取结果

3.2.2 定量结果分析

3.2.3 定量分析

3.3 实时定量PCR结果

3.4 基因敲除实验

3.4.1 敲除载体的构建

3.4.2 基因敲除

4 结论

4.1 课题总结

4.2 论文创新点

4.3 论文的不足之处

5 展望

6 参考文献

7 攻读硕士学位期间发表论文情况

8 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 董璇

导师: 杜欣军

关键词: 阪崎克罗诺杆菌,毒力,分型,蛋白组学,实时定量,基因敲除

来源: 天津科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 天津科技大学

分类号: TS201.3

DOI: 10.27359/d.cnki.gtqgu.2019.000120

总页数: 76

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