黄军梅
邵阳市中心医院急诊科湖南邵阳422000
【摘要】目的：近年侵袭性肺曲霉菌病发病率逐年上升，由于该病临床表现无特异性，致使诊断较为困难，因此选择正确、合适的实验诊断方法意义重大。本文旨在研究分析应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测曲霉半乳甘露聚糖（GM）抗原对免疫功能抑制患者侵袭性肺曲霉病的诊断价值。方法：通过对2010年6月~2013年6月我院收治的血液肿瘤科和呼吸内科65例住院患者采用ELISA方法检测血清中的GM，配合其他辅助方法检查。结果：以1.5和0.8为阳性届值时，ELISA检测的敏感性、特异性分别为53.33%、95.00%和73.33%、90.00%。结论：利用ELISA法检测患者血清中的半乳甘露聚糖及甘露聚糖来诊断侵袭性真菌病，标本采集简单方便，可以提高临床诊断IPA的准确度，多次检测可帮助判断疗效及预后，值得临床推广。
【关键词】侵袭性肺曲霉菌病；半乳甘露聚糖；诊断价值
曲霉是已知的、最常见的、传播最广的霉菌之一，是一种条件致病菌。在免疫功能受到抑制的个体，如粒细胞减少症患者、肿瘤放化疗患者、骨髓移植患者容易致使其肺部感染[1]。侵袭性肺曲霉菌病（invasivepulmonaryasper-gillosis，IPA）是曲霉菌病中一种严重的临床类型。近年随着器官移植技术的日臻成熟、各种新的免疫抑制剂的出现、广谱抗生素的大量使用，IPA的发病率逐年上升，病死率高达56%~88.1%[2]。抗曲霉药必须在早期应用才能达到良好效果。但由于患者临床表现不具有特异性，呼吸道标本真菌培养和血培养的低阳性率，侵袭性肺区霉菌病的早期诊断仍然不理想。本研究应用曲霉抗原酶联免疫吸附（ELISA）试验检测试剂盒PlateliaAspergillus对来自65例临床可疑侵袭性肺曲霉病患者的血清标本进行半乳甘露聚糖（galactomannan，GM）检测，以评价其在IPA早期诊断方面的应用价值。
1资料与方法
1.1一般资料
2010年6月~2013年6月我院收治的血液肿瘤科和呼吸内科住院患者，发热时进行广谱抗生素治疗48～72h后，若出现以下任一情况即列为研究对象：①患者出现体温难以下降，持续不退；②患者出现体温降后上升现象；③患者经过影像学观察肺部发现新发病灶；④患者呼吸道感染加重或者全身症状都有加重的迹象；⑤患者既往有曲霉菌感染的病史。同时，对所有研究对象适时复查胸部影像学检查、血液、呼吸道分泌物以及其他体液标本直接检查或者培养真菌，如果患者有条件需要进行支气管镜检查。其中男40例，女25例，年龄14～74岁，平均40.6岁；其中急性淋巴细胞白血病21例，肺癌放化疗后17例，慢性粒细胞白血病异基因造血干细胞移植后12例，急性粒细胞白血病8例，多发性骨髓瘤5例，白细胞增高待查2例。
1.2诊断标准
本次研究采用的诊断标准参考欧洲癌症治疗组织及真菌病研究组（EORTC/MSG）制定的诊断标准[3]，对侵袭性肺曲霉菌病诊断标准作如下划分。
确诊IPA：（1）肺组织镜检发现分隔、45°分支的菌丝，或肺组织培养出曲霉。取自无菌部位的标本分离出曲霉。（2）肺部感染的1项主要或至少2项次要临床诊断标准。
临床诊断IPA：（1）痰或支气管肺泡灌洗液镜检见分隔、45°分支的菌丝，或培养出曲霉。（2）肺部感染的1项主要或至少2项次要临床诊断标准。
临床拟诊IPA：（1）有以下危险因素之一：血白细胞减少（WBC<4.0×109/L）、器官移植、长期使用激素。（2）肺部感染的1项主要或至少2项次要临床诊断标准。
主要临床诊断标准：胸部影像学表现为晕轮征、新月形空气征、实变区域内出现空腔、或呈斑点状、结节状或云絮状阴影。次要临床诊断标准：咳嗽、胸痛、呼吸困难、咯血；胸膜摩擦音；肺部出现其他原因不能解释的新的浸润灶；持续发热超过96小时，合理广谱抗生素治疗无效。
1.3方法
1.3.1分组
将纳入对象根据诊断标准分为4组：确诊IPA组（7例），临床诊断IPA组（8例），临床拟诊IPA组（30例），非IPA感染组（20例）即不符合以上诊断标准的患者。
1.3.2样本采集
65例患者每3~4d采静脉血2ml，直到治疗后患者症状和体征好转、体温下降至正常后1周，或患者死亡为止。采血后6h内离心分离血清并冻存于-20℃备检。65例患者共检测血清样本196份。
1.3.3血清GM值检测
采用双夹心酶联免疫法（Bio-Rad公司试剂，PlateliaAspergillus），按GM抗原试剂盒说明书进行操作。每次实验均必须以标准血清A值均值于0.3~0.8之间、阳性对照A值/标准A值均值>2、阴性对照A值/标准A值均值<0.5作为实验内质控。患者血清的GM值计算公式为：被检血清A值/标准血清A值。两次连续采集样本均为阳性才能判断该实验结果为曲霉感染阳性。
1.3.4辅助检查
65例患者同时进行影像学检查，痰或血的病原菌培养，部分患者收集支气管灌洗液进行病原菌培养，行纤维支气管镜检查，以及经支气管肺活检行组织培养或病理学检查。
2结果
2.1GM实验结果分析
由于临床拟诊IPA组中部分病例最后既不能确定为非IPA感染也不能排除IPA感染，故在实验结果分析中以确诊IPA组+临床诊断IPA组为病例组，以非IPA感染者为对照组，以1.5为阳性届值时，病例组8例呈阳性，7例呈阴性；对照组1例呈阳性，19例呈阴性；以0.8为阳性届值时，病例组11例呈阳性，4例呈阴性；对照组2例呈阳性，18例呈阴性。以病例组为真阳性，对照组为真阴性作结果分析评价，见表1、2。
2.2阳性届值为1.5、0.8时GM实验敏感性、特异性结果
以1.5为阳性届值时，敏感性53.33%，特异性95.00%；以0.8为阳性届值时，敏感性73.33%，特异性90.00%。结果表明，以0.8为阳性届值时，敏感性较以1.5为阳性届值时大幅提高，特异性小幅降低。
3讨论
曲霉菌以腐生方式在自然界广泛分布，为条件致病菌，曲霉菌的孢子大多数通过吸入，经呼吸道进入肺部，因此曲霉菌的感染部位主要集中在肺部[3]，侵袭性肺曲霉病是肺曲霉病中最严重的类型。大多数是在原有肺部疾患的基础上或因长期使用抗生素和激素后继发感染或由于器官移植，肿瘤放化疗引起。主要表现为咳嗽、咳痰和反复咯血。IPA病变发展快，死亡率高，如不治疗几乎达100%，确诊和治疗比较困难，因此早期诊断、合理治疗就显得尤为重要[4]。目前临床中采取的诊断侵袭性肺曲霉菌病的方法比较欠缺，血培养的阳性率太低，尤其是曲霉菌因其菌体较大血培养基本为阴性；痰真菌培养标本易受污染，阳性率低，本组病例中只有8例患者痰培养出曲霉菌，而且结果阳性仅表示存在某种真菌，区分定植和感染困难。CT检查花费也较高且典型的CT表现出现时患者多已处在病程中后期，早期诊断困难。确诊有赖于有创检查手段，一般IPA的患者病情较重，受病情限制，IPA的诊断困难。
酶联免疫吸附法是日前分析化学领域中的前沿课题，是把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的一种检测技术。该技术主要的依据有三点：（1）抗原（抗体）能结合到固相载体的表面仍具有其免役活性；（2）抗体（抗原）与酶结合所形成的结合物仍保持免疫活性和酶的活性；（3）结合物与相应的抗原（抗体）反应后，结合的酶仍能催化底物生成有色物质，而颜色的深浅可定量抗体（抗原）的含量。利用酶联免疫吸附试验法来检测患者血清中的半乳甘露聚糖及甘露聚糖所依据的原理是半乳甘露聚糖及甘露聚糖是曲霉菌属真菌细胞壁上特异性的抗原，具有较高的属特异性并且与其他抗原，如细菌抗原、类风湿因子等之间很少有交叉免疫性，因其是真菌胞外抗原且含量较大，在发生IPA时较容易出现在血液中[5]。
半乳糖甘露聚糖是曲霉细胞壁的成分，最初是从感染动物模型和IA患者血清中发现。当曲霉感染时，血液和体液（尿液、脑脊液、腹水、胸水等）中的GM会显著增高，故检测GM可用于曲霉感染的早期诊断。相关报道显示[6]，临床实验中半乳甘露聚糖对诊断侵袭性曲霉菌病敏感度为65%~75%，特异度大于90%。本研究中，以1.5为阳性届值时，敏感性53.33%，特异性95.00%；以0.8为阳性届值时，敏感性73.33%，特异性90.00%。以0.8为阳性届值时，与报道相符合。在本研究中确诊IPA组和临床诊断IPA组患者，在发病早期，发热第3天患者血液和肺灌洗液等标本GM就显著增高，为早期诊断和治疗赢得了时间。随着抗真菌药的应用，患者临床症状的缓解本研究中病例组血清GM逐渐降低，血清GM在临床早期诊断、监测病情有一定重要意义，但其尚不能单独作为抗曲霉菌治疗停药的指征[7]。
本实验在临床检测GM过程中发现存在假阳性，产生假阳性的原因主要是一些抗原物质与单克隆抗体产生交叉反应所致，一些真菌也能与单克隆抗体产生交叉反应。Walsh等[8]研究也发现，健康人群及非侵袭性曲霉菌病患者使用哌拉西林—三唑巴坦后血清半乳甘露聚糖（GM）滴度可明显上升。
综上所述，我们认为使用曲霉抗原酶联免疫吸附试验检测CM抗原诊断IPA可以进行早期诊断，敏感性和特异性都较高，同时标本采集方便，可以提高临床诊断IPA的准确度，多次检测可帮助判断疗效及预后，对患者的早期治疗意义重大，值得临床推广。
参考文献：
[1]熊祝嘉，徐英春.半乳甘露聚糖用于侵袭性曲霉感染实验诊断的研究现状[J].中国真菌学杂志，2007，2（1）：52-54.
[2]N.L.SmithandD.W.Denning.Underlyingconditionsinchronicpulmonaryaspergillosisincludingsimpleaspergilloma[J].Eur.Respir.J.，Apr2011；37：865-872.
[3]樊再雯，李建，刘颖等.52例侵袭性肺曲霉菌病临床分析[J].临床肺科杂志2012年7月第17卷第7期：1275-1278.
[4]朱丹，卜黎红，赵建平等.侵袭性肺曲霉菌病43例临床诊治分析[J].中国实用内科杂志，2009年12月第29卷第12期：1143-1144。
[5]钱俊峰，曹卓，潘炯伟.联合血清及肺泡灌洗液GM检测在侵袭性肺曲霉菌病临床诊治的应用价值[J].《放射免疫学杂志》2013年04期：1983-1984。
[6]RafaelF.Duarte，IsabelSánchez-Ortega，etalSerumGalactomannan–BasedEarlyDetectionofInvasiveAspergillosisinHematologyPatientsReceivingEffectiveAntimoldProphylaxis[J].ClinicalInfectiousDiseases，Oct2014；10.1093/cid/ciu673.
[7]胡华，杨燕，鞠云飞等.血清半乳甘露聚糖抗原检测在肺曲霉菌病临床诊治的应用价值[J].中华医院感染学杂志2010年第20卷第20期：3247-3249.
[8]WalshTJ，ShohamS，PetraitieneR，etalDetectionofgalactomannanantigenemiainpatientsreceivingpiperacillin-tazobactamandcorrelationsbetweeninvitro，invivo，andclinicalpropertiesofthedrug-antigeninteraction[J].JClinMicrobio，2004，42（10）：4744-4748.