RAD9在中国卤虫滞育胚胎重启动中的作用

论文摘要

中国卤虫（Artemia sinica）在胚胎发育过程中,外界环境的变化能够导致中国卤虫胚胎产生滞育现象。在胚胎滞育和重启动过程中,胚胎一方面需要修复其DNA损伤,另一方面需要调节细胞周期以调控胚胎的再启动过程。当外源或内源DNA损伤因子攻击细胞时,细胞周期检查点相关蛋白RAD9（Cell cycle checkpoint control protein RAD9A）可参与细胞周期的阻滞延缓,同时,待细胞中受损DNA得到完善修复后再恢复细胞周期正常运转,以确保滞育胚胎能够正常发育。RAD9还参与调节下游靶基因的转录、影响核苷酸合成、诱导细胞凋亡和胚胎发育等细胞活动。目前,RAD9在中国卤虫滞育胚胎重启动中的作用一直没有研究,因此,本研究对进一步分析中国卤虫胚胎滞育和滞育解除过程中RAD9对细胞周期的调控作用具有较为重要的理论意义。本文首次克隆了中国卤虫As-rad9基因cDNA全长,并对其进行了生物信息学分析,采用实时定量PCR方法检测As-rad9基因在中国卤虫胚胎发育各时期,温度胁迫及盐度胁迫条件下mRNA的表达水平及表达模式,利用免疫印迹技术检测RAD9及其相关蛋白RAD17,HUS1,RAD1,CHK1和CDC25A在卤虫胚胎发育过程中蛋白表达模式及表达水平,利用小RNA干扰（small interfering RNA,siRNA）技术确定RAD9在卤虫早期胚胎发育过程中的作用。结果显示,As-rad9基因全长1238 bp,编码出377个氨基酸,蛋白的分子量约是42.6 kDa,等电点约是6.48,是一个亲水蛋白,通过亚细胞定位发现其最可能定位在细胞核中。荧光实时定量PCR结果显示,As-rad9基因在胚胎发育5小时阶段呈现最高表达水平,随后逐渐降低,至40小时后呈现逐渐上升趋势;Western blot结果显示,RAD9蛋白的表达趋势和mRNA表达趋势大体一致,还发现As-RAD9,As-RAD1,As-RAD17,As-CHK1和As-CDC25A的蛋白表达水平与其在不同胚胎阶段的表达水平一致。结果表明As-RAD9是一种应激相关因子,可促进或抑制细胞周期检查点相关基因在滞育胚胎重启过程中的表达。通过免疫荧光实验可以看出RAD9在中国卤虫的每个阶段均有表达,无组织器官特异性,大多定位在细胞核中。通过小RNA干扰实验证明敲除As-rad9基因会增大卤虫的死亡率,并延缓卤虫胚胎发育。该研究分析了RAD9在中国卤虫滞育胚胎重启动过程中的表达模式、表达部位及与其他相关蛋白的调控关系,证明RAD9在中国卤虫滞育胚胎重启动过程中发挥了重要作用。这些研究结果对进一步深入了解卤虫滞育及解除的分子机制提供了参考资料。

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摘要

Abstract

1 前言

1.1 卤虫研究概况

1.1.1 中国卤虫的形态学特征及地理分布

1.1.2 卤虫的经济价值和分子生物学研究现状

1.1.3 卤虫胚胎滞育的研究

1.2 细胞周期检查点

1.2.1 G1/S期检验点

1.2.2 S期检验点

1.2.3 G2/M期检验点

1.2.4 S/M期检验点

1.2.5 纺锤体组装检验点

1.3 细胞周期检查点蛋白RAD9

1.4 本研究的目的及意义

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 实验材料

2.1.2 主要试剂及药品

2.1.3 仪器与设备

2.2 方法

2.2.1 卤虫总RNA的提取

2.2.2 基因全长序列的获取

2.2.3 PCR产物的纯化和克隆转菌

2.2.4 荧光实时定量PCR

2.2.5 原核表达

2.2.6 大量诱导和包涵体纯化

2.2.7 Western Blot

2.2.8 免疫荧光

2.2.9 小RNA干扰

2.2.10 生物信息学及生物统计分析

3 结果

3.1 As-rad9 基因全长和生物信息学分析

3.2 As-rad9 生物信息学分析

3.3 As-RAD9 序列进化关系分析

3.4 As-rad9 荧光实时定量PCR实验结果

3.5 As-RAD9 重组蛋白的表达及纯化

3.5.1 As-RAD9 重组蛋白的诱导表达

3.5.2 As-RAD9 重组蛋白的可溶性检测

3.5.3 As-RAD9 重组蛋白的纯化

3.6 As-RAD9 蛋白的表达模式

3.6.1 在中国卤虫不同时期的表达

3.6.2 在低温胁迫下的表达

3.6.3 在高盐浓度胁迫下的表达

3.7 As-RAD9 免疫荧光

3.8 As-rad9的siRNA干扰实验

4 讨论

4.1 As-rad9 基因全长和生物信息学分析

4.2 As-RAD9 亚细胞定位分析

4.3 As-RAD9 在中国卤虫不同发育时期的表达水平

4.4 As-RAD9 在温度和盐度胁迫下的表达水平

4.5 中国卤虫不同发育时期As-RAD9 的作用

结论

参考文献

硕士学位期间发表学术论文情况

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 陈册

导师: 张剑锋

关键词: 中国卤虫,细胞周期检查点,细胞周期检查点蛋白,滞育胚胎,表达模

来源: 辽宁师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 辽宁师范大学

基金: 国家自然科学基金项目Annexin3介导anxa3,lea,drrb,atf3途径激活中国卤虫滞育胚胎重启动的分子机制,(项目编号:31572607)

分类号: Q953

总页数: 55

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