甲醛的Hormesis效应及其分子机制的探究

论文摘要

甲醛（Formaldehyde,FA）是最主要的室内空气污染物,可以引发神经、生殖、造血、遗传等多种毒性,被定义为“A1类致癌物”。当某一化学物以高剂量形式作用于机体时,表现出毒害作用,但低剂量时却表现为有益作用的现象,就称为Hormesis效应。多项研究表明,高浓度甲醛引发了细胞死亡或凋亡,而低浓度甲醛促进了细胞增殖,但其中的分子机制鲜有报道。本研究以不同类型的离体培养细胞为研究对象,通过分析被不同浓度甲醛处理后的细胞活力情况,探讨了低浓度甲醛促进细胞增殖的剂量范围,通过检测与细胞增殖有关的生物分子表达量的变化,探究了甲醛Hormesis效应的分子机制。首先,以人慢性髓系白血病细胞（K562细胞）和人正常支气管上皮细胞（16HBE细胞）为研究对象,通过CCK-8法、四甲基偶氮唑蓝（methylthiazolylterazolium,MTT）法分析细胞活力,确定甲醛促进细胞增殖安全剂量范围。结果表明,对K562细胞和16HBE细胞而言,甲醛对细胞增殖的安全剂量范围分别在0-125 μmol/L和0-60 μmol/L,超出该范围后,细胞活力逐渐下降,表明甲醛有着Hormesis效应。其中,75μmol/L和40 μmol/L的甲醛处理使两种细胞的活力明显上升。实验分为四组:对照组,甲醛处理组,甲醛与抑制剂联合作用组,抑制剂组;甲醛的处理浓度分别为75μmol/L和40μmol/L,处理时间为2h。一方面,结合抗氧化剂维生素E（VitaminE,VE）,我们发现低浓度甲醛在提高细胞活力的同时也诱发了氧化应激现象的出现:活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）含量显著性上升、谷胱甘肽（glutathione,GSH）水平显著性下降。同时,虽然低浓度甲醛暴露提高了细胞分裂中细胞周期蛋白复合物CyclinD-cdk4、转录因子E2F1的表达,以及糖代谢（Warburg效应）中丙酮酸激酶M2型同工酶（Pyruvate kinase M2 isoenzyme,PKM2）、葡糖转运体1（Glucose Transporter 1,GLUT1）、葡萄糖、乳脱氢酶A（Lactate Dehydrogenase A,LDHA）、乳酸水平,但与甲醛处理组相比,VE的加入使上述分子的含量均出现下降。另一方面,结合EGFR的特异性抑制剂C-4-（3-溴苯氨基）-6,7-双甲氧喹唑啉（PD153035）,我们发现低浓度甲醛的处理使表皮生长因子受体（Epithelial growth factor receptor,EGFR）、增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA）含量在蛋白和基因表达水平上的上升均具有统计学意义,但甲醛与PD153035联合作用组与甲醛处理组相比,这些生物指标的含量都有所降低。实验数据表明,甲醛对细胞增殖的影响是随剂量的不同而不同的:低浓度甲醛促进细胞增殖,高浓度甲醛抑制细胞增殖,体现了甲醛的Hormesis效应。甲醛Hormesis效应的分子机制是:低浓度甲醛通过促进氧化应激介导的细胞分裂或糖代谢（Warburg效应）的关键因子,或作为一种信号分子直接影响生长信号转导分子,促进细胞的增殖。细胞增殖一旦失去控制,癌症便顺势而发。本研究为客观评价甲醛、全面揭示甲醛促进的细胞增殖与其引发的癌症和其他疾病之间的关系奠定了基础。

论文目录

中文摘要

Abstract

1 文献综述

1.1 甲醛的污染现状与毒性研究

1.1.1 甲醛的分布与污染现状

1.1.2 甲醛的毒性研究

1.2 Hormesis效应

1.2.1 Hormesis效应简介

1.2.2 Hormesis效应的分子机制

1.3 细胞增殖

1.3.1 癌症与细胞增殖

1.3.2 细胞增殖与糖代谢

1.3.3 细胞增殖与生长信号转导分子

1.4 立项依据与研究意义

2. 材料与方法

2.1 实验对象

2.1.1 细胞冻存

2.1.2 细胞复苏

2.2 实验试剂及器材

2.2.1 主要试剂的配制

2.3 低浓度甲醛促进细胞增殖的安全剂量模型的建立

2.3.1 甲醛染毒方案

2.3.2 细胞活力的测定

2.4 甲醛Hormesis效应的分子机制探究

2.4.1 甲醛染毒方案

2.4.2 细胞活力的测定

2.4.3 细胞内氧化应激指标的测定

2.4.4 ELISA法检测

2.5 实时荧光定量法（Real-Time PCR,RT-PCR）检测

2.5.1 细胞总RNA的提取

2.5.2 反转录得cDNA

2.5.3 RT-PCR

2.6 数据分析

3. 结果与分析

3.1 甲醛对细胞增殖的安全剂量范围

3.2 低浓度甲醛对细胞内氧化应激水平的影响

3.2.1 VE浓度的筛选

3.2.2 K562细胞内的氧化应激情况

3.2.3 16HBE细胞内的氧化应激情况

3.2.4 细胞活力的变化

3.3 低浓度甲醛对细胞分裂的影响

3.3.1 低浓度甲醛对CyclinD-cdk4含量的影响

3.3.2 低浓度甲醛对E2F1含量的影响

3.4 低浓度甲醛对糖代谢（Warburg效应）的影响

3.4.1 低浓度甲醛对PKM2含量的影响

3.4.2 低浓度甲醛对葡萄糖含量的影响

3.4.3 低浓度甲醛对乳酸含量的影响

3.5 低浓度甲醛对生长信号转导分子的影响

3.5.1 PD-153035处理后细胞生长活力情况

3.5.2 低浓度甲醛对EGFR含量的影响

3.5.3 低浓度甲醛对PCNA含量的影响

4. 讨论

4.1 细胞的选择

4.2 低浓度甲醛可以促进细胞增殖

4.3 甲醛的Hormesis效应与氧化应激有关

4.3.1 低浓度甲醛可以通过影响氧化应激介导的细胞分裂关键因子促进细胞增殖

4.3.2 低浓度甲醛可以通过影响氧化应激介导的糖代谢（Warburg效应）关键因子促进细胞增殖

4.4 低浓度甲醛通过直接影响生长信号转导分子促进细胞增殖

5. 结论与展望

5.1 主要结论

5.2 展望

参考文献

附录1: 缩略词表

附录2: RT-PCR基因名称及引物序列

在校期间发表的论文、科研成果等

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 安洁然

导师: 丁书茂

关键词: 甲醛,效应,细胞增殖,细胞分裂,糖代谢,生长信号转导

来源: 华中师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,环境科学与资源利用

单位: 华中师范大学

分类号: X171.5

总页数: 75

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甲醛的Hormesis效应及其分子机制的探究

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