杜氏盐藻MAPK相互作用蛋白质的研究

论文摘要

杜氏盐藻（Dunaliella salina）是一种极其耐盐的单细胞真核生物,是研究植物高盐适应的模式生物。促有丝分裂活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPK）属于丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶,在真核生物中广泛存在。大量研究表明丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶广泛地参与了植物对干旱、盐胁迫等逆境胁迫的应答反应。深入探讨MAPK的作用机制,对于阐明盐藻耐盐的分子机制及应答盐胁迫信号的分子途径具有重要的科学意义。本研究采用免疫共沉淀和酵母双杂交等技术筛选盐藻DsMAPK（GenBank:JQ782412）的相互作用蛋白质,取得如下成果:1.将含有原核表达载体pGS21a-DsMAPK的E.coli BL21表达菌株,经IPTG诱导使MAPK基因在E.coli BL21中成功表达。将可溶性蛋白经过His柱纯化获得了高纯度的融合蛋白,用该融合蛋白作为抗原免疫动物,制备了多克隆抗体,经ELISA检测抗血清纯化抗体效价≥512K。以内源性靶蛋白为诱饵,将靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行共孵育,用蛋白A/G琼脂糖珠纯化复合物,经western检测后经质谱分析,检测到与DsMAPK相互作用的蛋白质共165种。通过GO和KEGG分析,发现这些差异蛋白主要参与了新陈代谢、遗传信息的传递以及信号转导等生物学调控过程。蛋白质互作网络分析发现,直接与DsMAPK相互作用的蛋白质有4种。2.利用实时荧光定量PCR技术检测DsMAPK互作蛋白基因的表达情况。采用LiAc/PEG介导法将反义表达载体pMDCaMGN-Cat质粒导入盐藻细胞。通过氯霉素筛选获得转基因盐藻,用qRT-PCR的方法分析盐胁迫1 h转基因盐藻的DsGAPDH,DsRbcS,DsPKC,DsPGK1表达水平的变化情况,结果显示结果显示转基因盐藻经高盐胁迫1 h后DsMAPK表达量比野生型盐藻有明显降低,差异达到显著水平（P<0.05）,证明反义基因的导入有效抑制了DsMAPK的表达。转基因盐藻DsPKC、DsGAPDH表达量比野生型盐藻有明显降低,差异达到显著水平（P<0.05）。同时,DsRbcS、DsPGK1及DsGPDH的表达量均有不同程度的降低,说明这些基因的表达与DsMAPK存在一定的相关性。3.利用DNA重组技术将DsPKC、DsMAPK基因的开放阅读框分别克隆到酵母表达载体pGBKT7、pGADT7上,经测序验证读码框正确,证明成功构建了盐藻DsPKC和DsMAPK的酵母表达载体;将酵母表达质粒pGBKT7-DsPKC、pGADT7-DsMAPK转化Y2H Gold感受态细胞,经菌落PCR鉴定质粒成功转入酵母菌Y2H Gold。将pGBKT7-DsPKC/Y2H Gold菌液涂布SD/-Trp平板、pGADT7-DsMAPK/Y2H Gold菌液涂布SD/-Leu平板,结果表明,含有酵母表达载体的酵母菌株和含有空载体的酵母菌,在相同的培养时间内菌株大小相同,生长状态一致,证明该蛋白没有毒性。将成功转入酵母菌Y2H Gold的菌落转涂在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal培养基上进行自激活检测,结果表明,这两种蛋白均不具有自激活性。将pGBKT7-DsPKC、pGADT7-DsMAPK共转化Y2H Gold感受态细胞,共转化产物直接涂布于SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade、SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal营养缺陷型固体培养基,在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade、SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal固体培养基上,实验组（pGADT7-DsMAPK+pGBKT7-DsPKC）有生长且变蓝,说明DsMAPK与DsPKC存在相互作用。该研究成果为在蛋白质水平上阐明盐藻DsMAPK的功能提供了参考,为我们深入研究杜氏盐藻响应盐胁迫的分子机制提供了新的信息。

论文目录

摘要

Abstract

第一章综述

1 杜氏盐藻的研究概况

1.1 盐藻的简介

1.2 盐藻耐盐机制

1.2.1 盐藻适应高盐环境的渗透调节

1.2.2 盐藻耐盐相关基因的克隆

1.2.3 盐藻盐适应蛋白的研究

2 MAPK研究概况

2.1 MAPK简介

2.2 MAPK信号转导途径

2.3 盐藻MAPK的研究进展

3 免疫共沉淀技术

3.1 免疫共沉淀的基本原理

3.2 免疫共沉淀的优缺点

3.3 免疫共沉淀技术的应用及研究进展

4 酵母双杂交技术

4.1 酵母双杂交技术的原理

4.2 酵母双杂交技术的优缺点

4.3 酵母双杂交技术的应用前景

4.3.1 鉴定已知蛋白质间的互作作用

4.3.2 发现新蛋白质及蛋白质的新功能

4.3.3 绘制蛋白质相互作用图谱

5 本研究的目的和意义

6 研究内容

第二章免疫共沉淀方法筛选盐藻MAPK相互作用蛋白质

1 实验材料

1.1 藻种、菌种与质粒

1.2 主要试剂

1.3 实验仪器

2 实验方法

2.1 融合蛋白的原核表达

2.2 SDS-PAGE电泳检测

2.3 重组蛋白的纯化

2.4 重组蛋白的Western blotting检测

2.5 重组蛋白的复性

2.5.1 透析袋的预处理

2.5.2 重组蛋白的透析及浓缩

2.6 DsMAPK多克隆抗体的制备

2.6.1 抗原处理

2.6.2 动物免疫

2.6.3 间接ELISA检测

2.6.4 Protein A层析柱纯化抗体

2.7 免疫共沉淀筛选DsMAPK的互作蛋白

2.7.1 盐藻的纯化培养

2.7.2 盐藻总蛋白的提取

2.7.3 免疫共沉淀筛选相互作用蛋白

2.8 LC-MS/MS质谱检测

3 实验结果

3.1 融合蛋白的诱导表达

3.2 融合蛋白的纯化及western blot检测

3.3 多克隆抗体的制备和纯化

3.4 盐藻总蛋白的提取及Western blot检测

3.5 免疫共沉淀筛选DsMAPK的相互作用蛋白质

3.6 质谱鉴定及生物信息学分析

4 讨论

4.1 盐藻DsMAPK的原核表达及多克隆抗体的制备

4.2 免疫共沉淀筛选盐藻DsMAPK互作蛋白

4.3 质谱鉴定及生物信息学分析

第三章盐藻DsMAPK及其互作蛋白基因的表达分析

1 实验材料

1.1 藻种、菌株及质粒

1.2 实验试剂

1.3 实验仪器

2 实验方法

2.1 反义表达质粒pMDCaMGN-Cat的提取

2.2 盐藻细胞的培养与转化

2.2.1 盐藻的培养

2.2.2 盐藻反义表达载体pMDCaMGN-Cat的转化与筛选

2.3 实时荧光定量PCR方法分析盐胁迫下基因的表达情况

2.3.1 盐藻总RNA的提取

2.3.2 引物设计

2.3.3 cDNA模板链的合成

2.3.4 qRT-PCR检测盐胁迫下MAPK及其互作基因的表达水平

2.3.5 数据分析

3 结果

3.1 反义表达质粒pMDCaMGN-Cat的提取及其遗传转化盐藻反义表达载体pMDCaMGN-Cat的转化

3.2 盐藻总RNA的提取

3.3 qRT-PCR结果

4 讨论

第四章酵母双杂交方法鉴定盐藻MAPK相互作用蛋白质

1 实验材料

1.1 菌种与质粒

1.2 主要试剂

1.3 实验仪器

2 实验方法

2.1 酵母表达载体pGBKT7-PKC的制备

2.1.1 pGBKT7-PKC质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞

2.1.2 pGBKT7-PKC质粒的小量提取

2.2 酵母表达蛋白的毒性及自激活检测

2.2.1 酵母菌Y2H Gold感受态细胞的制备

2.2.2 pGBKT7-DsPKC转化酵母Y2H Gold感受态细胞

2.2.3 菌落PCR法鉴定阳性克隆

2.2.4 酵母表达蛋白的毒性检测

2.2.5 酵母表达蛋白的自激活性检测

2.3 酵母表达载体pGADT7-DsMAPK的构建

2.3.1 目的片段和载体的双酶切及胶回收

2.3.2 目的片段与载体的连接转化

2.3.3 pGADT7-MAPK质粒的小量提取

2.3.4 酵母表达载体载体pGADT7-DsMAPK的 PCR和酶切检测

2.3.5 酵母表达载体质粒pGADT7-DsMAPK转化Y2H Gold感受态细胞

2.3.6 菌落PCR法鉴定阳性克隆

2.3.7 酵母表达蛋白的毒性及自激活性检测

2.4 酵母双杂交鉴定DsMAPK与 DsPKC是否存在相互作用

2.4.1 两重组质粒共转化Y2H Gold感受态细胞

2.4.2 蛋白互作检测

3 实验结果

3.1 酵母表达载体pGBKT7-DsPKC的制备

3.2 酵母表达载体pGADT7-MAPK的构建

3.3 酵母表达质粒转化酵母Y2H Gold感受态细胞的检测结果

3.4 酵母表达蛋白的毒性及自激活检测

3.5 酵母双杂交鉴定MAPK互作蛋白

3.5.1 两重组质粒共转化Y2H Gold感受态细胞

3.5.2 蛋白互作检测

4 讨论

结论与展望

1 结论

2 展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢

附录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 岳金荣

导师: 柴晓杰

关键词: 杜氏盐藻,免疫共沉淀,实时荧光定量,酵母双杂交

来源: 大连海洋大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 大连海洋大学

基金: 国家自然科学基金(31472260)

分类号: Q945

DOI: 10.27821/d.cnki.gdlhy.2019.000048

总页数: 79

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