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糖苷水解酶GH5主要亚家族活性架构功能探究

2020-12-08阅读(178)

糖苷水解酶GH5主要亚家族活性架构功能探究

论文摘要

木质纤维素是地球上储量最丰富的可再生资源,其主要成分包括纤维素和各类半纤维素,如甘露聚糖和木聚糖等。通过糖苷水解酶,如纤维素酶,甘露聚糖酶和木聚糖酶催化降解,这些多糖成分可以被水解成可溶性糖,经过生物炼制可以转化为生物燃料和多种化工制品,这为解决当前世界所面临的环境污染和能源短缺提供了一个有效途径。显然,获得适用于特定工业环境的不同种类的糖苷水解酶是降低工业生产成本,加快木质纤维素转化的关键。虽然糖苷水解酶设计工作已经有很多成功的先例,但对它们的活性架构和催化过程分子机制的认识尚不深入。本文基于结构生物信息学方法,对GH5主要亚家族的纤维素酶和甘露聚糖酶进行了序列、结构和分子动态等方面的分析,定位了活性架构中与底物特异性相关的关键氨基酸残基,并对TfCe15A活性中心残基进行了丙氨酸筛选及功能分析,初步阐明GH5家族酶分子不同亚位点关键残基在酶催化中发挥的不同功能,为进一步的酶分子设计奠定了基础。本文的主要内容如下:1.通过对糖苷水解酶GH5家族中6个主要亚家族酶分子的结构生物信息学分析,阐明了不同亚家族酶分子间的主要异同点。对GH5家族主要亚家族序列、结构和分子动态分析显示,不同亚家族酶分子的主要差异存在于构成活性架构的8个loop 区域。比较不同亚家族活性中心序列谱发现,GH5家族酶分子负亚位点残基保守度最高,-1亚位点有3个残基在整个GH5家族内是完全保守的,一2亚位点也有一个色氨酸在GH5家族内完全保守,这些残基可能与催化断键密切相关;还有部分残基在单个亚家族内保守或相对保守,这些残基可能与不同亚家族之间的功能演化相关。2.通过对GH52亚家族纤维素酶和GH58甘露聚糖酶的结构分析和生化测定,发现了活性架构-1和-2亚位点关键残基在两个亚位点不同的底物识别机制。由于纤维素和甘露聚糖底物-1亚位点糖环不同程度的扭曲,在该亚位点两类底物O3空间位置存在差异,而在-2亚位点,纤维素和甘露聚糖差异在于O2的空间位置。相应地,结构比对结果显示,在-1亚位点,两个亚家族保守的组氨酸和天冬酰胺通过与-1O3的相互作用起到底物识别作用,而在-2亚位点,GH5 2亚家族相对保守的谷氨酸通过与-2O2的相互作用起到底物识别作用。3.通过对TfCe15A所有活性中心氨基酸残基的丙氨酸筛选及生化测定,揭示了活性中心残基在酶催化过程中发挥的不同作用。对TfCel5A活性中心共22个关键氨基酸进行了丙氨酸突变及结合常数Ka和酶活测定,并分析了关键残基在酶催化中发挥的功能。Ka测定结果显示,负亚位点残基在底物结合中至关重要,其中-2亚位点保守的色氨酸和-2/-3亚位点相对保守的带电残基对通过与底物-2/-3亚位点形成密集的氢键网络在底物初始结合中发挥了重要作用。酶活测定显示,-2到+1亚位点残基在催化断键中至关重要,其中与-1O2相互作用的保守组氨酸和酪氨酸通过稳定亲核试剂并维持其带电状态来协助催化断键;与-1O3相互作用的保守组氨酸和天冬酰胺通过与底物间的相互作用协助-1亚位点糖环的扭曲,该过程需要loop3较大幅度的运动;此外,-2和+1亚位点两个保守色氨酸也参与底物形变过程;根据相关残基在GH5家族中的高保守度可知,它们在催化断键中发挥的重要作用在整个GH5家族中是一致的。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略词表
  • 第一章 绪论
  •   1.1 植物细胞壁多糖的结构及合成酶系
  •     1.1.1 纤维素的结构及合成酶系
  •     1.1.2 半纤维素的结构及合成酶系
  •     1.1.3 果胶的结构及合成酶系
  •   1.2 植物细胞壁多糖的降解酶系
  •     1.2.1 纤维素降解酶系
  •     1.2.2 半纤维素降解酶系
  •     1.2.3 果胶降解酶系
  •   1.3 糖苷水解酶活性架构
  •     1.3.1 活性架构对底物特异性的影响
  •     1.3.2 活性架构对酶活力的影响
  •   1.4 糖苷水解酶GH5家族结构及亚家族分类
  • 8结构'>    1.4.1 GH5家族（β/α）8结构
  •     1.4.2 GH5家族催化机制
  •     1.4.3 GH5家族亚家族分类与底物特异性
  •   1.5 立题依据
  • 第二章 GH5主要亚家族结构生物信息学分析
  •   2.1 材料与方法
  •     2.1.1 主要软件
  •     2.1.2 主要仪器设备
  •     2.1.3 GH5主要亚家族分子进化树的构建
  •     2.1.4 GH5主要亚家族蛋白序列比对图谱的构建
  •     2.1.5 GH5主要亚家族的结构比对
  •     2.1.6 GH5主要亚家族构象动态分析
  •     2.1.7 GH5主要亚家族活性中心序列谱的绘制
  •   2.2 结果与讨论
  •     2.2.1 GH5主要亚家族分子进化分析
  •     2.2.2 GH5主要亚家族蛋白序列比对
  •     2.2.3 GH5主要亚家族结构分析
  •     2.2.4 GH5主要亚家族构象动态分析
  •     2.2.5 GH5主要亚家族活性中心序列谱分析
  •   2.3 本章小结
  • 2与GH58底物特异性差异分析'>第三章 GH52与GH58底物特异性差异分析
  •   3.1 材料与方法
  •     3.1.1 菌株和质粒
  •     3.1.2 主要药品和试剂
  •     3.1.3 主要缓冲液
  •     3.1.4 培养基
  •     3.1.5 主要仪器设备
  •     3.1.6 TfCel5A和TfMan5A的异源表达与纯化
  •     3.1.7 TfCel5A和TfMan5A最适pH与最适温度的测定
  •     3.1.8 TfCel5A和TfMan5A酶活与催化动力学常数的测定
  •     3.1.9 不同多糖降解产物谱测定与分析
  •     3.1.10 高侧链取代度半乳甘露寡糖的鉴定
  • 2和GH58亚家族酶底物特异性差异分析'>    3.1.11 GH52和GH58亚家族酶底物特异性差异分析
  •   3.2 结果与讨论
  •     3.2.1 TfCel5A和TfMan5A的异源表达及生化性质测定
  •     3.2.2 TfCel5A和TfMan5A的酶活和底物特异性测定
  •     3.2.3 TfMan5A活性架构对高侧链取代度半乳甘露寡糖的不容性
  • 2纤维素酶与GH58甘露聚糖酶底物特异性差异分析'>    3.2.4 GH52纤维素酶与GH58甘露聚糖酶底物特异性差异分析
  •   3.3 本章小结
  • 2活性架构关键残基功能探究'>第四章 GH52活性架构关键残基功能探究
  •   4.1 材料与方法
  •     4.1.1 菌株和质粒
  •     4.1.2 主要药品和试剂
  •     4.1.3 主要缓冲液
  •     4.1.4 培养基
  •     4.1.5 主要仪器设备
  • 2活性中心序列谱的绘制'>    4.1.6 TfCel5A活性中心残基的选取与GH52活性中心序列谱的绘制
  •     4.1.7 TfCel5A活性中心残基的丙氨酸筛选
  •     4.1.8 TfCel5A活性中心残基丙氨酸突变体的底物结合力测定
  •     4.1.9 TfCel5A活性中心残基丙氨酸突变体的酶活测定
  • 2亚家族酶底物结合前后活性架构构象动态比较'>    4.1.10 GH52亚家族酶底物结合前后活性架构构象动态比较
  •   4.2 结果与讨论
  •     4.2.1 TfCel5A活性中心残基统计分析
  •     4.2.2 TfCel5A活性中心残基丙氨酸突变体底物结合力测定
  •     4.2.3 TfCel5A活性中心残基丙氨酸突变体酶活测定
  • 2亚家族底物结合前后活性架构构象动态比较'>    4.2.4 GH52亚家族底物结合前后活性架构构象动态比较
  •     4.2.5 GH5家族酶分子催化循环
  •   4.3 本章小结
  • 全文总结与展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读学位期间发表的论文
  • 学位论文评阅及答辩情况表

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 田震楠

    导师: 王禄山

    关键词: 糖苷水解酶家族,亚家族,活性架构,结构生物信息学,底物识别

    来源: 山东大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 山东大学

    分类号: Q55

    总页数: 104

    文件大小: 7778K

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