基于Cre/loxP改进增强子捕获研究肝脏和胰腺β细胞的发育和再生

论文摘要

肝脏和胰腺是来源于胚胎内胚层的两个重要的消化器官。肝脏在新陈代谢过程中发挥着广泛的作用,包括糖类代谢,脂类的体内平衡和酮体的产生,氨基酸的新陈代谢,对摄入各类化合物的解毒以及维持血液中代谢物和蛋白质的生理浓度。肝实质细胞（占肝脏细胞类型70-75%）负责执行绝大多数这些肝功能,并且和胆管上皮细胞（占肝脏细胞类型10-15%）一起组成肝实质。胰腺分别由执行内分泌功能和外分泌功能的两类腺体构成。外分泌腺细胞产生并且分泌消化酶,占整个胰腺细胞质量的95%。四种胰腺内分泌细胞负责产生不同的胰腺激素,α细胞产生胰高血糖素,β细胞产生胰岛素,δ细胞产生抑生长素,PP细胞产生胰腺多肽。斑马鱼和哺乳动物的肝脏和胰腺在发育的分子调控方面显示出惊人的相似性,它们拥有相同的细胞和亚细胞结构,并且共同拥有保守的生理学功能。所有这些标准都使得斑马鱼能作为一种研究肝脏和胰腺β细胞发育和再生的可靠动物模型。成体中的肝胰器官都具有维持组织更新和损伤后再生的能力,既可以是通过剩余细胞复制而来,也可以通过多潜能的前体细胞分化而来,或则由其他类型的细胞转分化而来。哺乳动物的研究提供了以上所有机制都存在的证据,具体由哪种机制参与肝胰器官的稳态维持和损伤后的再生应答取决于具体的实验操作和分析方法。但是,具体有哪些前体细胞或分化的细胞能贡献给肝胰组织的稳态平衡或者损伤后的再生,以及控制这个过程的分子途径仍然充满了未知。因此去寻找参与肝脏和胰腺β细胞维持稳态或者参与损伤后再生的前体细胞,以及控制这一过程的关键调控基因将是非常引人入胜的研究。目前还未见到肝脏和胰腺β细胞在正常发育和损伤后再生过程中,能直观地在活体中反映特异基因表达的方法手段。在本研究中,我们以组织特异性标记肝脏和胰腺β细胞的转基因斑马鱼为动物模型,结合增强子捕获,大规模地筛选参与肝胰发育,维持生理功能和损伤后再生的相关基因。我们分别构建了标记肝实质和胰腺β细胞的转基因斑马鱼,Tg（fabp10:loxPCFPNTR-loxP-DsRed）和Tg（ins:loxP-CFPNTR-loxP-DsRed）,然后再与Tg（10×UAS:Cre,cryaa:Venus）杂交,分别得到以Cre/loxp系统为基础的标记肝脏和胰腺的双转基因鱼Tg（fabp10:loxP-CFPNTR-loxP-DsRed;10×UAS:Cre,cryaa:Venus）和Tg（ins:loxP-CFPNTR-loxP-DsRed;10×UAS:Cre,cryaa:Venus）。与CFP荧光蛋白所融合的硝基还原酶NTR能把无害的剧毒前体MtZ还原为剧毒,从而导致所含NTR的细胞的死亡。我们发现在10毫摩尔浓度MtZ处理24小时后,肝实质细胞和胰腺β细胞都能被完全地诱导凋亡,并且在撤除药物后的24小时和48小时出现明显的再生。通过大量注射含有转座子原件Tol2的GAL4到1细胞期胚胎,我们构建了1000条增强子捕获的F0.在肝脏和胰腺的转基因鱼Tg（fabp10:loxPCFPNTR-loxP-DsRed;10×UAS:Cre,cryaa:Venus）和Tg（ins:loxP-CFPNTR-loxPDsRed;10×UAS:Cre,cryaa:Venus）中,含有在上游激活元件UAS控制下表达的同源重组酶CRE,只有当UAS元件被GAL4转录因子结合的情况下,Cre才能在细胞质表达。让这些增强子捕获F0分别与标记肝脏和胰腺的Tg（fabp10:loxPCFPNTR-loxP-DsRed;10×UAS:Cre,cryaa:Venus）和Tg（ins:loxP-CFPNTR-loxPDsRed;10×UAS:Cre,cryaa:Venus）杂交,然后观察肝脏和胰腺β细胞的荧光标记的颜色变化,从而筛选潜在的肝胰特异性插入。通过1000次杂交筛选,我们得到了一些能使肝脏和胰腺β细胞从蓝色标记变成红色标记的增强子插入,然后定位插入的基因组位置。所有靠近插入位置的候选基因都用原为杂交鉴定能否在肝胰特异性表达的基因。同时运用转基因品系的优势,用能在硝基还原酶Nitroreductase作用下变成细胞毒素的甲硝唑Mtz,特异性的损伤了肝脏实质细胞和胰腺β细胞,并且对这两类细胞的再生过程进行了筛选。我们运用此种方法在肝脏和胰腺β细胞发育和再生过程中,都鉴定出了组织特异性表达的基因,并且对此永久谱系标记方法与传统增强子捕获的效果进行了比较,我们发现基于Cre/LoxP的增强子捕获能筛选到发育再生过程中瞬间表达和相对较弱表达的基因。值得注意的是,在肝脏发育过程中表达的基因rnd2,在β细胞发育过程中表达的基因rab3da和在肝脏再生过程中表达的基因ensab在此改进的筛选中表现出比传统增强子捕获更高的效率。因此,运用永久标记的增强子捕获为筛选器官发育和再生过程中较弱表达,瞬时表达又潜在重要的基因提供了有运用前景的方法。

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Abstract

第1章综述

1.1 肝脏的功能和肝病

1.1.1 肝脏的结构功能

1.1.2 我国肝病的流行以及肝病发病机制

1.2 肝脏再生研究与临床治疗

1.2.1 肝实质细胞再生

1.2.2 肝前体细胞再生

1.2.3 肝脏成体干细胞及其调控机制

1.2.4 肝细胞移植治疗

1.3 胰内分泌腺和糖尿病

1.4 胰内分泌腺β细胞再生研究和糖尿病的治疗

1.4.1 胰内分泌腺β细胞的再生来源

1.4.2 产生全新胰腺内分泌细胞的策略

1.4.3 糖尿病治疗前景

1.5 增强子和基因捕获在斑马鱼基因表达中的运用

1.5.1 增强子和基因捕获的载体结构

1.5.2 转座子整合到基因组的效率

1.5.3 增强子捕获作为组织特异性的标记

第2章材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验用动物以及饲养条件

2.1.2 实验用的试剂、耗材和仪器

2.1.3 主要实验仪器

2.1.4 菌株和质粒

2.1.5 LB培养基

2.1.6 各种缓冲液的配制

2.1.7 Antibody staining相关溶液的配制

2.1.8 蛋白质免疫印记相关溶剂

2.1.9 分子克隆相关溶液

2.2 实验方法

2.2.1 DNA和 RNA提取

2.2.2 核酸琼脂糖凝胶制备

2.2.3 用全胚或鱼鳞制备基因组模板

2.2.4 cDNA的制备

2.2.5 PCR

2.2.6 载体构建

2.2.7 制备大肠杆菌DH5α感受态

2.2.8 大肠杆菌的转化

2.2.9 挑选并鉴定阳性克隆

2.2.10 纯化质粒

2.2.11 制备anti sense RNA探针

2.2.12 纯化探针

2.2.13 斑马鱼whole mount原位杂交

2.2.14 抗体染色

2.2.15 合成mRNA

2.2.16 纯化mRNA

2.2.17 注射斑马鱼胚胎

2.2.18 增强子捕获Founder的转座效率分析

2.2.19 反向PCR鉴定增强子插入

2.2.20 CRISPR/Cas9 定点突变

第3章实验结果

3.1 引言

3.2 构建基于Cre/loxP的双转基因鱼系,分别标记肝脏和胰腺β细胞

3.2.1 质粒构建

3.2.2 Tg（fabp10:loxP-CFPNTR-loxP-DsRed;10XUAS:Cre,cryaa:Venus）和Tg（ins:loxP-CFPNTR-loxP-DsRed;10XUAS:Cre,cryaa:Venus）转基因报告鱼系的构建

3.3 规模产生增强子捕获鱼系

3.4 增强子捕获筛选和鉴定肝脏和胰腺β细胞表达基因的流程

3.5 rnd2 为肝脏特异发育过程中特异表达的基因

3.6 rab3da为胰腺β细胞发育过程中特异表达的基因

3.7 Cre/loxp-based增强子捕获筛选参与器官再生的基因

第4章实验总结与讨论

4.1 实验总结

4.1.1 基于Cre/loxP的增强子捕获提高了筛选器官的靶向性

4.1.2 基于Cre/loxP的增强子捕获能高效筛选表达较弱或者瞬时表达的基因

4.1.3 基于Cre/loxP的增强子捕获为再生器官的谱系追踪提供了思路

4.2 讨论

4.2.1 转基因鱼的构建

4.2.2 增强子捕获筛选

4.2.3 目标基因的鉴定

4.2.4 Cre/Loxp增强子捕获的运用前景

参考文献

致谢

博士在读期间发表的论文及科研工作

文章来源

类型: 博士论文

作者: 钟亚东

导师: 罗凌飞

关键词: 增强子捕获,肝脏,胰腺细胞,发育,再生

来源: 西南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 西南大学

基金: 973国家重大科学研究计划“发育与生殖研究”领域项目(2015CB942800),国家自然科学基金重点项目(31730060,31330051,),111引智基地项目(B14037)

分类号: Q344

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