草鱼GRP78抵抗由重金属离子诱发的ER应激及IKKβ影响UPR通路的分子机制

论文摘要

当发生氧化应激,细菌感染和病毒入侵等引起的内质网腔中未折叠或错误折叠的蛋白质的积累时,会激活未折叠蛋白反应（UPR）,它作为调节系统,帮助细胞内质网恢复稳态。作为热休克蛋白70（Heat shock protein 70,HSP70）家族的重要成员,葡萄糖调节蛋白78kDa（glucose-regulated protein 78,GRP78）可以在热应激下显著提高细胞存活率。最近的研究表明,GRP78的表达可以增加重金属胁迫下的细胞活性。重金属离子是可以在生物体中积累的重要环境污染物之一,一旦超过阈值就会产生毒性或致癌作用。本研究以Pb2+、Hg2+、Cd2+三种最具代表性的重金属离子刺激CIK（Ctenopharyngodon idellus kindey）细胞。结果表明,Pb2+,Hg2+和Cd2+胁迫下细胞活力显着下降。随着重金属离子刺激时间增加或浓度增大,观察到细胞死亡率明显升高。其中,Hg2+对细胞的毒害作用最大。在相同的胁迫条件下,Hg2+导致50%的细胞死亡,Cd2+和Pb2+分别导致45%和35%的细胞死亡。免疫印迹（Western bloting）结果显示,在Pb2+,Hg2+和Cd2+胁迫下,CIK细胞Ci GRP78蛋白表达水平明显增强,这意味着CiGRP78参与了重金属细胞毒作用。为了进一步研究Ci GRP78在细胞保护中的作用,我们设计了针对CiGRP78的siRNA并将其转染到CIK细胞中以沉默内源性CiGRP78。在HgCl2孵育12小时时,敲降后的细胞活率从50%显著降低至21%。我们的研究结果表明,CiGRP78（Ctenopharyngodon idellus glucose-regulated protein 78）在一定程度上保护细胞免受重金属毒害。重金属刺激会影响基本的细胞生理活动,并导致严重的毒理学影响。Pb2+可通过蛋白质变性,改变细胞内钙稳态和诱导细胞死亡,来激活内质网（endoplasmic reticulum,ER）应激反应。作为内质网驻留蛋白,葡萄糖调节蛋白78-kDa可以减轻Pb2+诱导的ER应激并增强细胞活力。在本研究中,我们对CiGRP78如何发挥其保护功能的机制做了研究。利用金属离子亲和柱洗脱法和荧光光谱分析,我们发现CiGRP78可分别与钙离子,铅离子和镉离子形成复合物,特别是与体外铅离子形成复合物。然而,另一种内质网驻留蛋白Ci GRP94（Ctenopharyngodon idellus GRP94）却不能与Pb2+结合,表明CiGRP78和CiGRP94在调节重金属细胞毒性中可能存在的功能分化。我们的研究结果表明,CiGRP78可能通过与Pb2+的直接相互作用增加细胞对Pb2+的耐受性。重金属离子引起ER应激,并激活未折叠蛋白（unfolded protein response,UPR）反应。在哺乳动物中,未折叠蛋白反应信号通路也涉及免疫应答,包括对经典的核转录因子κB（Nuclear Factor-κB,NF-κB）信号通路的影响。最近的研究表明,Inhibitor of NF-κB kinaseβ（IKKβ）作为NF-κB通路中的关键激酶,参与UPR相关的炎症反应,并在ER应激诱导的细胞死亡中起重要作用。然而,关于它们之间存在信号交叉的分子机制还有待阐明。在我们过去的研究中,证明了IKKβ在哺乳动物和鱼类之间具有功能保守性,它也可以激活NF-κB信号通路。在本研究中,我们发现在内质网应激状态下,核中的Ctenopharyngodon idellus IKKβ（Ci IKKβ）水平升高,并且CiIKKβ可与草鱼UPR信号通路中的关键因子CiXBP1S相互作用。CIK细胞的荧光组织化学表明Ci IKKβ和Ci XBP1S在内质网应激状态下存在共定位。此外,CIK细胞中Ci IKKβ的过表达通过调节UPR信号传导增强了对内质网应激的耐受性,并导致细胞活力的显着增加。这些研究结果为免疫应答和内质网应激之间的分子相互作用提供了新的见解。

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摘要

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第一章文献综述

1.1 重金属离子的毒害作用

1.2 内质网应激反应（ER stress）与葡萄糖调节蛋白GRP78

1.3 未折叠蛋白反应（UPR）

1.3.1 未折叠蛋白反应UPR信号通路概述

1.3.2 PERK信号通路

1.3.3 ATF6 信号通路

1.3.4 IRE1 信号通路

1.4 UPR信号通路的生物学功能

1.4.1 UPR促细胞存活

1.4.2 促细胞凋亡

1.4.3 促细胞自噬

1.4.4 UPR参与免疫反应

1.4.5 UPR与肿瘤发生

1.4.6 非经典UPR信号通路激活机制

1.5 鱼类UPR通路的研究现状

1.6 本研究的目的及意义

1.6.1 开展本研究的目的及其意义

第二章材料与方法

2.1 材料

2.1.1 试剂

2.1.2 引物

2.1.3 质粒

2.1.4 siRNA

2.1.5 抗体

2.1.6 细胞和菌株

2.1.7 常用溶液配制

2.1.8 仪器与设备

2.1.9 软件

2.2 方法

2.2.1 PCR

2.2.2 质粒构建和扩增

2.2.3 RNA抽提

2.2.4 RT-PCR

2.2.5 Western Blotting

2.2.6 离子交换层析柱制备

2.2.7 细胞培养

2.2.8 转染

2.2.9 细胞活性检测

2.2.10 免疫共沉淀

2.2.11 免疫荧光染色

第三章结果与分析

3.1 重金属离子激活内质网

3.1.1 草鱼CIK细胞中内质网分子伴侣GRP78 蛋白的表达

2+,Hg²⁺或Cd²⁺对草鱼肾细胞的影响'> 3.2 Pb²⁺,Hg²⁺或Cd²⁺对草鱼肾细胞的影响

2+,Hg²⁺or Cd²⁺上调Ci GRP78 的表达'> 3.3 Pb²⁺,Hg²⁺or Cd²⁺上调Ci GRP78 的表达

3.4 CiGRP78 在细胞对抗重金属刺激时起到保护作用

3.5 细胞内与重金属离子亲和蛋白的提取

2+,Pb²⁺和Cd²⁺的结合'> 3.6 CiGRP78 蛋白与Ca²⁺,Pb²⁺和Cd²⁺的结合

2+,Pb²⁺和Cd²⁺的结合强弱'> 3.7 CiGRP78 蛋白与Ca²⁺,Pb²⁺和Cd²⁺的结合强弱

2+与GRP94 亲和分析'> 3.8 Pb²⁺与GRP94 亲和分析

2+,Pb²⁺和Cd²⁺三种金属离子存在时,CiGRP78 蛋白的荧光光谱'> 3.9 不同浓度的Ca²⁺,Pb²⁺和Cd²⁺三种金属离子存在时,CiGRP78 蛋白的荧光光谱

3.10 非经典通路激活内质网应激与UPR

3.10.1 CiXBP1S和CiIKKβ蛋白的细胞内共定位

3.10.2 CiIKKβ和CiXBP1S蛋白的相互作用

3.10.3 CiIKKβ蛋白在细胞内核质分布情况

3.10.4 过表达CiIKKβ增加了TM刺激下的细胞活性

3.10.5 过表达CiIKKβ影响UPR通路相关基因的转录

3.10.6 干扰或过表达CiXBP1S基因不影响CiIKKβ基因的转录水平

第四章讨论

4.1 重金属离子的细胞毒性

4.2内质网与UPR反应的感受器GRP78

4.3 重金属离子诱导GRP78上调的机理

4.4 iKKβ激活UPR信号通路

第五章主要结论、创新点及研究展望

5.1 主要结论

5.1.1 重金属盐离子诱导CIK细胞内质网应激

2+细胞毒性中的保护机制'> 5.1.2 CiGRP78在CIK细胞对抗Pb²⁺细胞毒性中的保护机制

5.1.3 UPR通过非经典信号通路激活的研究

5.2 创新点

5.3 研究展望

致谢

参考文献

附录1 缩略语

附录2 吉玛基因推荐 si RNA 转染贴壁细胞接种量和培养基体积

附录3 吉玛基因推荐不同的细胞培养板siRNA 转染的使用量

攻读学位期间的研究成果

文章来源

类型: 博士论文

作者: 衷彬

导师: 胡成钰

关键词: 重金属离子,内质网应激,未折叠反应,草鱼

来源: 南昌大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,环境科学与资源利用

单位: 南昌大学

分类号: X171.5

DOI: 10.27232/d.cnki.gnchu.2019.000052

总页数: 106

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草鱼GRP78抵抗由重金属离子诱发的ER应激及IKKβ影响UPR通路的分子机制

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