康乐, 叶兴国, 徐惠君, 杜丽璞[1]2005年在《葡萄糖氧化酶基因转化小麦的研究》文中研究指明葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase,GO)在植物抵抗真菌和细菌感染时起重要作用,但将GO基因转入小麦的研究目前还未见报道。本研究利用基因枪介导法将来源于黑曲霉的GO基因转入优良小麦品种扬麦10号、鲁麦22和鲁麦23,从轰击的3300块幼胚愈伤组织中,获得了246棵再生植株,经PCR鉴定,其中的31棵含有GO基因,PCR阳性植株比例为0.94%。T1代经Southernblotting分析,证明GO基因已整合到小麦基因组中。T2代植株淀粉碘化钾染色结果证实GO基因已在蛋白质水平表达。对T2代植株进行了白粉病抗性鉴定,结果在34个转基因株系中有23个株系的病情指数低于相应的非转基因对照。T1代转基因植株经PCR分析,筛选到48株含有GO基因而不带有筛选标记基因(bar)的植株。
康乐, 吴成君, 叶兴国, 徐惠君, 杜丽璞[2]2003年在《葡萄糖氧化酶基因转化小麦的研究》文中进行了进一步梳理葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase, GO)在植物抵抗真菌和细菌感染时起重要作用。本研究的目的是利用基因枪介导法将来源于黑曲霉的GO基因转入优良小麦品种扬麦10号、鲁麦22号和鲁麦23号,从轰击的3300块幼胚愈伤组织中,获得了246棵再生植株,经PCR分析,证明有31个T0代植株含有GO基因,转化率为0.94%,20个T1代株系已整合进了GO基因。
余建坤[3]2006年在《农业生物技术可持续性评价体系的研究》文中研究表明可持续农业是21世纪农业发展的主要模式，生物技术是农业可持续发展的重要技术支撑和保障。农业可持续发展需要什么样的生物技术来支撑，如何根据可持续发展的要求来规范和引导生物技术的发展，从而找到一个生物技术与可持续农业的有效结合点，这是本论文研究的总体思路。 1．系统阐述了各类型农业生物技术的内涵、研究进展和成效。现代生物技术是一个复杂的技术群，包括基因工程、细胞工程、微生物工程、酶(蛋白质)工程等4大工程技术。对农业4大生物工程技术特别是基因工程技术的进展(以转基因作物类型为重点)，作了较为全面系统的阐述，为构建评价体系奠定基础。 2．根据农业生物技术的生态安全性的要求，建立了其安全性评价的指标体系，主要包括：(1)水平基因转移。评价了GMOs(转基因生物)在自然环境中水平基因转移的可能途径及其研究方法；(2)非靶标效应。阐述了转基因植物对植食性昆虫的影响、通过食物链产生的间接影响、对土壤微生物群落的影响、对水生生物的影响、对鸟类的影响以及对生物多样性的影响；(3)有害生物抗性的产生与发展。重点阐述了对Bt的抗性及治理策略；(4)转基因植物的入侵能力。阐述其主要途径是通过生物群体的自身繁衍与扩散和通过基因渗入向野生种群扩散；(5)目的基因的重组与稳定性。主要是目的基因特别是病毒基因在转基因植物中的位移、重组和稳定性产生的影响；(6)对哺乳动物的影响。主要是转基因植物对哺乳动物的毒性和转基因食品中的过敏原问题。对人体健康的影响需要进行潜在风险总体评估和人体安全专项评估，分析了直接影响和间接影响。上述指标主要为定性指标，对具体的生物技术产品，组织针对这六个方面的试验，只要其中一项指标达不到要求，即存在环境安全隐患，则不考虑对其进行进一步综合评估和应用推广。同时，结合典型事例，对农业生物技术生态安全性评价各指标进行了分述。 3．构建了农业生物技术可持续性评价体系。以转基因作物为对象，借鉴国内外可持续性综合评价的方法，本着简明、实用和可操作性原则，从生态、经济、社会等方面，构建一个能够比较科学的农业生物技术可持续性评价体系。在综合评价指标体系中，生态评价是在农业生物技术环境安全性评价的基础上，进一步考察农业生物技术
康乐[4]2004年在《葡萄糖氧化酶基因转化小麦的研究》文中研究说明论文编号:中国习丸从匕年牛肖六协赶 学位论文 葡萄糖氧化酶基因转化小麦的研究Transferring of Glueose Oxidase Gene into Whe
黄亮[5]2007年在《黑曲霉A9葡萄糖氧化酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达》文中指出葡萄糖氧化酶(GOD)在食品、医药及生物等领域有着广泛的应用。本试验以黑曲霉A9为出发菌株，研究了GOD基因在毕赤酵母GS115中的表达。本试验根据已发表的GOD基因序列设计一对引物，以黑曲霉A9基因组为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)直接对GOD基因进行PCR扩增，再将PCR产物克隆入pMD18-T载体，经DNA测序，该基因为1743 bp，编码581个氨基酸。该基因序列已在GeneBank注册，登录号为DQ836361。将测序确认正确的GOD基因克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K中，获得酵母表达质粒pPIC9K／GOD，表达质粒pPIC9K／GOD经线性化后，采用电转化法转化毕赤酵母。通过调整参数，对影响电转化效率的主要因素进行探索，建立了质粒pPIC9K／GOD对毕赤酵母的高效电转化方法。通过MD和MM平板、PCR方法筛选和鉴定转化子。转化子发酵液经SDS-PAGE分析和GOD活力测定等方法鉴定，表明GOD基因在毕赤酵母中得到表达。摇瓶诱导168 h，酶活达到17.35 U／mL，蛋白含量达到659.56μg／mL。经SDS-PAGE测定，单亚基的分子量约为90，000 Da。硫酸-苯酚法测得其糖基化程度为33.4％。葡萄糖氧化酶底物专一性强，以葡萄糖为底物，采用双倒数作图法，测定其Km值为38.04 mmol／L，Vmax值为37.88μmol／min。酶学性质检测发现，重组酵母GOD的最适温度为38℃，比出发菌株提高了8℃。酶蛋白在20～50℃范围内热稳定性很好，温度超过60℃下降显着。酶蛋白在pH5.0～5.5范围内酶活基本不变，在pH6.0～8.0范围内也较稳定，酶活均保持在72％以上。Ag~+、Hg~(2+)、亚硫酸氢钠对酶蛋白有强烈的抑制作用，Cu~(2+)、Fe~(2+)、去氧胆酸钠表现稍微的抑制作用，而Ca~(2+)、Fe~(3+)、EDTA和SDS具有不同程度的激活作用。
罗时渝[6]2018年在《葡萄糖氧化酶在无孢黑曲霉中的高效重组表达及酶学性质研究》文中提出葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,EC 1.1.3.4,GOD)是一种黄素依赖型氧化还原酶,它能专一的催化β-D-葡萄糖分解成葡萄糖酸内酯和过氧化氢。葡萄糖氧化酶在纺织业、畜牧业、食品业、医疗医药业等众多领域均有广泛的应用。目前食品级葡萄糖氧化酶的工业生产产量不高,发酵副产物比较多,不利于分离纯化,这些问题对食品级葡萄糖氧化酶的发酵生产产生了不利影响。本文选择黑曲霉CBS513.88的葡萄糖氧化酶基因之一goxC,通过密码子优化、信号肽替换对GOD编码区进行改造,提高发酵液酶活;同时以实验室前期构建的低蛋白背景菌黑曲霉SH2和HL1为出发菌株,利用营养缺陷标记pyrG构建葡萄糖氧化酶表达载体系统,进一步提高GOD的分泌表达。主要结论包含以下几方面:(1)以SH2为宿主的葡萄糖氧化酶重组表达:从NCBI中找到Aspergillus niger CBS513.88中葡萄糖氧化酶相关的4个基因,通过文献查找、BLAST分析及进化树分析选择goxC基因,以SH2为宿主构建GOD重组菌株。通过邻联茴香胺-过氧化氢酶法,测转化子的酶活,发现SH2-goxC5号转化子酶活最高,在第7d时可达563.8 U/mL;50L上罐发酵在179h时酶活为最高,高达1128 U/mL,相比摇瓶提高了2倍多。(2)以HL1为宿主的葡萄糖氧化酶重组表达:为了探究敲除转录因子prtT及一系列淀粉酶对黑曲霉发酵培养中营养物质利用的影响,以未敲除prtT基因的HL1作为出发菌来构建葡萄糖氧化酶高效表达重组菌株,筛选出表达量最高的HL1-goxC9号转化子,达到635.1U/mL。同时通过0%~5%葡萄糖浓度的摇瓶发酵并检测酶活探究葡萄糖浓度对发酵的影响,发现0%葡萄糖浓度的摇瓶在72h时酶活力达到最高为658.3 U/mL,1%葡萄糖浓度的摇瓶在120h时酶活力达到了599.3 U/mL,发现随着培养基中葡萄糖浓度的提高,达到最高酶活的小时数也随之延长。(3)葡萄糖氧化酶酶学性质研究:通过亲和层析纯化葡萄糖氧化酶,并通过SDS-PAGE发现葡萄糖氧化酶分子量大小为80kDa左右,去糖基化后发现其分子量大小降为65kDa左右,说明重组葡萄糖氧化酶含有糖基化修饰。重组葡萄糖氧化酶最适pH为5.5,最适温度为40℃。同时在10 mmol/L浓度下,Ni~+、Ca~(2+)、K~+、Zn~(2+)、Mg~(2+)、Mn~(2+)增加葡萄糖氧化酶的活力;EDTA、Fe~(3+)对葡萄糖氧化酶酶活影响很小;SDS或Na~+明显降低葡萄糖氧化酶活力。在100 mmol/L浓度下,SDS、Ni~+、K~+、Mn~(2+)使葡萄糖氧化酶活力增加;EDTA、Na~+明显降低葡萄糖氧化酶活力;Ca~(2+)、Zn~(2+)、Fe~(3+)、Mg~(2+)对葡萄糖氧化酶酶活影响很小。
苏君艺[7]2012年在《小麦脱水素基因wzy2 RNA干扰表达载体的构建及遗传转化》文中研究表明干旱是限制农业生产的一个重要的环境因素，全球干旱、半干旱地区约占土地总面积的36%，占耕地面积的43%。我国干旱、半干旱地区面积约占全国土地面积的二分之一，主要分布于西北地区。小麦是主要粮食作物之一，干旱影响植物的生长发育，造成10%-20%的作物减产。因此，研究小麦的抗旱机理对粮食增产具有重要意义。脱水素是胚胎发育晚期积累的蛋白之一，属于热稳定的水溶性蛋白，它受寒冷、高温、干旱以及盐胁迫等逆境诱导，对保护生物代谢可能起到分子伴侣的作用，对细胞膜结构的稳定性起保护作用，从而减轻干旱对植物造成的伤害。wzy2基因是本实验室从水分胁迫的郑引1号小麦中克隆获得的新脱水素成员，但有关它在抗旱中的作用仍不清楚。RNA干扰技术具有高效性、特异性，在目的基因转录后可以沉默或剔除目的基因的表达，得到功能缺失性突变体，已经成为研究基因功能的有力工具。本研究利用RNA干扰原理，根据同源分析，在脱水素wzy2基因序列中选择了553-737bp之间的185bp的cDNA序列作为干扰片段，将克隆的干扰片段插入pKANNIBAL载体中，形成含有反向重复序列的中间载体PKANNIBAL-FR。再将反向重复序列的插入到含Ubi启动子的高效植物表达载体pAHC25的多克隆位点中。成功构建了含反向重复序列的RNA干扰表达载体pAHC-wzy2-Ri。以郑引1号小麦的幼胚为外植体，采用基因枪法轰击1500个幼胚的愈伤组织，获得再生植株103株，再生率为6.87%。利用表达载体上Bar基因的特异引物，对所获得103株T0代再生植株进行PCR分析，检测到16株Bar基因阳性植株，Bar基因阳性为1.01%。再经过反向重复序列的特异引物对所获得16株的Bar基因阳性植株进行PCR检测，获得3植转基因阳性植株，转化率为0.2%。收获3株转基因植株种子，取部分种植后获15株T1代植株，经PCR检测得到11株Bar基因阳性植株，其中2株T1代转基因植株干扰片段为阳性。为进一步研究脱水素wzy2基因功能奠定基础。
叶兴国, 徐惠君, 杜丽璞, 何光源, 王轲[8]2014年在《小麦规模化转基因技术体系构建及其应用》文中认为在主要农作物中,小麦属于遗传转化比较困难的作物,转化效率较低,重复性较差,转化规模较小,优良转基因材料较少,基因工程育种进程明显落后于大豆、玉米、棉花、水稻等作物。目前,应用于小麦中的转基因技术主要包括基因枪介导法和农杆菌介导法,有些实验室也采用花粉管通道、离子束注入、激光微束穿刺、PEG、花粉介导和农杆菌浸花等方法。在外植体利用方面,多数研究主要利用小麦幼胚及其愈伤组织作为起始转化材料,以成熟胚、幼穗、花药愈伤组织为材料转化成功的报道还比较少,需要进一步探索。在转化效率方面,基因枪报道为0.1%—16.7%,农杆菌报道为0.7%—44.8%,变化幅度较大。在目标基因转化方面,除了nptⅡ、bar、hpt、GUS、GOX、pmi、ALS等筛选基因和报告基因外,转化的功能基因主要涉及小麦品质、抗病性、耐旱性、抗蚜虫和抗除草剂等性状改良。农杆菌介导和基因枪介导转化小麦幼胚的转化效率除与受体基因型有关外,还与受体材料的生理状态有关,供体植株生长期间的温度条件、光照条件、营养条件和水分条件对转化效率有至关重要的影响,开花到幼胚取样期间适宜的昼夜温度有利于转化后胚性愈伤组织诱导和候选转基因植株的获得。从整体水平看,中国小麦转基因技术研究虽然取得了较大进展,如建立了小麦成熟胚高频率再生体系并应用于小麦转化,改进了小麦幼胚再生体系和转化体系,将一批抗病、耐旱和品质改良相关基因转入小麦,初步建立了小麦规模化转基因技术体系,但与国际先进水平相比,尤其与一些跨国生物技术公司相比,在转化规模和转化效率方面仍然存在较大差距。认为转化效率较低、基因型依赖性强、人工气候条件不够先进、转化队伍不稳定是限制中国小麦规模化转基因技术发展的瓶颈;建立主栽品种转化体系、提高转化效率、开展多基因转化、开发安全型转化技术、避免载体骨架序列插入、减少基因沉默、实现定点整合等是小麦转基因技术研究的发展趋势;通过对组织培养技术、植株再生和转化相关基因的研究,以及优良受体基因型筛选、培养基改良和各个转化影响因素的优化、集成等,克服农杆菌转化小麦的瓶颈,提高小麦转化效率,扩大转化规模。文章重点综述了基因枪和农杆菌转化技术在小麦中的应用和发展,回顾了近5年中国小麦规模化转基因技术研究进展,对于促进转基因小麦新品种培育和小麦功能基因组学研究具有一定参考价值。
孙重霞[9]2009年在《利用RNAi技术抑制籽粒PPO合成以改良小麦面粉白度的研究》文中研究说明面粉白度是衡量小麦品质的重要性状之一,受许多遗传控制和环境影响。其中,多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)是引起面条(团)颜色褐变的主要原因。由于普通小麦是异源六倍体,PPO多基因家族众多,利用天然突变和人工诱变等传统育种方法很难筛选到合适的隐性突变体。为克服传统育种的局限,利用遗传工程技术引入基因获得新性状或者消除基因去掉坏性状,已经广泛应用于改良和育种中。转录后的基因沉默(Post-Transcriptional GeneSilencing,PTGS)已广泛用于下调(down-regulate)植物代谢过程中的某些关键酶。近年来,植物RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术已经被应用于高效、特异地沉默特定的植物基因。本研究构建了籽粒ppo靶基因的RNAi载体,并以小麦胚乳特异表达启动子Dx5-P驱动,获得小麦籽粒ppo基因的RNAi载体pBAC47P+ppoIR。用基因枪法将该载体与pBAC35Sbar共转化京花1号、中优9507的小麦幼胚愈伤组织,获得了T_0代27株转基因植株。转基因植株及其后代株系经PCR和Southern杂交检测,结果表明,RNAi构件已经稳定整合到T_1代的12个株系。将筛选到的阳性植株在RNA水平上做半定量RT-PCR和Northern杂交,结果表明T_1代有20株转基因植株的籽粒中ppo基因表达水平明显低于对照。对转基因T_2代灌浆中期小麦籽粒进行PPO同功酶电泳和酶活分析结果表明,有6个株系的PPO活性有所减弱。本研究表明利用小麦籽粒特异表达的1Dx5-P启动子来启动ppo RNAi构件的表达,能显着抑制籽粒内源ppo基因的表达,降低PPO同功酶的活性,将可能会明显提高小麦面粉的白度。
贺永华[10]2006年在《根际土壤中甲磺隆除草剂快速降解及其生态化学机制》文中研究表明甲磺隆等磺酰脲类除草剂通常用于麦类等作物的阔叶杂草防治,是当今除草剂的重要种类,但其极低残留便可污染土壤,且影响后茬作物的安全性。因此,研究这类除草剂在土壤中的降解途径及其生态化学机制,对合理用药、减轻农药危害、提高土壤和水体环境质量以及保证农业可持续发展等都有重要的理论和实践意义。本研究结合土壤环境化学和环境生物技术的研究方法,从环境生态界面的角度较系统地研究了以磺酰脲类除草剂甲磺隆为代表的有机毒物在根际微生态系统中的快速降解及其生态化学机制,提出了受有机毒物污染土壤的原位植物-真菌联合修复技术。主要结论如下: (1)研究了以甲磺隆为代表的磺酰脲类除草剂对我国南方稻麦轮作区小麦(Triticum aestivum L.)根际与非根际土壤中各微生物区系种群数量和酶活性的影响。结果表明,在2μg·g~(-1)甲磺隆浓度的胁迫下,普通细菌受到了显着抑制(P<0.01),耐受细菌在前30天也显着性地受到影响,但随着根际效应的加强而逐渐减弱。甲磺隆胁迫下普通真菌的数量变化不大,但耐受真菌数量上升明显,处理根际与非根际土壤中耐受真菌数量与对照相比30天后即达到1%的显着水平。放线菌是甲磺隆胁迫下的劣势菌,至第30天处理非根际土壤中甲磺隆对普通放线菌的抑制率高达90%,耐受放线菌甚至已检测不到,可以作为甲磺隆除草剂残留污染土壤生态环境效应的评价指标。至培养结束甲磺隆胁迫下叁大类群微生物区系中真菌的相对数量略有下降,说明土壤性质并未明显降低,且对甲磺隆毒害的响应依次为放线菌>细菌>真菌。甲磺隆驯化以及作物根系生长的协同作用,共同促进了芳香族化合物分解菌的生长和繁殖,这为利用植物和微生物联合修复受芳香族化合物污染的土壤提供了理论依据。氮素转化生理群区系中固氮菌对甲磺隆不敏感;亚硝化菌和反硝化菌受毒害严重,但小麦根系的生长仍然可在一定程度上缓冲甲磺隆的抑制作用。硫化菌和反硫化细菌等硫素转化生理群区系的生长也受到了甲磺隆的强烈抑制,根际效应也很明显。污染土壤中过氧化氢酶、多酚氧化酶和脱氢酶等氧化还原酶的活性均表现为下降的趋势,都不同程度地受到了甲磺隆的抑制作用,同时根际土壤中氧化还原酶活性显着高于相应非根际土壤。土壤微生物特征总体差异主成分分析表明,甲磺隆对微生物的正常生长影响较大,但是随着培养的进行逐渐趋于缓和,这可能与其在土壤中的降解也有关,另外也可见根际微生物活性始终高于非根际土壤,表明了小麦根际对甲磺隆的
参考文献：
[1]. 葡萄糖氧化酶基因转化小麦的研究[J]. 康乐, 叶兴国, 徐惠君, 杜丽璞. 作物学报. 2005
[2]. 葡萄糖氧化酶基因转化小麦的研究[C]. 康乐, 吴成君, 叶兴国, 徐惠君, 杜丽璞. 2003年全国作物遗传育种学术研讨会论文集. 2003
[3]. 农业生物技术可持续性评价体系的研究[D]. 余建坤. 福建农林大学. 2006
[4]. 葡萄糖氧化酶基因转化小麦的研究[D]. 康乐. 中国农业科学院. 2004
[5]. 黑曲霉A9葡萄糖氧化酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达[D]. 黄亮. 河北农业大学. 2007
[6]. 葡萄糖氧化酶在无孢黑曲霉中的高效重组表达及酶学性质研究[D]. 罗时渝. 华南理工大学. 2018
[7]. 小麦脱水素基因wzy2 RNA干扰表达载体的构建及遗传转化[D]. 苏君艺. 西北农林科技大学. 2012
[8]. 小麦规模化转基因技术体系构建及其应用[J]. 叶兴国, 徐惠君, 杜丽璞, 何光源, 王轲. 中国农业科学. 2014
[9]. 利用RNAi技术抑制籽粒PPO合成以改良小麦面粉白度的研究[D]. 孙重霞. 首都师范大学. 2009
[10]. 根际土壤中甲磺隆除草剂快速降解及其生态化学机制[D]. 贺永华. 浙江大学. 2006
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