王熠杰[1]2017年在《IL-17A对哮喘气道嗜酸性粒细胞炎症的影响及其免疫机制研究》文中提出研究背景:支气管哮喘(以下简称“哮喘”)是一种具有明显异质性的慢性气道炎症性疾病。哮喘具有可逆性的气流受限、气道高反应性和慢性气道炎症等临床特征。根据哮喘的临床特征不同可以分为不同的临床表型,如过敏性和非过敏性哮喘等等。不同临床表型的哮喘其发病机制也有所不同,即存在“哮喘内型”差别。不同的内型可能解释不同哮喘“表型”的病理生理过程。目前发现内型为“Th2增高(Th2-high)”的患者,表现为过度增强的Th2型免疫应答,Th2细胞过度活化及其相关细胞因子IL-4、IL-5等的产生增多,同时气道以嗜酸性粒细胞浸润为主。临床上的过敏性哮喘为“Th2增高”的内型,通常由吸入的过敏原所诱发,具有明显的Th2型免疫反应,同时伴有气道内嗜酸性粒细胞、肥大细胞和淋巴细胞聚集,气道平滑肌的增生,以及血清Ig E的升高。IL-17A是一种主要由Th17细胞分泌的细胞因子,Th17细胞具有明显区别于Th1、Th2细胞的特征,其分化受到IFN-γ和IL-4的负性调控。IL-17A的主要生物学作用是在机体内通过引起中性粒细胞的聚集、活化,参与抵抗病原体的感染以及风湿类疾病等。IL-17A是参与中性粒细胞炎症非常重要的细胞因子。近年来研究发现哮喘患者的血和肺中IL-17A因子的浓度增高,并且和哮喘的严重程度相关,提示IL-17A可能参与了哮喘慢性气道炎症的发生和发展,特别是与中性粒细胞性哮喘有关。国内外多个研究中发现IL-17A具有促炎效应以及一定的抑炎效应,即IL-17A可能存在双重效应,研究中抑制炎症的效应可能是低浓度IL-17A所引起的。我们既往的研究发现,利用IL-17A基因敲除小鼠建立OVA诱导的哮喘模型同时给予LPS气道干预时较野生鼠的气道嗜酸性粒细胞炎症增高及脾脏Th2细胞分化增多。因此,我们假设IL-17A能通过直接抑制Th2细胞分化,减轻哮喘小鼠的气道嗜酸性粒细胞炎症。本研究通过OVA致敏和激发建立气道嗜酸性粒细胞浸润为主的哮喘小鼠模型,并观察IL-17A对哮喘小鼠气道嗜酸性粒细胞炎症以及Th2型免疫的影响及其机制。研究目的:1.探索IL-17A在哮喘小鼠气道炎症中的作用,包括肺部炎症细胞浸润程度以及BALF中细胞分类和细胞因子的变化。2.探索IL-17A在哮喘小鼠支气管淋巴结和脾脏以及体外培养中的Th2细胞分化中的作用。研究方法:第一章IL-17A对哮喘小鼠气道炎症的影响1.OVA诱导的哮喘小鼠模型的建立及气道干预处理实验分为叁组,即对照组、模型组、IL-17A处理组。在建模第1、7天,模型组和IL-17A处理组小鼠腹腔注射OVA致敏,第14-18天用1%OVA雾化1h激发,对照组均予以等量生理盐水;IL-17A处理组小鼠每次激发前1h麻醉后气道滴入100 ng IL-17A,对照组及模型组予以等量生理盐水。2.BALF、肺组织标本的检测收集BALF液计细胞总数,离心后上清用ELISA法检测IL-4、IL-5、INF-γ、IL-17A浓度,所得沉淀涂片后染色行分类计数;左肺切片后行HE及PAS染色,于显微镜下观察进行半定量评分。第二章IL-17A对哮喘Th2细胞分化的抑制作用及机制1.小鼠支气管淋巴结及脾脏Th细胞分化的检测制备淋巴结和脾脏单细胞悬液,刺激培养后利用流式细胞术检测Th1/2/17的分化比例。2.IL-17A在体外诱导幼稚CD4+T细胞向Th2细胞分化中的抑制作用制备脾脏单细胞悬液,用免疫磁珠分选幼稚CD4+T细胞,用分化因子液加或者不加30 ng IL-17A同完全培养基一起培养细胞。在48h洗涤细胞后,用仅含IL-2的完全培养基继续培养至96h。利用流式细胞术检测培养24h、96h时Th细胞分化。利用Annexin V/PI法检测孵育24h时细胞凋亡程度。相同的培养条件下利用CCK8法比较培养24h时的增殖活力。研究结果:第一章IL-17A对哮喘小鼠气道炎症的影响1.BALF中细胞总数及各类细胞计数及其比例的比较模型组较对照组小鼠BALF中的细胞总数高,具有显着的统计学差异(P<0.01),IL-17A处理组小鼠的BALF细胞总数明显低于模型组小鼠(P<0.05);模型组BALF嗜酸性粒细胞数(P<0.05)和比例(P<0.01)明显高于对照组,而IL-17A处理组嗜酸性粒细胞数(P<0.05)及其比例(P<0.01)明显低于模型组,但IL-17A处理组嗜酸性粒细胞数及其比例仍高于对照组(P<0.01);模型组及IL-17A处理组中性粒细胞数及淋巴细胞数较对照组有升高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。2.小鼠肺部支气管和血管周围炎症浸的比较对照组小鼠肺部未见有明显的炎症细胞浸润;模型组较对照组小鼠的支气管周围和血管周围有更明显的炎症细胞浸润,半定量评分更高(P<0.01);予以IL-17A气道滴入后,IL-17A处理组小鼠支气管周围和血管周围炎症浸润程度明显低于模型组小鼠,且炎症评分有显着的统计学差异(P<0.05);相比对照组,IL-17A处理组小鼠肺部的炎症浸润仍较显着(P<0.01)。3.小鼠气道杯状细胞化生程度及半定量评分比较对照组小鼠的气道中未见明显的杯状细胞化生;模型组小鼠气道中较对照组可见更多的PAS阳性细胞,半定量评分具有显着差异(P<0.01);IL-17A处理组较模型组小鼠的气道中杯状细胞化生程度低(P<0.01)。4.小鼠BALF中Th相关细胞因子的比较模型组小鼠BALF上清中的Th1相关因子IFN-γ浓度显著低于对照组(P<0.01),Th2相关因子IL-4、IL-5浓度显着高于对照组(P<0.01),IL-17A浓度也显着高于对照组(P<0.01);IL-17A处理组小鼠BALF中IL-4、IL-5浓度显着低于模型组(P<0.01),IL-17A浓度显着高于模型组(P<0.01),两组之间IFN-γ浓度无显著差异(P>0.05);IL-17A处理组小鼠IL-4(P<0.01)、IL-5(P<0.05)浓度仍显着高于对照组,IFN-γ浓度显著低于对照组(P<0.01),IL-17A浓度也显着高于对照组(P<0.01)。第二章IL-17A对哮喘Th2细胞分化的抑制作用及机制1.小鼠支气管淋巴结中Th细胞分化的比较模型组小鼠淋巴结中Th1比例低于对照组(P<0.01),Th2比例高于对照组(P<0.05),两组之间Th17比例无显着性差异(P>0.05);IL-17A处理组较模型组小鼠有更低的淋巴结Th2比例(P<0.05),两组Th1和Th17比例之间差异无统计学意义(P>0.05);IL-17A处理组Th2比例显着高于对照组小鼠(P<0.05),Th1比例显着低于对照组小鼠(P<0.01),两组小鼠Th17比例之间差异无统计学意义(P>0.05)。2.小鼠脾脏Th细胞分化程度比较模型组小鼠脾脏Th1比例低于对照组(P<0.01),Th2比例显着高于对照组(P<0.01),两组Th17比例之间无显着差异(P>0.05);给予IL-17A气道滴入后,IL-17A处理组小鼠脾脏Th2比例显着低于模型组(P<0.01),两组之间Th1和Th17均无显着差异(P>0.05);IL-17A处理组小鼠脾脏Th1细胞比例仍低于对照组(P<0.01),两组之间Th17比例差异不显着(P>0.05)。3.IL-17A在体外诱导幼稚CD4+T细胞向Th2细胞分化中的抑制作用在24h时,Th2极化组和Th2+IL-17A极化组之间细胞凋亡和增殖均无显着差异(P>0.05)。Th2+IL-17A极化组中Th2细胞分化比例在培养24h时较Th2极化组呈下降趋势(P>0.05),在培养至96h,IL-17A明显抑制Th2细胞分化(P<0.01)。研究结论:1.给OVA复制的哮喘模型气道滴入IL-17A后可减轻肺部嗜酸性粒细胞浸润和降低BALF中Th2相关因子IL-4、IL-5的浓度。而且,不导致气道中性粒细胞炎症。2.哮喘小鼠中支气管淋巴结和脾脏的Th2细胞比例明显高于对照组,IL-17A气道滴入后可以降低Th2细胞分化比例,而不影响Th1细胞比例。IL-17A在体外还可抑制幼稚CD4+T细胞向Th2细胞分化,而对其增殖和凋亡无显着影响。研究意义:哮喘的“卫生学说”认为,儿童时期接触细菌内毒素等可以通过刺激Th1细胞分化,来抑制Th2的分化,改善Th2/Th1失衡,从而减少哮喘的发病。本文的研究证实了,通过气道内给予IL-17A处理,也可以抑制Th2的分化,改善哮喘气道的嗜酸细胞性炎症。因为细菌内毒素是刺激机体Th17分化的重要原因。因此,本文结果丰富了对“卫生学说”免疫调节机制的认识。我们实验室既往的研究显示,过强的内毒素刺激可以导致过强的Th17细胞反应,从而导致哮喘气道的嗜酸细胞性炎症转换为中性粒细胞炎症,给哮喘的治疗带来困难。但我们研究所有相对较低剂量的IL-17A处理哮喘模型,并没有导致明显的中性粒细胞炎症。
赵生涛[2]2017年在《IL-17在中性粒细胞性哮喘中的作用及其调控气道炎症表型的机制研究》文中研究表明研究背景与目的支气管哮喘(简称哮喘)本质上属于气道慢性炎症疾病,遗传因素和外界环境因素均可影响其发病。全球约有叁亿哮喘患者,中国就占十分之一,而且中国是哮喘致死率最高的国家之一。支气管哮喘还具有明显异质性,不同病人之间及同一病人不同时期其哮喘临床表现、病情严重程度、治疗反应等可能不同。这种“不同”其实是个体内因(遗传因素)和外因(环境因素)共同作用的结局。以往认为嗜酸性粒细胞(Eos)在气道内聚集和浸润是哮喘的主要炎症特征或表型,但近期研究发现,哮喘病人气道内并非全部以嗜酸性粒细胞浸润为主,大量的中性粒细胞(Neu)出现在哮喘急性发作期和一些致死性哮喘发作的病人气道内。目前认为中性粒细胞浸润气道是重症哮喘气道炎症的重要表型之一,而且与糖皮质激素治疗反应性差相关。虽然只占哮喘病例的5%至10%不等,但重症哮喘病人对现有的治疗药物如吸入性糖皮质激素联合长效β2肾上腺素能受体激动剂(ICS+LABA)、白叁烯受体拮抗剂(LTRA)、茶碱、长效胆碱能受体拮抗剂(LAMA)等反应差,因此构成了哮喘防治的巨大医疗支出负担。研究中性粒细胞性哮喘表型及其病理生理机制对于哮喘的预防和治疗,尤其是对于重症哮喘、激素抵抗性哮喘的防治有着非常重要的意义。过去认为过敏性哮喘发病的免疫学机制为“Th1/Th2失衡”,气道内Th2反应增强,Th2细胞因子IL-4、IL-5和IL-13等增高,形成嗜酸性粒细胞气道炎症。在此理论基础上,研究者研发了针对Th2因子的靶向治疗药物,如抗IL-5和IL-13的单克隆抗体及人重组IL-4受体等,试图逆转Th1/Th2失衡,但一些临床试验结果并不令人满意。另一方面,使用Th1细胞因子治疗哮喘也基本无效。因此,“Th1/Th2失衡”学说不能完全阐明嗜酸性粒细胞性哮喘的发病机制,更不能解释中性粒细胞性哮喘的病理生理改变,后者可能存在不同免疫学机制。在随后的临床研究中观察到,IL-17、IL-1β、IL-6、IL-8等炎症因子在中性粒细胞性哮喘病人的诱导痰上清、支气管肺泡灌洗液(BALF)及支气管肺组织标本中表达增高,且IL-17可能与中性粒细胞性哮喘病人气道高反应性(AHR)正相关,但确切的机制仍不明。CD4+辅助性T淋巴细胞(Th)是几乎参与机体所有免疫反应的重要免疫细胞之一。IL-17及其分泌细胞CD4+Th17细胞参与了机体对病原菌如细菌、真菌、支原体、衣原体等的清除,并可引起中性粒细胞和/或单核细胞向炎症部位聚集。因此我们推测,在中性粒细胞性哮喘中,CD4+Th17细胞及其分泌的IL-17是引起气道中性粒细胞性炎症的重要机制,对此机制的深入研究可能给临床上重症哮喘的防治提供新的思路。目的本课题拟使用卵清蛋白(ovalbumin,OVA)联合脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对C57BL/6J小鼠进行致敏以建立哮喘中性粒细胞性炎症模型,并与单纯OVA致敏的嗜酸性粒细胞性炎症模型相比较:气道炎症特点、AHR、BALF中炎症因子表达及脾脏、淋巴结CD4+Th细胞分化情况。最后利用IL-17基因敲除小鼠探讨Th17/IL-17在哮喘中性粒细胞性炎症形成中的作用及机制。方法1.C57BL/6J小鼠30只随机分为3组:对照组(NS组),嗜酸性粒细胞性哮喘组(OVA组)和中性粒细胞性哮喘组(OVA+LPS组),每组10只。于实验第1天、7天致敏小鼠,麻醉小鼠后腹腔注射OVA(50μg)与等容积氢氧化铝混合液100μl,经鼻腔缓缓滴入0.2%OVA 50μl(OVA组)或加LPS 1μg(OVA+LPS组);NS组小鼠给予等体积的生理盐水致敏。实验第14天开始,用1%OVA液进行雾化激发小鼠(OVA组和OVA+LPS组),每次1小时,每天1次,连续5天,对照组用生理盐水代替OVA激发。2.完成激发后的小鼠行气道高反应性(AHR)测定及支气管肺泡灌洗(BAL),对BALF细胞进行计数并分类,BALF上清用ELISA方法检测IL-1β、IL-4、IL-5、IL-8、IL-17表达。3.摘取小鼠完整左肺行病理学检查,观察支气管及肺组织炎症(H&E染色)和气道上皮细胞杯状化生程度(PAS染色)。4.无菌取脾及肺引流淋巴结(LN)制备单细胞悬液,用流式细胞技术分别检测其CD4+Th细胞分化情况。5.参照OVA+LPS组小鼠建模方法用IL-17基因敲除小鼠复制中性粒细胞性哮喘模型,检测气道中炎症细胞总数及分类、炎症因子表达水平,测定气道高反应性(AHR),并观察肺组织病理炎症损害及气道粘液分泌状态。6.流式细胞技术检测IL-17基因敲除小鼠脾脏及肺引流巴结CD4+Th细胞分化情况。结果1.由OVA联合LPS致敏建立的中性粒细胞性哮喘小鼠BALF中炎症细胞以中性粒细胞为主,与单纯OVA致敏建立的嗜酸性粒细胞性哮喘小鼠相比较,具有更高的气道反应性和更严重的肺组织炎症,但其气道上皮细胞杯状化生降低;2.中性粒细胞性哮喘小鼠BALF中IL-1β(P<0.05)、IL-8(P<0.001)和IL-17(P<0.05)因子水平显着高于嗜酸性粒细胞性哮喘小鼠,而Th2细胞因子IL-4(P<0.01)和IL-5(P<0.001)水平显着低于嗜酸性粒细胞性哮喘小鼠;3.中性粒细胞性哮喘小鼠脾脏及肺引流淋巴结(LN)中CD4+Th细胞分化与嗜酸性粒细胞性哮喘小鼠相比较,CD4+IL-17+Th17细胞分化增多(脾:P<0.05;LN:P<0.05),CD4+IL-4+Th2细胞分化减少(脾:P<0.001;LN:P<0.001),而CD4+IFNγ+Th1细胞分化无明显变化(脾:P>0.05;LN:P>0.05);4.与野生型中性粒细胞性哮喘小鼠相比较,IL-17基因敲除小鼠气道反应性降低、BALF中细胞总数(P<0.01)及中性粒细胞(P<0.001)明显减少,肺组织炎症减轻,但BALF中嗜酸性粒细胞数(P<0.01)增多,气道上皮杯状化生增加;5.IL-17基因敲除小鼠BALF中Th2细胞因子IL-4(P<0.05)和IL-5(P<0.05)表达高于野生型中性粒细胞性哮喘小鼠,IL-1β(P<0.05)、IL-8(P<0.001)和IL-17(P<0.001)明显低于野生型中性粒细胞性哮喘小鼠;6.与野生型中性粒细胞性哮喘组小鼠相比较,IL-17基因敲除鼠脾脏及肺引流淋巴结中CD4+IL-17+Th17细胞分化明显降低(P<0.001),CD4+IL-4+Th2细胞分化升高(脾:P<0.01;LN:P<0.001);脾CD4+IFNγ+Th1细胞分化减少(P<0.05),而淋巴结CD4+IFNγ+Th1细胞分化无变化(P>0.05)。结论及意义1.用OVA联合LPS复制的中性粒细胞性哮喘小鼠模型,表现为典型的中性粒细胞性炎症,与仅用OVA致敏的嗜酸性粒细胞性哮喘小鼠相比较,有更高的气道反应性和更重的肺组织炎症损害。2.CD4+IL-17+Th17细胞分化增加及其分泌的IL-17是引起哮喘中性粒细胞性炎症表型的重要机制;3.CD4+IL-17+Th17细胞的增高及IL-17的高表达抑制了CD4+IL-4+Th2细胞分化,并进一步抑制了哮喘的Th2反应,即抑制了气道内嗜酸性粒细胞浸润、粘液高分泌及Th2细胞因子过表达。本文结果的意义在于,在动物模型中证实了,反复细菌感染接触内毒素可以使哮喘气道炎症表型从嗜酸性粒细胞性炎症转变为中性粒细胞性炎症,其机制依赖于CD4+Th17细胞的分化及其分泌的IL-17。此机制的发现为“卫生假说”补充了免疫学机制的证据。Th17细胞途径是哮喘中性粒细胞性炎症发生发展的关键环节,是治疗中性粒细胞性哮喘的潜在靶点。
王熠杰, 赵生涛, 杨旭, 王冉, 郭东霖[3]2017年在《IL-17A抑制Th2细胞分化减轻哮喘小鼠气道嗜酸性粒细胞炎症》文中研究指明目的研究IL-17A对哮喘小鼠Th2细胞分化及其相关炎症的作用。方法 24只C57BL/6J小鼠按随机数字表法分为对照组、哮喘组和IL-17A处理组(n=8)。哮喘组和IL-17A处理组予以卵清蛋白(ovalbumin,OVA)致敏及激发。每次雾化激发前1 h,IL-17A处理组给予重组小鼠IL-17A气道滴入。各步对照均予以生理盐水。末次激发后24 h处死小鼠,收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)行细胞总数及分类计数。ELISA检测BALF中IL-4、IL-5、IFN-γ、IL-17A的浓度。HE和PAS染色及半定量评分评估小鼠肺部病理变化。流式细胞术检测脾脏和支气管淋巴结Th细胞分化。免疫磁珠分选健康小鼠幼稚CD4~+T细胞,用Th2极化培养基体外培养,并给予IL-17A或等量PBS干预,检测Th2细胞的增殖、凋亡和分化。结果哮喘组较对照组,BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞数及其比例(P<0.05)、IL-4、IL-5、IL-17A浓度均显着增高(P<0.05),IFN-γ浓度显著下降(P<0.05);支气管、血管周围炎症细胞浸润和杯状细胞化生明显加重(P<0.01);脾脏和淋巴结Th2细胞分化比例显着增高(P<0.05)。IL-17A处理组较哮喘组,BALF中的细胞总数[(26.00±5.43)×10~4/mL vs(58.40±26.93)×10~4/mL,P<0.05]、嗜酸性粒细胞数[(8.04±1.98)×10~4/mL vs(31.95±12.28)×10~4/mL,P<0.05]及其比例[(29.93±3.03)%vs(53.47±6.62)%,P<0.01]显着降低,而中性粒细胞数及其比例无明显变化;BALF中Th2相关因子IL-4浓度[(9.86±2.77)pg/mL vs(28.13±4.62)pg/mL,P<0.01]、IL-5浓度[(7.30±0.50)pg/mL vs(10.50±1.10)pg/mL,P<0.01]均显着降低;支气管、血管周围炎症细胞浸润减轻,HE染色半定量评分降低[(2.00±0.51)vs(3.12±0.64),P<0.05],杯状细胞化生减少[(0.80±0.45)vs(2.40±0.55),P<0.01];脾脏[(2.24±0.44)%vs(4.82±1.83)%,P<0.01]和淋巴结[(7.05±0.58)%vs(10.57±1.35)%,P<0.05]中Th2细胞分化比例显着减少。极化培养的幼稚CD4~+T细胞,予IL-17A干预后,诱导分化的Th2细胞比例显着减少(P<0.05),而增殖和凋亡无显着变化。结论 IL-17A有抑制Th2细胞分化,减轻哮喘小鼠气道嗜酸性粒细胞炎症的作用。
蒋敏[4]2013年在《TH17细胞及其功能状态在中性粒细胞哮喘发病中的作用及相关分子机制》文中指出支气管哮喘(哮喘)是多种细胞参与的慢性气道炎症,长期以来嗜酸性粒细胞被认为是哮喘最重要的炎症效应细胞,但随着哮喘气道炎症的深入研究,发现存在嗜酸细胞性哮喘(EA)及非嗜酸细胞性哮喘两种不同的亚型,非嗜酸细胞性哮喘中半数以上为中性粒细胞性哮喘(NA),我们前期对哮喘患者的研究发现哮喘气道中性粒细胞炎症与气道中性粒细胞凋亡障碍有关,其发生机制仍在探讨中。哮喘发病机制的研究很大程度上需借助动物模型来进行,但既往哮喘的动物研究多采用传统的嗜酸细胞性哮喘动物模型,并不能真正反映中性粒细胞性哮喘的气道炎症状态及气道高反应的特征。因此,本研究采用脂多糖联合卵清蛋白气道滴入致敏,卵清蛋白雾化激发建立中性粒细胞性哮喘小鼠模型。结果显示小鼠出现了类似哮喘发作的症状及病理改变,以中性粒细胞为主的气道炎症,与嗜酸细胞性哮喘模型相似的气道粘液高分泌及更严重的气道高反应(AHR)；提示该方法成功地建立了中性粒细胞性哮喘小鼠模型,为后续研究奠定了基础。目前认为TH1/TH2细胞失衡所致TH2细胞优势是介导嗜酸细胞性哮喘发病最重要的免疫学机制,但最近的研究表明TH17细胞作为一类新发现的辅助性T细胞也参与哮喘发病。TH17细胞能够分泌多种细胞因子,其中最重要的是IL-17A(亦称IL-17), IL-17通过受体介导的信号途径可诱导多种细胞产生IL-8、IL-6、GM-CSF、CXCL等细胞因子,趋化并激活中性粒细胞在局部浸润。基于TH17细胞及IL-17受体信号途径所产生的细胞因子对中性粒细胞的生物学功能,我们推测TH17细胞参与了中性粒细胞性哮喘发病,然而也有研究显示TH17细胞参与了嗜酸细胞性哮喘发病。这两种免疫学机制是分别或共同参与中性粒细胞性哮喘、嗜酸细胞性哮喘发病?本研究结果显示两种哮喘小鼠脾脏TH17细胞比例、TH2细胞比例均高于对照组,提示TH17、TH2细胞均参与NA、EA小鼠发病；进一步分析TH2/TH17比例,我们发现NA组低于EA组,且NA组支气管肺泡灌洗液(BALF)中IL-17水平高于EA组,而IL-5水平明显低于EA组,提示NA组小鼠产生IL-17的功能亢进,存在强烈的TH17细胞免疫反应、中度TH2细胞免疫反应,TH17细胞在中性粒细胞性哮喘小鼠发病中起着更重要的作用。同时研究结果还表明增高的IL-6、TGF-β形成了有利于中性粒细胞性哮喘小鼠TH17细胞优势的体内微环境,正调控TH17细胞分化的特异性转录因子RORyt的表达增强、负调控TH17细胞分化的SOCS3表达下调与中性粒细胞性哮喘小鼠体内初始T细胞向TH17方向分化增强有关；而SOCS3表达增强是形成嗜酸细胞性哮喘小鼠TH2细胞优势的机制之一。现有的免疫学理论认为,激活的T细胞再次遇到刺激原时可诱导其进入凋亡途径,即激活诱导细胞死亡(activation-induced cell death, AICD),藉此限制免疫应答的过度发展,AICD过程中任何异常都有可能造成机体的不正常表现甚至疾病。因此,已分化TH17细胞的凋亡与存活状态很可能会影响哮喘气道中性粒细胞炎症的发生、发展。我们的研究发现NA组和EA组小鼠脾脏TH17细胞Ki-67的表达均明显高于对照组,说明哮喘小鼠体内已分化的TH17细胞的凋亡受到抑制,处于持续存活状态,因此,哮喘小鼠体内除初始T细胞向TH17方向分化增强外,TH17细胞持续存活是导致其TH17细胞优势的另一重要机制。白介素-7(IL-7)主要的功能是促进B和T细胞生长、T细胞存活及增殖。哮喘小鼠TH17细胞持续存活的机制是否依赖于IL7-IL7受体信号途径?本研究检测了脾脏及BALF中IL-7的表达,发现两种哮喘小鼠模型IL-7表达均增高,高表达的IL-7提供了延长TH17细胞存活的微环境。与对照组相比,哮喘小鼠脾脏TH17细胞上STAT5的表达均明显增高,且NA组高于EA组,提示哮喘小鼠TH17细胞存活依赖于JAK/STAT5信号途径激活,且中性粒细胞性哮喘小鼠TH17细胞STAT5信号途径激活程度更高；NA组TH17细胞上BCL-2的表达增高,提示中性粒细胞性哮喘小鼠TH17细胞通过上调抗凋亡蛋白BCL-2,抑制TH17细胞凋亡；两组哮喘小鼠脾脏TH17细胞上凋亡终末剪切酶Caspase-3的表达均明显增高,说明TH17的细胞凋亡是依赖Caspase途径的细胞凋亡,在启动抗凋亡机制的同时也激活了凋亡途径；但Caspase-3上升的幅度明显低于BCL-2,表明在促凋亡与抗凋亡的相互作用下抗凋亡的作用更强以致TH17细胞持续存活。IL-7信号通路可以被一些负调控机制所干扰,如SOCS-1作为细胞因子信号抑制剂可抑制STAT5信号转导而维持适度的炎性反应,本研究发现两种哮喘小鼠SOCS1表达均下调,可能使机体出现IL-7信号的高反应性,导致TH17细胞长期存活。这些功能增强的TH17细胞如何参与哮喘气道中性粒细胞炎症的形成?与以往研究一致,本研究中两种哮喘小鼠BALF中IL-17水平均增高；此外趋化因子CXCL1、CXCL5、CXCL8/IL-8也明显增高且与IL-17水平呈正相关,提示TH17细胞可能通过IL-17诱导趋化因子的表达,募集中性粒细胞至气道炎症局部聚集。与我们在哮喘患者的研究一致,中性粒细胞性哮喘小鼠气道中性粒细胞增高与气道中性粒细胞凋亡受到抑制有关；此外我们还证实哮喘小鼠BALF中IL-8水平与AHR呈正相关。因此,TH17细胞可能通过IL-17促进多种细胞因子分泌参与哮喘气道中性粒细胞炎症及AHR形成。糖皮质激素是目前控制哮喘气道炎症最有效的一线药物,通过全身应用地塞米松干预后肺组织病理改变减轻,哮喘小鼠BALF细胞总数、中性粒细胞均明显下降,但仍然高于对照组；TH17细胞数量及相关细胞因子IL-17水平降低,说明地塞米松通过下调TH17细胞数量及相关细胞因子水平以减轻哮喘气道中性粒细胞炎症。但地塞米松不影响NA小鼠气道中性粒细胞凋亡率,也未能影响两种哮喘小鼠TH17细胞存活延长的状态。综上所述,本研究成功建立了中性粒细胞性哮喘小鼠模型,在此基础上证实中性粒细胞性哮喘小鼠存在强烈的TH17细胞免疫、中度TH2细胞免疫反应,增高的IL-6、TGF-β形成了有利于中性粒细胞性哮喘小鼠TH17细胞优势的体内微环境,并通过RORγt和SOCS3两种途径共同调控TH17细胞的优势分化。除初始T细胞向TH17方向分化增强外,中性粒细胞性哮喘小鼠体内已分化的TH17细胞在机体高IL-7微环境下,依赖JAK/STAT5信号途径激活维持其存活状态,高表达的IL-17通过促进多种细胞因子分泌参与哮喘气道中性粒细胞炎症及AHR形成。地塞米松下调TH17细胞数量及相关细胞因子水平是减轻哮喘气道中性粒细胞炎症的机制之一；但地塞米松对气道中性粒细胞凋亡率及TH17细胞存活延长的状态无明显影响,可能是哮喘激素抵抗的免疫学机制之一。本研究初步阐明TH17细胞及其功能状态在哮喘发病中的作用及相关分子机制,为寻找哮喘治疗靶点提供了新线索和理论依据。
易玲玲[5]2016年在《Intelectin基因在哮喘气道上皮细胞固有免疫细胞因子IL-25、IL-33和TSLP表达中的作用》文中提出第一部分Intelectin基因在哮喘的气道高反应性、气道炎症、粘液分泌及T淋巴细胞分化中的作用目的：观察Intelectin (ITLN)基因在小鼠哮喘模型中对气道高反应性、气道炎症、粘液分泌的影响,并探究其在哮喘T淋巴细胞分化中的作用。方法：我们选择C57BL/6J品系的小鼠构建ITLN shRNA转基因小鼠(即ITLN KD小鼠),并构建卵清蛋白(OVA)和屋尘螨(HDM)两种哮喘模型。通过小鼠肺功能仪检测哮喘模型中各组小鼠在不同浓度乙酰甲胆碱的激发下表现出的气道阻力,并计数肺泡灌洗液(BALF)中的细胞总数及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等的分类计数。此外,我们根据小鼠肺组织石蜡切片的HE染色,对小鼠气道周围炎性细胞的浸润程度进行评分,比较各组小鼠的气道炎症情况。对粘液分泌的评估我们采用实时荧光定量PCR(realtime-PCR)法检测小鼠肺组织中粘液表达基因Muc5ac的mRNA表达水平、免疫组化法检测小鼠肺组织石蜡切片中Muc5ac的蛋白表达水平及小鼠肺组织石蜡切片糖原染色(PAS)等方法。还用ELISA法检测了各组小鼠外周血中OVA特异性IgE的含量。为探究ITLN在支气管哮喘T淋巴细胞分化中的作用,我们首先将各组小鼠肺组织匀浆提取RNA,用realtime-PCR法检测各组小鼠肺组织中Th2型细胞因子IL-4、IL-5、IL-13的mRNA表达水平,再用ELISA法检测BALF中这些Th2型细胞因子的浓度。为进一步验证ITLN参与了哮喘Th2细胞分化,我们采用流式细胞术标记各组小鼠肺组织及纵隔淋巴结中T细胞亚群,并比较各组小鼠肺组织及纵隔淋巴结中Th2型细胞(IL-4+CD4+)的比例。结果：在小鼠OVA哮喘模型中,野生型(WT)哮喘组小鼠在对不同浓度乙酰甲胆碱激发时气道阻力显着升高,而ITLN KD哮喘组的气道阻力与WT哮喘组相比明显下降。在对各组小鼠BALF细胞计数后发现,ITLN KD哮喘组BALF中细胞总数及嗜酸性粒细胞数均明显低于WT哮喘组。小鼠肺组织HE染色的气道炎症评分结果提示,ITLN KD哮喘组的炎症评分比WT哮喘组的下降50%以上。对粘液分泌的评估结果显示与WT哮喘组相比,ITLNKD哮喘组在MucSac的mRNA及蛋白表达水平、PAS染色的阳性细胞计数上均明显低于WT哮喘组。此外,我们还发现OVA特异性IgE含量在WT哮喘组的外周血中显着升高,而在ITLNKD哮喘组中的表达明显被抑制。在HDM小鼠哮喘模型中,气道高反应性、气道炎症和粘液分泌均得到了与OVA哮喘模型相似的实验结果。在探究ITLN在支气管哮喘T淋巴细胞分化中的作用时我们发现,OVA哮喘模型中WT哮喘组Th2型细胞因子IL-4、 IL-5、 IL-13的mRNA表达水平较正常对照组显着升高,而在ITLN的表达被抑制后,这些Th2型细胞因子的表达明显下降。我们用流式细胞术检测T细胞亚群时发现,WT哮喘组肺组织及纵隔淋巴结中Th2型细胞(IL-4+CD4+)比例较正常对照组显着升高,而在ITLN KD哮喘组中Th2型细胞比例较WT哮喘组明显下降。结论：ITLN基因参与哮喘的气道高反应性、气道炎症、粘液分泌等病理过程,当ITLN的表达被抑制后,哮喘的气道反应性降低,气道炎症及粘液分泌均明显减轻。抑制ITLN的表达能使CD4+T淋巴细胞向Th2型细胞分化减少。第二部分Intelectin基因在哮喘气道上皮细胞固有免疫细胞因子IL-25、IL-33和TSLP表达中的作用及机制目的：探究Intelectin (ITLN)基因在哮喘中对气道上皮细胞固有免疫细胞因子IL-25、IL-33和TSLP表达的影响,并深入研究ITLN是通过何种信号通路参与调控屋尘螨(HDM)诱导的气道上皮细胞IL-25、IL-33和TSLP的表达。方法：我们利用第一部分的小鼠哮喘模型标本,将各组小鼠肺组织匀浆后取上清,用ELISA法检测IL-25、IL-33和TSLP的蛋白表达水平。为了验证ITLN在致敏早期即参与调控气道上皮细胞因子IL-25、IL-33和TSLP的表达,我们用屋尘螨(HDM)连续叁天致敏小鼠,检测肺组织中ITLN、IL-25、IL-33和TSLP的mRNA表达水平。随后,我们用HDM刺激人支气管气道上皮细胞株(BEAS-2B),检测ITLN及IL-25、IL-33和TSLP的mRNA表达水平,并设计人的ITLN shRNA质粒,观察ITLN的表达被抑制后,HDM诱导上述上皮细胞因子的表达水平是否发生变化。在以上实验基础上,我们选择EGFR信号通路阻断剂PD153035和AG1478,及MEK信号通路阻断剂U0126干预BEAS-2B细胞,旨在观察阻断EGFR和MEK信号通路后,HDM诱导的IL-25、IL-33和TSLP的表达水平是否受影响。为了直观地反应ITLN是通过何种信号通路参与调控HDM诱导的气道上皮细胞IL-25、IL-33和TSLP的表达,我们将BEAS-2B细胞在HDM干预前先转染ITLN shRNA质粒抑制ITLN的表达,用Western-Blot方法检测EGFR和MAPK/ERK的磷酸化情况。结果：在两种小鼠哮喘模型中,我们均发现抑制ITLN的表达后,小鼠肺组织中IL-25、IL-33和TSLP的表达水平被显着抑制。用HDM连续叁天致敏小鼠后,ITLN和上皮细胞因子IL-25、IL-33和TSLP的mRNA表达水平显着升高,而抑制ITLN的表达后,这些上皮细胞因子的表达也被抑制。在BEAS-2B细胞模型中,HDM刺激BEAS-2B细胞2h时,IL-33和TSLP的mRNA表达水平即开始增加,6h时ITLN及IL-25、IL-33和TSLP的mRNA表达水平均增加,而用ITLNshRNA质粒或半乳糖(galactose)干预后,HDM诱导BEAS-2B细胞引起的IL-25、IL-33和TSLP的表达受抑制。当EGFR和MEK信号通路被阻断后,HDM诱导BEAS-2B细胞IL-25、IL-33和TSLP的mRNA表达水平均明显下降。随后Western-Blot结果显示,HDM刺激BEASA-2B细胞后能使EGFR和MAPK/ERK的磷酸化水平显着增高,而转染ITLN shRNA质粒抑制ITLN的表达后,EGFR和MAPK/ERK的磷酸化水平显着下降。结论：HDM能引起气道上皮细胞ITLN和固有免疫细胞因子IL、IL-33和TSLP的表达,当ITLN的表达被抑制后,HDM诱导这些上皮细胞因子的表达也被抑制。ITLN通过参与EGFR和MAPK/ERK信号通路的活化调节HDM诱导的IL-25、IL-33和TSLP的表达。第叁部分Intelectin在支气管哮喘患者气道中的表达及临床意义目的：观察Intelectin (ITLN)在支气管哮喘患者气道中的表达情况,探究其与气道嗜酸性粒细胞炎症的相关性。方法：我们一共入组23例健康对照者和48例支气管哮喘患者,记录所有研究对象的基本信息、肺功能FEV1%预计值、支气管激发试验PD20值、外周血嗜酸性粒细胞数量及血总IgE含量。此外,所有纳入的研究对象均需留取诱导痰标本、气道刷片细胞及气道活检标本。我们对诱导痰进行处理后,对诱导痰中的细胞进行分类计数,并记录嗜酸性粒细胞所占细胞总数的百分比。经纤维支气管镜获取的气道活检标本需做石蜡包埋并切片,通过HE染色观察气道活检标本的结构,对结构清晰的组织切片做免疫组化观察ITLN在健康对照者和支气管哮喘患者气道中的表达情况。经纤维支气管镜获取的气道刷片细胞提取RNA,用real-time PCR法检测并比较ITLN在健康对照组和支气管哮喘组间的表达差异。同时检测外周血中ITLN的蛋白表达水平,为血浆ITLN作为支气管哮喘的生物标志物提供依据。最后,我们将支气管哮喘患者气道刷片细胞中ITLN mRNA的表达水平与诱导痰中嗜酸性粒细胞数量做相关性分析,了解ITLN与气道嗜酸性粒细胞炎症的相关性。结果：健康对照组和支气管哮喘组两组在年龄和性别比上均无明显差异。支气管哮喘组的FEV1%预计值和支气管激发试验PD20值均明显低于健康对照组。而支气管哮喘组外周血嗜酸性粒细胞数量及血总IgE含量均明显高于健康对照组。免疫组化法检测的气道活检标本结果显示,ITLN主要表达在支气管哮喘患者的气道杯状细胞和气道粘膜下腺体内。支气管哮喘组的气道刷片细胞中ITLN的mRNA表达水平和外周血中ITLN的蛋白表达水平均明显高于健康对照组。通过相关性分析,我们还发现支气管哮喘患者气道刷片细胞中ITLN的mRNA表达水平与诱导痰中嗜酸性粒细胞百分比呈显着正相关关系(相关系数为0.622,P<0.0001)。结论：ITLN在支气管哮喘患者的气道中表达明显升高,且主要表达在气道杯状细胞和气道粘膜下腺体内。支气管哮喘患者气道ITLN的表达水平与气道嗜酸性粒细胞炎症程度呈显着正相关。
乔俊英[6]2016年在《HMGB1/TLR4/NF-KB信号通路在哮喘小鼠模型中的作用及维生素D的调控机制》文中进行了进一步梳理研究背景哮喘是由基因和环境因素共同导致的常见呼吸道疾病,其发病机制、治疗等诸多环节仍尚未完全清楚,因此探讨哮喘发病机制、寻找新防治靶点仍然是研究的重要内容。肺组织高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)是一种高度保守的核蛋白,可作为一种免疫调节因子和炎性因子参与气道炎症;Toll样受体4(Toll like receptors 4,TLR4)是一种重要的免疫识别受体,连接天然免疫和获得性免疫,在启动和调节气道炎症过程中发挥重要作用。HMGB1可与TLR4结合并相互作用,通过激活核转录因子(Nuclear factor-kappa B,NF-KB),引起下游的炎症介质释放。维生素D既参与钙磷代谢调节,还具有免疫调节作用,主要通过影响单核细胞、树突状细胞(Dendritic cell,DC)、淋巴细胞等免疫细胞发挥广谱的抗炎作用,并通过影响多种细胞的生长和分化参与气道结构的调节。目前,国内外关于维生素D与哮喘的研究有一些报道,但具体作用机制仍不明确。关于HMGB1、TLR-4在哮喘动物肺组织的表达及维生素D的干预研究较少,而哮喘动物外周血和支气管肺泡灌洗液(BALF)中的表达研究更少,HMGB1/TLR4/NF-KB信号通路及维生素D的调控研究国内外未见报道。本课题拟通过建立哮喘小鼠模型,观察肺组织病理学改变,BALF中细胞计数和分类变化,外周血和BALF中HMGB1、TLR-4、IL-4和IFN-γ含量变化;肺组织HMGB1、TLR4和NF-KB m RNA和蛋白的表达变化,进一步探讨哮喘的发病机制。维生素D是一种生物制剂,副作用小,价格便宜,使用依从性好,与类固醇激素作用相似;本实验应用该药进行干预性试验,观察其对HMGB1/TLR4/NF-KB信号通路及气道炎症和气道重塑的影响,从新的角度诠释其在哮喘防治中的作用,进一步挖掘老药的新用途,为临床研究和应用提供基础实验依据。第一部分不同剂量维生素D对哮喘小鼠肺组织HMGB1、TLR4表达的影响目的通过建立哮喘小鼠气道重塑模型,观察HMGB1及TLR4在肺组织的表达,以及不同剂量维生素D对哮喘气道重塑及HMGB1和TLR4表达的影响。方法50只BALB/c小鼠随机分为5组:对照组、哮喘组、1,25-(OH)_2D_3低剂量组、1,25-(OH)_2D_3中剂量组和1,25-(OH)_2D_3高剂量组,每组10只。采用卵清蛋白(OVA)致敏建立哮喘模型,对照组以生理盐水代替,然后给予1,25-(OH)_2D_3低、中、高叁种剂量干预,采用苏木精-伊红(HE)染色在光学显微镜高倍镜视野(10×40)下观察小鼠肺组织病理学变化,支气管壁厚度的测定采用计算机病理图像分析系统进行。采用免疫组化法观察肺组织HMGB1及TLR4表达的变化,应用计算机病理图像分析系统测定蛋白的表达量。采用RT-PCR法检测HMGB1及TLR4m RNA表达变化,基因的相对表达量按灰度值比值公式计算。结果1哮喘组小鼠出现流涕,打喷嚏,呼吸急促,咳嗽,点头呼吸等哮喘样表现,重者出现紫绀,四肢瘫软;提示模型制作成功。2哮喘组小鼠气道损伤明显、可见大量炎性细胞浸润,上皮细胞紊乱、脱落,气道壁明显增厚,管腔狭窄;1,25-(OH)_2D_3低、中剂量组支气管壁结构较哮喘组完整光滑,管腔狭窄和炎性细胞浸润较哮喘组减轻;但高剂量组较哮喘组气道结构破坏加重。3哮喘组小鼠气道壁厚度较对照组明显增加,1,25-(OH)_2D_3低、中剂量组气道壁厚度较哮喘组明显减轻(均P<0.05),但高剂量组小鼠气道壁厚度却较哮喘组明显增加(P<0.05)。4免疫组化结果显示:对照组小鼠HMGB1和TLR4蛋白表达较弱;哮喘组小鼠HMGB1和TLR4表达较强,哮喘组较对照组HMGB1和TLR4表达明显增高(均P<0.05);1,25-(OH)_2D_3低、中剂量组HMGB1及TLR4表达明显低于哮喘组(均P<0.05),而高剂量组则明显高于哮喘组(均P<0.05)。5 RT-PCR结果显示:哮喘组HMGB1m RNA和TLR4 m RNA表达较对照组明显增高;1,25-(OH)_2D_3低、中剂量组HMGB1 m RNA和TLR4 m RNA相对表达量均较哮喘组明显降低(均P<0.05),而高剂量组则明显高于哮喘组(均P<0.05)。结论1在OVA致敏的哮喘气道重塑模型中,HMGB1和TLR4表达明显增高;2适量1,25-(OH)_2D_3可降低肺组织HMGB1和TLR4表达,减轻气道重塑;过量则可能增加HMGB1和TLR4表达,加重气道重塑;3适量1,25-(OH)_2D_3可能通过抑制HMGB1/TLR4信号通路,阻止下游的炎症因子释放,改善哮喘气道重塑。第二部分哮喘小鼠HMGB1/TLR4/NF-ΚB信号通路及维生素D的作用目的观察不同时间点哮喘小鼠病理学变化,BALF中细胞总数和分类变化,外周血和BALF中HMGB1、TLR4、IL-4和IFN-γ含量变化,肺组织HMGB1、TLR4和NF-KB m RNA和蛋白表达变化,以及维生素D的干预作用。方法48只BALB/c小鼠随机分为3组,对照组、哮喘组和1,25-(OH)_2D_3干预组,每组小鼠为16只。雾化激发处理后,每组按两个观察时间点(1周和2周)进行标本处理,每个时间点取小鼠标本8只。建立哮喘激发1周和2周动物模型,同期采用中等剂量的1,25-(OH)_2D_3进行干预试验。各组按不同时间点取小鼠右肺中叶进行HE和免疫组化染色,观察小鼠病理学变化,测定其气道壁厚度,观察HMGB1、TLR4和NF-KB在肺组织的表达部位。同时收集BALF和外周血,BALF进行细胞学检测;采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定BALF和外周血中HMGB1、TLR-4、IL-4和IFN-γ含量;采用实时定量荧光PCR(Real-time PCR)和Western blot(蛋白质印迹法)分别从m RNA和蛋白质水平检测HMGB1、TLR4和NF-KB表达变化,基因的相对表达量按2-△△Ct计算,蛋白的相对表达量根据相对灰度值公式计算。结果1哮喘组1,2周气道壁厚度和气道损伤较对照组1,2周明显增加(均P<0.05);干预组1,2周较哮喘组1,2周气道壁厚度和气道结构破坏明显减轻(均P<0.05)。2哮喘组1,2周与对照组1,2周比较,BALF中白细胞总数,嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞比例明显升高,单核/巨噬细胞比例明显下降(均P<0.05);干预组1,2周与哮喘组1,2周比较,BALF中白细胞总数,嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞比例明显下降,单核/巨噬细胞比例明显上升(均P<0.05)。3哮喘组1,2周BALF中HMGB1、TLR4和IL-4含量均明显高于对照组1,2周,IFN-γ含量均明显低于对照组1,2周(均P<0.05);干预组1,2周BALF中TLR4和IL-4均明显低于哮喘组1,2周,IFN-γ含量均明显高于哮喘组1,2周(均P<0.05);第1周时干预组BALF中HMGB1较哮喘组无变化(P>0.05),但第2周时干预组明显低于哮喘组(P<0.05)。4哮喘组1,2周外周血中HMGB1和IL-4含量均明显高于对照组1,2周,IFN-γ含量均明显低于对照组1,2周,干预组1,2周外周血中HMGB1和IL-4均明显低于哮喘组1,2周,IFN-γ含量均明显高于哮喘组1,2周(均P<0.05);第1周时哮喘组外周血中TLR4含量与对照组比较无差异(P>0.05),但第2周时明显高于对照组(P<0.05);第1周时干预组外周血中TLR4含量与哮喘组比较无差异(P>0.05),但第2周时明显低于哮喘组(P<0.05)。5哮喘组1,2周肺组织中HMGB1、TLR4、和NF-KB m RNA表达量均明显高于对照组1,2周;干预组1,2周肺组织中TLR4和NF-KB m RNA表达量均明显低于哮喘组1,2周(P均<0.05)。第1周时干预组HMGB1 m RNA与哮喘组比较无明显差异(P>0.05),但在第2周时干预组则明显下降(P<0.05)。6哮喘组1,2周肺组织中HMGB1、TLR4和NF-KB蛋白表达量均明显高于对照组1,2周;干预组1,2周肺组织中HMGB1、TLR4和NF-KB蛋白表达量均明显低于哮喘组1,2周(均P<0.05)。7小鼠气道壁厚度与肺组织HMGB1、TLR4和NF-KB m RNA的表达量均呈正相关性(r分别为0.802,0.895,0.834;均P<0.05);肺组织HMGB1、TLR4和NF-KB的m RNA表达量及蛋白表达量间均呈正相关(r分别为0.871,0.841,0.823;均P<0.05)。8外周血中IL-4、IFN-γ与BALF中IL-4和IFN-γ浓度均呈正相关(r分别为0.600,0.743;均P<0.05);外周血和BALF中IL-4浓度与HMGB1、TLR4浓度间均呈正相关性(r1分别为0.696,0.331,r2分别为0.695,0.648;均P<0.05)。9 BALF中HMGB1、TLR4含量分别与肺组织中HMGB1m RNA、TLR4m RNA,外周血HMGB1、TLR4含量分别与肺组织中HMGB1m RNA、TLR4m RNA间均呈正相关(r1分别为0.756,0.762,r2分别为0.762,0.327;均P<0.05);HMGB1和TLR4含量在BALF和外周血间均呈正相关(r1为0.617,r2为0.325;均P<0.05)。10 BALF中HMGB1和TLR4含量分别与细胞总数、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞比例均呈正相关(r1分别为0.796,0.787,0.754,0.749;r2分别为0.730,0.698,0.558,0.480,均P<0.05)。结论1哮喘小鼠气道重塑早期,肺组织高表达HMGB1、TLR4和NF-KB;2 HMGB1和TLR4与气道炎症和免疫紊乱有关;适量1,25-(OH)_2D_3可减轻气道炎症,可能与调节Th1/Th2细胞平衡有关;3哮喘小鼠外周血和支气管肺泡灌洗液中均高表达HMGB1和TLR4蛋白,适量1,25-(OH)_2D_3可以下调两者的表达;4哮喘小鼠肺组织同时高表达HMGB1、TLR4和NF-KB的m RNA和蛋白,叁者与气道重塑相关,适量1,25-(OH)_2D_3可以下调叁者的表达,改善气道重塑;5 HMGB1/TLR4/NF-KB信号通路在哮喘发病中起重要作用,适量1,25-(OH)_2D_3可能通过对其的调控作用阻止哮喘的进展,有望成为哮喘治疗的新选择。
邸彩霞[7]2015年在《OX40-OX40L共刺激通路介导嗜碱性粒细胞始动过敏性气道炎症的研究》文中提出背景支气管哮喘是以Th2免疫应答为主的慢性过敏性气道炎症。近年研究发现嗜碱性粒细胞在不同疾病模型中能够诱发Th2免疫应答,但其具体机制目前尚不清楚。OX40-OX40L共刺激通路在Th细胞分化及哮喘中均发挥重要作用。目的通过体内外研究阐释并明确嗜碱性粒细胞始动过敏性气道炎症的作用,在此基础上进一步探讨嗜碱性粒细胞启动Th2免疫反应诱发过敏性气道炎症的信号分子机制。方法1.利用OVA免疫小鼠建立哮喘气道炎症模型,观察在哮喘炎症早期小鼠纵隔淋巴结(Mediastinal lymph nodes,MLN)中嗜碱性粒细胞、树突状细胞(Dendritic cells,DCs)和Th2细胞的时间变化曲线和嗜碱性粒细胞表面分子表达的变化。2.建立IL-3诱导小鼠骨髓细胞定向分化为嗜碱性粒细胞的体外培养体系;流式细胞仪分选嗜碱性粒细胞并鉴定。在此基础上观察髓源性嗜碱性粒细胞(Bone marrow-derived basophils,BM-Bas)OX40和OX40L表达特点。3.建立体外嗜碱性粒细胞诱导Th2细胞分化体系,在此基础上采用OX40L封闭性抗体(抗小鼠CD252抗体)或者OX40~-/- 小鼠na?ve T细胞,观察在OX40-OX40L共刺激通路阻断条件下对嗜碱性粒细胞诱导Th2细胞分化的影响。4.利用OVA致敏、激发C57BL/6小鼠构建哮喘模型,在此基础上在致敏阶段尾静脉注射OX40L阻断性抗体(抗小鼠CD252抗体),观察气道病理组织学改变、血清OVA特异性Ig E(Ovalbumin-special immunoglobulin E,OVA-s Ig E)、支气管肺泡灌洗液(Bronchial alveolar lavage fluid,BALF)中嗜酸性粒细胞数量和BALF中Th2型细胞因子IL-4、IL-5和IL-13的变化。5.建立体外过继性回输MLN嗜碱性粒细胞诱发小鼠哮喘模型,观察阻断OX40-OX40L共刺激通路后受体小鼠MLN Th2细胞比例变化及气道病理组织学、血清OVA-s Ig E、BALF中嗜酸性粒细胞数量和Th2型细胞因子IL-4、IL-5和IL-13的变化。结果1.在哮喘炎症早期,MLN中嗜碱性粒细胞数目显着增加,而DCs无明显变化,并且嗜碱性粒细胞数达到峰值时间早于Th2细胞。同时嗜碱性粒细胞表面OX40L信号分子变化最为显着。2.体外IL-3诱导BM-Bas并受DNP-OVA和抗DNP-Ig E复合物刺激后诱导性表达OX40L。3.体外阻断OX40-OX40L共刺激通路减少嗜碱性粒细胞诱导Th2细胞分化比例。4.致敏阶段抗小鼠CD252抗体阻断OX40-OX40L共刺激通路降低哮喘小鼠血清OVA-s Ig E、减少BALF中嗜酸性粒细胞数量、降低BALF中IL-4、IL5和IL-13水平,减轻肺组织过敏性气道炎症。5.体外过继性回输MLN嗜碱性粒细胞启动Th2免疫应答诱发小鼠哮喘炎症,而OX40~-/- 受体小鼠和回输OX40L处理的嗜碱性粒细胞的WT C57BL/6受体小鼠MLN中Th2细胞比例降低,肺部过敏性气道炎症减轻。结论1.嗜碱性粒细胞早期参与始动过敏性气道炎症。2.嗜碱性粒细胞在体内外诱导性表达OX40L。3.OX40-OX40L共刺激通路介导嗜碱性粒细胞诱导Th2细胞分化。4.在OVA诱导的过敏性气道炎症中,OX40-OX40L共刺激通路介导嗜碱性粒细胞诱发Th2免疫应答,导致过敏性气道炎症。
廖竞[8]2014年在《Th17细胞与儿童中性粒细胞性哮喘气道炎症相关性研究》文中研究指明支气管哮喘（哮喘）是由多种炎症细胞（嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞等）、气道结构细胞（气道上皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞）以及多种细胞因子共同参与的气道慢性炎症性疾病。哮喘发病机制复杂，至今尚未完全阐明。气道慢性炎症是哮喘的本质，研究哮喘气道炎症发生、发展机制对于哮喘防治具有重要临床指导意义。随着对哮喘气道炎症的深入研究，人们对哮喘的认识已不再局限于嗜酸性粒细胞气道炎症，而更强调哮喘是多种细胞共同参与的气道慢性炎症。目前研究显示哮喘的气道炎症存在不同的亚型，可分为嗜酸细胞性哮喘（eosinophilicasthma，EA）和非嗜酸细胞性哮喘（non-eosinophilic asthma，NEA），其中半数以上的非嗜酸细胞性哮喘为中性粒细胞性哮喘（neutrophilic asthma，NA）。但哮喘气道中性粒细胞增多的机制目前尚未完全阐明。辅助性T淋巴细胞(T helper cell，Th细胞)在哮喘气道慢性炎症中发挥着重要的免疫调节作用。Th2细胞占优势的Th1/Th2细胞失衡被认为是变应性哮喘气道嗜酸细胞性炎症形成及发展的免疫学基础。但有研究发现非变应性哮喘患者存在不依赖于Th2细胞免疫学机制介导的气道中性粒细胞炎症。近年来发现Th17细胞及其效应因子IL-17在支气管哮喘等变态反应性疾病中发挥重要作用， IL-17具有强大的募集、活化中性粒细胞的作用，可能是导致气道中性粒细胞增多的机制之一。但Th17细胞在不同气道炎症类型哮喘发病中的作用是否相同，在中性粒细胞性哮喘发病机制中是否存在Th17细胞分化优势，鲜有报道。我们前期动物实验通过建立中性粒细胞哮喘小鼠模型进行研究，结果显示中性粒细胞哮喘小鼠存在强烈的Th17细胞免疫、中度Th2细胞免疫反应，Th17细胞通过IL-17介导哮喘小鼠中性粒细胞性气道炎症的发生，并通过上调转录因子RORγt促进Th17细胞分化，中性粒细胞哮喘小鼠体内已分化的Th17细胞在机体高IL-7环境下，依赖JAK/STAT5信号途径激活维持其存活状态。但在人类中性粒细胞性哮喘发病机制中是否存在同样的Th17细胞分化优势是本课题所要研究的第一个问题。糖皮质激素作为治疗哮喘最有效的抗炎药物主要通过减少T淋巴细胞活化及抑制细胞因子的产生减轻气道炎症反应。对于多数哮喘患者以吸入糖皮质激素（ICS）为基础的规范化哮喘治疗可达到哮喘控制，但仍有部分患者并没有取得预期的效果，少数患者症状持续存在、甚至恶化，随着对哮喘气道炎症的深入研究，发现激素治疗效果欠佳的哮喘患者多为中性粒细胞哮喘。近年有研究发现，糖皮质激素不能抑制Th17细胞及其效应因子IL-17介导的气道中性粒细胞炎症，但亦有研究显示糖皮质激素治疗可下调IL-17表达，我们前期动物实验研究亦发现地塞米松可通过下调中性粒细胞哮喘小鼠Th17细胞特异性转录因子RORγt表达水平，降低Th17细胞数量及其相关细胞因子IL-17水平，部分减轻哮喘小鼠气道中性粒细胞炎症。但地塞米松对Th17细胞存活延长的状态及气道中性粒细胞凋亡率无明显影响。目前，对于糖皮质激素在Th17细胞介导的哮喘气道炎症中的作用存在不同的研究结果。我们将在探讨Th17细胞与儿童中性粒细胞性哮喘气道炎症相关性的基础之上，进一步探讨糖皮质激素对Th17细胞介导的儿童中性粒细胞性哮喘气道炎症的作用。本研究将初步阐明Th17细胞在儿童中性粒细胞性哮喘发病中的作用，为儿童中性粒细胞性哮喘的治疗寻求新线索及提供理论依据，有助于哮喘的个体化治疗。研究分为两部分进行：第一部分Th17细胞及相关细胞因子与儿童中性粒细胞性哮喘气道炎症相关性分析目的探讨Th17细胞及相关细胞因子与儿童中性粒细胞性哮喘气道炎症的相关性。方法随机选取28例未应用糖皮质激素治疗急性发作期哮喘患儿，进行肺功能测定、诱导痰细胞分类计数，并根据诱导痰液细胞学分类分成叁组：嗜酸细胞性哮喘（EA组）12例；中性粒细胞哮喘（NA组）10例；非嗜酸细胞非中性粒细胞性哮喘（NEA+NNA组）共6例，并选取健康对照组(HC组)10例，采用流式细胞术检测外周血Th17、Th2细胞及Th17细胞上Ki-67、STAT5、BCL-2的表达；实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）检测外周血单个核细胞RORγt-mRNA的表达；ELISA方法检测痰上清液、血浆、经PMA刺激的PBMC培养上清液IL-17浓度、痰上清液IL-8、IL-5浓度，并进行相关性分析。结果1、NA组外周血Th细胞中Th17细胞百分比较EA组、NEA+NNA组、HC组均明显增高(p<0.01)，EA组、NEA+NNA组Th17细胞百分比较HC组增高(p<0.01)，EA组与NEA+NNA组间Th17细胞百分比比较差异无统计学意义(p>0.05)；EA组外周血Th细胞中Th2细胞百分比较NA组、NEA+NNA组、HC组均增高(p<0.01)，NA组、NEA+NNA组Th2细胞百分比较HC组增高(p <0.01)，NA组与NEA+NNA组间Th2细胞百分比比较差异无统计学意义(p>0.05)；2、NA组外周血Th17细胞Ki-67表达阳性率较EA组、NEA+NNA组、HC组均明显增高(p<0.01)，EA组、NEA+NNA组Th17细胞Ki-67表达阳性率较HC组增高(p<0.01)，EA组与NEA+NNA组间Th17细胞Ki-67表达阳性率比较差异无统计学意义(p>0.05)；NA组外周血Th17细胞STAT5表达阳性率较EA组、NEA+NNA组、HC组均明显增高(p<0.01)，EA组、NEA+NNA组Th17细胞STAT5表达阳性率较HC组增高(p<0.01)，EA组与NEA+NNA组间Th17细胞STAT5表达阳性率比较差异无统计学意义(p>0.05)；NA组外周血Th17细胞BCL-2表达阳性率较EA组、NEA+NNA组、HC组均明显增高(p<0.01)，EA组、NEA+NNA组与HC组间Th17细胞BCL-2表达阳性率比较差异无统计学意义(p>0.05)；3、NA组外周血单个核细胞RORγt-mRNA表达较EA组、NEA+NNA组、HC组均明显增高(p<0.01)，EA组、NEA+NNA组RORγt-mRNA表达较HC组增高(p<0.01)，EA组与NEA+NNA组间RORγt-mRNA表达比较差异无统计学意义(p>0.05)；4、NA组痰上清液IL-17浓度较EA组、NEA+NNA组、HC组均明显增高(p<0.01)，EA组、NEA+NNA组痰上清液IL-17浓度较HC组增高(p <0.01)，EA组与NEA+NNA组间痰上清液IL-17浓度比较差异无统计学意义(p>0.05)；EA组痰上清液IL-5浓度较NA组、NEA+NNA组、HC组均增高(p <0.01)，NA组、NEA+NNA组痰上清液IL-5浓度较HC组增高(p <0.01)，NA组与NEA+NNA组间痰上清液IL-5浓度比较差异无统计学意义(p>0.05)；NA组痰上清液IL-8浓度较EA组、NEA+NNA组、HC组均明显增高(p <0.01)，EA组、NEA+NNA组痰上清液IL-8浓度较HC组增高(p <0.01)，EA组与NEA+NNA组间痰上清液IL-8浓度比较差异无统计学意义(p>0.05)；5、NA组、EA组、NEA+NNA组与HC组间血浆IL-17浓度比较差异无统计学意义(p>0.05)，但经PMA刺激培养后，NA组PBMC培养上清液IL-17浓度较EA组、NEA+NNA组、HC组均明显增高(p<0.01)，EA组、NEA+NNA组PBMC培养上清液IL-17浓度较HC组增高(p<0.01)，EA组与NEA+NNA组间PBMC培养上清液IL-17浓度比较差异无统计学意义(p>0.05)；同时，经PMA刺激培养后，NA组、EA组、NEA+NNA组PBMC培养上清液IL-17浓度较血浆IL-17浓度均明显增高(p均<0.01)，HC组PBMC培养上清液IL-17浓度与血浆IL-17浓度比较差异无统计学意义(p>0.05)。6、哮喘患儿诱导痰NEU百分比与外周血Th细胞中Th17细胞比例及痰上清IL-17、IL-8、PBMC培养上清液IL-17浓度呈明显正相关；哮喘患儿诱导痰NEU百分比与FEV1%pred、PEF%pred呈明显负相关；哮喘患儿诱导痰EOS百分比与外周血Th细胞中Th2细胞比例及痰上清IL-5浓度呈明显正相关。结论1、Th17细胞和Th2细胞均不同程度共同参与儿童哮喘的发病。儿童中性粒细胞性哮喘外周血Th17细胞、特异性转录因子RORγt表达及痰液IL-17水平均明显高于嗜酸细胞性哮喘及非嗜酸细胞非中性粒细胞性哮喘，并且与诱导痰中性粒细胞比例呈正相关。提示Th17细胞可能通过IL-17介导中性粒细胞性哮喘气道炎症的发生。2、儿童中性粒细胞性哮喘体内已分化的Th17细胞存活延长，可能与JAK/STAT5信号途径激活有关。第二部分吸入糖皮质激素对Th17细胞介导的儿童中性粒细胞性哮喘气道炎症的影响目的探讨吸入糖皮质激素对Th17细胞介导的儿童中性粒细胞性哮喘气道炎症的影响方法第一部分研究对象中的中性粒细胞性哮喘患儿(NA组)10例，在医师指导下规则吸入糖皮质激素治疗3个月后，进行肺功能测定、诱导痰细胞分类计数；采用流式细胞术检测外周血Th17细胞及Th17细胞上Ki-67、的表达；实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）检测外周血单个核细胞RORγt-mRNA的表达；ELISA方法检测痰上清液、PBMC培养上清液IL-17浓度。结果1、NA组规则吸入糖皮质激素治疗后FEV1%pred、PEF%pred均较治疗前明显增高(均p <0.01)，但仍低于健康对照组（P均<0.05）；2、NA组规则吸入糖皮质激素治疗后诱导痰NEU百分比较治疗前明显降低(p<0.01)，但仍高于健康对照组（P<0.05）；3、NA组规则吸入糖皮质激素治疗后外周血Th17细胞及Th17细胞Ki-67表达均较治疗前明显降低(均p<0.01)，但仍高于健康对照组（均P<0.01）；4、NA组规则吸入糖皮质激素治疗后外周血单个核细胞RORγt-mRNA表达较治疗前明显降低(p<0.01)，与健康对照组比较差异无统计学意义(p>0.05)；5、NA组规则吸入糖皮质激素治疗后痰上清液及PBMC培养上清液IL-17浓度均较治疗前降低(分别为：p<0.05，p <0.01)，但仍高于健康对照组（均P <0.01）。结论吸入糖皮质激素可通过下调特异性转录因子RORγt的表达水平，在一定程度上降低外周血Th17细胞及痰液IL-17水平，减轻Th17细胞介导的儿童中性粒细胞性哮喘气道炎症。
赵燕[9]2013年在《构建以Th17应答为主致气道中性粒细胞增高的小鼠哮喘模型》文中研究说明研究背景和目的：支气管哮喘是一种以气道高反应性、气道炎症细胞浸润、杯状细胞增生和气道重塑等为特征的过敏性疾病。免疫应答失衡是其众多发病机制中最重要的一种。以往研究表明，活化的CD4~+Th2细胞增多可致气道及血管周围嗜酸性粒细胞浸润，Th1/Th2免疫应答反应失衡也作为哮喘发病的主要原因广泛应用于临床和基础研究中。新近发现CD4~+T细胞家族新成员Th17细胞及其分泌的细胞因子IL-17可募集、趋化中性粒细胞致病原入侵部位，在宿主防御中发挥积极作用。近年来，国内外学者均在哮喘患者肺泡灌洗液及血清中发现较高水平IL-17。且重症哮喘患者和对糖皮质激素治疗抵抗者中气道以中性粒细胞浸润为主，嗜酸性粒细胞比例下降甚至未检出。Th17免疫应答增强或许是哮喘发病的新机制。为此，本研究拟建立气道炎症以中性粒细胞浸润为主的小鼠哮喘模型，并初步探讨Th17免疫应答的作用。方法：1.腹腔致敏构建气道炎症以嗜酸性粒细胞浸润为主的经典小鼠哮喘模型，并鉴定。2.经卵清蛋白（ovalbumin, OVA）孵化过夜的树突状细胞（dendriticcell, DC）与静息型T细胞共培养，加入脂多糖（LPS）刺激，检测T细胞的分化。3.改进传统建模方法，增加气道滴入LPS+OVA致敏，从气道高反应性，肺组织T细胞分化，支气管肺泡灌洗液（BALF）炎症细胞分类，肺组织病理学观察等方面鉴定新模型。结果：1.经典小鼠哮喘模型构建成功：存在气道高反应性；气道周围炎症细胞浸润明显；BALF细胞沉淀分类见嗜酸性粒细胞增多，细胞因子IL-5水平显着升高。2.共培养结果表明，OVA-DC可刺激静息型T细胞向Th2方向偏移；而LPS-OVA-DC可刺激静息型T细胞向Th17方向偏移。3.在传统模型构建方法基础上增加气道给药LPS+OVA致敏，构建新小鼠哮喘模型：气道高反应性明显；气道与血管周围炎症细胞浸润；BALF细胞沉淀分类见中性粒细胞增多，细胞因子IL-17、IL-8、TNF-α增高更为显著。结论：1. LPS可使OVA-DC提呈抗原改变，影响T细胞的分化方向。2.增加气道滴加LPS+OVA致敏，可使体内静息型T细胞向Th17细胞方向偏移，从而诱导中性粒细胞在肺组织气道和血管周围浸润，影响哮喘小鼠部分病理特征。
丁林[10]2017年在《B7-H3在儿童中性粒细胞哮喘的作用研究》文中研究说明第一部分B7-H3在中性粒细胞哮喘患儿体内的表达及临床意义目的:通过检测B7-H3在中性粒细胞哮喘患儿(NA)急性发作时外周血及支气管肺泡灌洗液(BALF)的表达水平,比较B7-H3水平与Th1、Th2、Th17相关细胞因子和BALF中性粒细胞百分比(NEU%)相关性,分析B7-H3在中性粒细胞哮喘儿童急性发作期气道中性粒细胞炎症的作用及临床意义。方法:选取2015年1月~2016年12月在苏州大学附属儿童医院呼吸科住院并符合儿童支气管哮喘诊断标准的患儿42例为研究对象,哮喘患儿在入院2~5d内(急性期)行电子支气管镜检查。根据患儿BALF中NEU%是否348%,分为中性粒细胞哮喘组(A组)20例和非中性粒细胞哮喘组(B组)22例,并选取同期在苏州大学附属儿童医院因支气管异物行支气管镜检查的儿童16例作为对照组(C组)。所有患儿入院24小时内采集外周血,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测所有患儿血浆和BALF上清中B7-H3、INF-γ、IL-4、IL-6、IL-8、IL-17、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)细胞因子表达水平,并分析B7-H3与这些细胞因子和BALF中NEU%的相关性。结果:A组血浆和BALF中B7-H3、IL-4、IL-6、IL-8、IL-17、GM-CSF、MMP-9、NE水平均显着高于C组(均P<0.05);A组血浆和BALF中IL-6、IL-8、IL-17和MMP-9水平均显着高于B组(均P<0.05),A组BALF中B7-H3、GM-CSF、NE水平高于B组,差异具有统计学意义(均P<0.05);B组患儿血浆和BALF中B7-H3、IL-4、IL-6、IL-17、GM-CSF水平比C组均显着升高(均P<0.05);IFN-g水平在B组血浆和BALF中低于A组和C组(P<0.05)。A组血浆和BALF中B7-H3水平与IFN-g、IL-6、IL-8、IL-17及MMP-9水平呈正相关(均r>0.3,P<0.05);A组BALF中B7-H3水平与GM-CSF、NE及BALF中NEU%呈正相关(均r>0.3,P<0.05);B组血浆和BALF中B7-H3水平与IL-4和IL-17水平呈正相关(均r>0.3,P<0.05)。结论:NA患儿急性期血浆和BALF中B7-H3及Th17相关细胞因子水平较非中性粒细胞哮喘患儿及正常对照组明显升高,而且B7-H3水平与Th17相关细胞因子水平及BALF中NEU百分比呈正相关,表明共刺激分子B7-H3在NA患儿可能通过上调Th17细胞免疫应答参与气道中性粒细胞炎症的发生发展及对肺组织的损伤,从而导致哮喘急性发作,以此推测B7-H3的异常表达通过正性调控Th17细胞功能参与NA气道炎症的免疫调控作用和发病机制。第二部分抗B7-H3单克隆抗体对中性粒细胞哮喘小鼠模型的作用研究目的:探讨抗B7-H3单克隆抗体对中性粒细胞哮喘(NA)小鼠模型的治疗作用。方法:选取6~8周SPF级BALB/C雌性小鼠24只,随机分成4组,每组6只,分别为磷酸缓冲盐溶液(PBS)对照组(A组),中性粒细胞哮喘组(B组),抗B7-H3单克隆抗体干预组(C组),同型对照Ig G组(D组)。B、C、D组均给予OVA联合LPS致敏,OVA雾化激发(0、7、14天OVA联合LPS腹腔注射致敏,第21天予OVA雾化半小时,连续雾化一周激发),A组给予同等剂量的PBS注射和激发。C组和D组在第0、3、7、10、14天分别腹腔注射相同剂量的抗B7-H3单克隆抗体和同型对照Ig G,观察小鼠雾化时的症状。各组小鼠在最后一次雾化激发24h后麻醉处死,收集血浆、支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织。显微镜下进行BALF细胞总数及分类计数;采用ELISA检测小鼠血浆及BALF上清中IFN-g、IL-4、IL-5、IL-6、IL-13、IL-17、TNF-a、G-CSF细胞因子的水平;小鼠肺组织病理切片HE染色观察炎症性改变、炎性细胞包括中性粒细胞的浸润;PAS染色观察气道粘液的分泌;同时肺组织免疫组化法检测B7-H3阳性细胞表达水平。结果:(1)B组和D组小鼠雾化激发后出现呼吸急促、烦躁不安、频繁搔抓头面部等表现,C组喘息症状较B组有所缓解,A组活动自如。(2)B组、C组、D组BALF细胞总数、中性粒细胞百分比、嗜酸性粒细胞百分比及淋巴细胞百分比较A组均显着升高,而巨噬细胞百分比显着下降(均P<0.05);C组BALF细胞总数、中性粒细胞百分比和嗜酸性粒细胞百分比较B组、D组明显降低(均P<0.05);B组与D组比较无显着差异。(3)B组、C组、D组血浆和BALF中IFN-g、IL-4、IL-5、IL-6、IL-13、IL-17、TNF-a、G-CSF水平较A组均显着性上升,其中B组、D组血浆和BALF中IL-17和G-CSF水平比C组增高,B组、D组BALF中IL-6、TNF-a水平明显高于C组(均P<0.05);血浆和BALF中IL-4水平B组和D组低于C组(均P<0.05);B组、C组、D组血浆和BALF中IFN-g、IL-5、IL-13水平两两比较无显着性差异。(4)A组肺组织病理染色示无明显炎症细胞及粘液分泌;B组和D组炎症细胞、中性粒细胞浸润和粘液分泌较A组明显,C组较B组、D组有所减轻。(5)肺组织免疫组化显示A组几乎无表达B7-H3阳性细胞,B组和D组B7-H3阳性细胞数明显增多,C组较B组、D组阳性细胞数明显减少(P<0.05)。结论:抗B7-H3单克隆抗体早期干预能够减轻中性粒细胞炎症哮喘小鼠喘息症状,减少肺组织炎症细胞及中性粒细胞、嗜酸性粒细胞的浸润和粘液的分泌,下调Th1/Th17相关细胞因子和前炎症细胞因子的分泌,从而减轻NA小鼠局部及全身炎症反应、减轻肺组织炎症损伤,部分阻断NA免疫致病机制的发生发展。抗B7-H3单克隆抗体也许从发病机制为NA的治疗提供了新的方法。
参考文献：
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