郭宝元[1]2003年在《药物与蛋白和细胞相互作用的毛细管电泳研究》文中研究指明前人在毛细管电泳分子相互作用分析领域已做了大量工作，并取得了丰硕成果。在研究生物大分子或细胞与药物之间的相互作用时，常会遇到生物大分子在毛细管上吸附、紫外检测背景高等问题。为解决这些难题，人们对研究方法进行了不断改进和发展，提出了区段灌注技术。血清白蛋白是血液中重要的转运蛋白，研究血清白蛋白与药物的相互作用，对了解药物在体内的转运、吸收有重要意义，也可为新药的筛选和开发提供一定的依据。细胞是生物体形态结构和生命活动的基本单位，药物与细胞的相互作用研究无疑对药理研究还是新药开发都具有重要的意义。本文包括两个部分，第一部分是药物与血清白蛋白的相互作用分析，第二部分是药物与细胞的相互作用研究。第一部分，在区段灌注技术基础上，建立了区段灌注-自标记的毛细管电泳分析方法，并将该方法应用于药物与蛋白相互作用的毛细管电泳分析。本部分对药物蛋白相互作用的两个体系进行了研究，并求得了相应的结合常数。这两个体系分别是：人血清白蛋白(HSA)-烟碱相互作用体系，其结合常数为1.66×103mol-1L；牛血清白蛋白(BSA)-麻黄碱(EPH)，咖啡因(CAF)和扑热息痛(ACEP)相互作用体系，它们的结合常数分别为KBSA-EPH=3.38 ×104mol-1L，KBSA-CAF=4.79×104 mol-1L和KBSA-ACEP= 6.13 ×104 mol-1L。第二部分，采用第一部分建立的区段灌注-自标记技术，对麻黄碱、咖啡因、肾上腺素与红细胞的相互作用进行了研究，并采用了在形式上与分子间相互作用结合常数相似的常数——结合参数，来表达药物与细胞间的结合情况。这样，利用结合参数，我们就可对药物与细胞的结合情况进行判断。通过对不同实验所得的麻黄碱与细胞的结合参数比较，我们认为药物与细胞的结合参数重现性不高，因而对药物间结合参数的比较要在同一次实验中完成。本研究还对麻黄碱、咖啡因与细胞的结合参数进行了比较，结果表明咖啡因与细胞的结合能力比麻黄碱的强。本文认为这种差别是由麻黄碱和咖啡因在细胞膜上不同的分配行为所致。另外，本研究在对麻黄碱、肾上腺素与红细胞间的结合参数的比较中发现，肾上腺素与细胞的结合比麻黄碱强，并从理论上分析认为，这种差异源于麻黄碱和肾上腺素与红细胞膜上相应受体的不同结合能力。结果表明，区段灌注-自标记技术是毛细管电泳相互作用分析的一种有效方法。该方法不仅有效地消除了蛋白背景吸收所带来的干扰问题，成功地克服了蛋白吸附对研究的影响，而且对峰漂移模型也作了进一步发展。使用区段灌注-自标记技术，结合常数的计算比采用Scatchard方程计算更为精确，适用范围更广。该技术将在毛细<WP=5>管电泳药物与蛋白相互作用分析中发挥积极的作用，为非涂层毛细管药物蛋白分析提供了一条有效途径。本文还借助该技术，将分子相互作用的毛细管电泳研究的思路引入细胞和药物相互作用分析中，成功地建立了细胞与药物相互作用的毛细管电泳分析方法。
肖尚友[2]2006年在《相互作用分析的毛细管电泳方法研究与应用》文中研究表明相互作用在化学体系、生物化学体系和环境体系中广泛存在,是各种生理活动得以正常进行和生理功能得以正常发挥的基础。毛细管电泳具有分离效率高、分析速度快、样品用量少等特点,在研究分子相互作用方面具有独到的优势。因此开展相互作用研究,特别是毛细管电泳相互作用分析及应用研究在手性药理学、环境毒理学、药物创制学及生物医学工程领域有重要意义。相互作用有多种表达方式,包括结合常数、结合位点及自由能变等参数,其中结合常数是表征相互作用强弱最重要的参数之一。本文在以毛细管电泳为手段研究分子相互作用的基础上,发展了分子相互作用的毛细管电泳分析(CEIA)方法,特别是针对复杂体系和电中性分子的相互作用分析方法。将CEIA方法应用于小分子与生物大分子、小分子与细菌和鸡血红细胞的相互作用分析,以获得相互作用结合常数。论文进一步基于相互作用的原理,开展了以可溶性淀粉、糊精和麦芽糖为手性添加剂的西酞普兰毛细管电泳手性分离,并对手性识别相互作用机理进行了较为深入的研究。具体主要内容包括:(1)应用毛细管电泳方法,使用十二烷基硫酸钠胶束赋予中性客体分子对-硝基苯胺和2-氨基吡啶有效淌度,研究了中性主体分子18-冠醚-6与对-硝基苯胺和2-氨基吡啶的相互作用,建立了中性分子相互作用的毛细管电泳分析方法。以毛细管电泳峰漂移方法,测得了中性主体与中性客体分子之间的相互作用结合常数。(2)将毛细管电泳相互作用分析方法从一种物质与另一种物质的相互作用的测定发展到多个组分共存时与另一物质的相互作用测定,达到了同时评价各组分与指定分子的结合能力的目的。通过这种方法测定了大黄中的有效成分大黄素、芦荟大黄素和大黄酚与β-环糊精和羟丙基-β-环糊精的结合常数。(3)应用毛细管电泳区带灌注-自标记技术,研究了麻黄碱、咖啡因、对乙酰氨基酚与牛血清白蛋白的相互作用以及麻黄碱与鸡血红细胞的相互作用。(4)通过对细菌样品预处理方法、缓冲液种类、检测波长以及聚合物添加剂对分离度影响等的考察,研究了大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的毛细管电泳行为,获得了优化的毛细管电泳分离条件,实现了大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的快速分离,从而建立起一种辅助的细菌定性识别方法。进一步,研究了抗菌药物阿奇霉素与金黄色葡萄球菌的相互作用,发现阿奇霉素能与金黄色葡萄球菌的表面蛋白发生相互作用,从而引起金黄色葡萄球菌淌度的变化。(5)基于竞争相互作用原理,采用非手性的C18色谱柱,通过在流动相中加入手性选择剂β-环糊精的方法实现了西布曲明对映体的拆分。西布曲明对映体在
周新[3]2005年在《提取方法及毛细管电泳法在中药研究中的应用》文中研究表明本文对中药有效成分的提取和分离检测方法进行了研究。将超声技术和微波技术应用于中药有效成分提取的研究中,建立了叁种新的提取方法。利用毛细管电泳法对中药中有效成分进行了定量测定,并研究了中药有效成分与蛋白的相互作用。研究了叁种中药有效成分提取新方法,包括超声雾化提取法、高压微波辅助提取法和微波辅助无溶剂提取法。在超声提取法的基础上,设计了一套超声雾化提取装置。该方法是在提取剂变成气溶胶的情况下完成提取,与传统的超声提取方法相比,提取时间与提取剂用量均有所改进;建立了一种利用高压微波辅助提取法提取中药蜜丸中有效成分的方法,这一方法是将蜜丸药涂在载玻片上,而后进行提取,缩短了提取时间,提高了提取效率;通过在样品中加入对微波能有强烈吸收作用的固体介质,利用介质吸收微波,加热样品,加热速度快,使得在提取干燥中草药中挥发油成分时无需任何前处理过程成为可能。用毛细管电泳法测定了高良姜、贯叶连翘、菟丝子、地锦草、刺五加、银杏叶和满山红7 种不同中药中槲皮素,以及槐米和槐花中槲皮素和芦丁的含量。详细考察了电泳分离参数,包括缓冲剂种类、缓冲溶液添加剂、分离电压、缓冲溶液pH 值、进样量、运行温度等。总结了每种药的最佳电泳分离条件,并对样品分析的回收率和精密度进行了测定,建立了这些中药中槲皮素和芦丁的毛细管测定方法。采用亲和毛细管电泳(ACE)技术,对木犀草素、槲皮素和山柰酚这叁种黄酮类化合物与人血清白蛋白(HSA)的结合常数进行了研究,并同荧光猝灭法进行了对比。针对已有荧光猝灭法计算结合常数的公式一般采用一定程度的近似,利用Matelab6.5 软件编制了一套迭代计算结合常数的程序Fluo1.0,使荧光猝灭法计算结合常数时不需任何假定和近似,更真实地反映了实际情况。
高苏亚[4]2012年在《药物分子与生物相关物质相互作用的方法学研究及其在药物分析中的应用》文中认为药物分子与生物相关物质之间的相互作用研究具有非常重要的意义。随着研究者研究水平的不断提高,分析仪器的不断更新和新药的不断问世,药物与生物分子之间的研究方法也不断增多和更新。本文采用紫外-可见分光光度法、荧光光谱法、毛细管电泳法以及区段灌注技术、计算机分子模拟技术等方法研究了姜黄素、坦索罗辛、双醋瑞因、生物碱类及苯甲酸类药物与DNA、牛血清白蛋白、环糊精和金属离子等之间的相互作用,测定了结合常数和相关热力学参数,推测了一定条件下的作用机理。在研究方法和数据处理中有一定的改进和扩展,并将其研究方法应用于相应的药物分析之中,包括药物的质量控制和手性药物对映体的拆分。本论文分为两部分。第一部分是绪论,引用大量文献详细综述了分子间相互作用研究的进展及重要意义,研究方法及其应用,药物分子与生物相关物质间相互作用的研究现状等。第二部分是研究报告,具体研究内容如下：1.光谱法研究姜黄素与有关物质的相互作用及应用采用双等色分光光度法测定了在pH=6.5时姜黄素与Fe2+的络合稳定常数,同时对实验设计提出新的改进方法,并将Excel应用于迭代法的数据处理中,大大简化了实验操作和数据处理过程。由此建立了姜黄素-分光光度法测定复方硫酸亚铁叶酸片中Fe2+的含量,方法简便可靠。采用双倒数法获得该络合物与ssDNA的结合常数,探讨了其作用机理。采用荧光结合Excel迭代数据处理方法和紫外光谱法系统研究了姜黄素与BSA、p-CD、HP-p-CD之间的相互作用机理,制备并考察了CUR-HP-β-CD包合物的光谱性质、水溶性及稳定性。2.叁种生物碱与BSA及环糊精相互作用的方法学研究及应用采用经典的荧光法研究了咖啡因、可可碱和茶碱与BSA的作用机理；同时分别采用以药物为添加剂的“DP”方式和以BSA为添加剂的“PD”方式的亲和毛细管电泳法(ACE)研究了叁种生物碱与BSA的相互作用。两种方法的实验结果基本一致。采用紫外分析法测定了叁种生物碱与p-CD的相互作用,利用其识别作用建立了以p-CD为添加剂的CZE法对茶叶、可乐饮料、咖啡、药品等样品中叁种生物碱同时定量的分析方法。3.坦索罗辛与环糊精/BSA相互作用的方法学研究及应用采用分光光度法结合分子模拟技术研究了坦索罗辛和β-CD、HP-β-CD的相互作用,以此建立了CZE法同时分离测定坦索罗辛原药及其缓释胶囊中坦索罗辛和相关中间体的方法。采用CZE和ACE原理,探讨了坦索罗辛消旋体的手性拆分、对映体与手性选择剂β-CD、HP-β-CD和BSA之间的相互作用。利用毛细管区段灌注技术和区段前药物代替标记物的方法成功地解决了坦索罗辛及其中间体与BSA作用的背景干扰问题。4.苯甲酸类与BSA相互作用的光度法研究及其HPCE分析应用采用紫外光度法的静电模型研究了苯甲酸、水杨酸、乙酰水杨酸(阿司匹林)与BSA的相互作用。实验过程中以BSA溶液作参比,测定药物-BSA混合体系的吸光度值,可消除残余BSA对药物吸光度测量的干扰,此方法可推广到其它类似的有光谱重迭现象的相互作用体系。采用β-CD修饰的MECC法同时分离了5种苯甲酸类化合物,并应用MECC-内标法分离测定了板蓝根药材中芳香酸类化合物。5.双醋瑞因与环糊精/BSA相互作用的光谱法研究双醋瑞因是一种新型抗炎药物,可显着缓解和改善骨关节炎患者的关节功能。利用简单的紫外分光光度法测得双醋瑞因与β-CD、HP-β-CD之间的包合作用；利用荧光分析手段测得双醋瑞因对BSA的荧光有静态猝灭效应,同时用改进的Excel迭代方法计算了双醋瑞因与BSA在不同温度下的结合位点数、结合常数和相关热力学参数,并推测出其作用力类型主要为疏水和静电作用。
吴鸿伟[5]2007年在《毛细管电泳在药物分析和食品安全检测中的应用》文中研究指明毛细管电泳技术作为一种迅猛发展起来的新分离分析技术，以其高效、快速、低实验消耗等优点，受到了广泛重视，在药物分析、食品安全监测和生命科学领域发挥着越来越重要的作用。本论文应用毛细管电泳分离分析技术，研究了抗癌药物紫杉醇及盐酸普罗帕酮两种药物和血清白蛋白结合作用机制；建立了毛细管电泳激光诱导荧光检测格列吡嗪及毛细管电泳快速分离检测食品中苏丹红的新方法。本研究论文内容包括两章。第一章毛细管电泳在药物分析和食品安全检测中的应用依据近年来所发表的有关毛细管电泳分离分析方面的文献，对毛细管电泳在药物分析方面的应用、毛细管电泳研究药物与蛋白相互作用进展以及食品安全检测的应用叁个方面进行了较为详尽的论述。第二章研究报告第一节毛细管区带电泳研究抗癌药物紫杉醇与人血清白蛋白结合作用本文采用毛细管区带电泳(CZE)技术，研究了天然抗癌药物紫杉醇(Paclitaxel)与人血清白蛋白(HSA)的结合作用机制。在以硼砂-碳酸钠(pH=10，50mmol／L)为运行缓冲溶液，运行电压21kv，进样时间5.0s，紫外检测器(214nm)的条件下检测，结合常数和结合位点数在298K和310K分别为K_(298K)=1.7×10~4Lmol~(-1)，n_(298K)=4.1，K_(310K)=3.4×10~4Lmol~(-1)，n_(310K)=3.0。实验表明该方法简单，可靠。第二节毛细管电泳研究盐酸普罗帕酮与人血清白蛋白结合作用本文采用毛细管区带电泳(CZE)技术，研究了盐酸普罗帕酮(Propafenone)与人血清白蛋白(HSA)的结合作用机制。在以硼砂-碳酸氢钠(pH=10，50mmol／L)为运行缓冲溶液，运行电压17kv，进样时间12s，紫外检测器(214nm)的条件下检测，结合常数和结合位点数在298K和310K分别为K_(298K)=1.65×10~6Lmol~(-1)，n=1.15及K_(310K)=1.92×10~4 Lmol~(-1)，n_(310K)=1.23。同时运用荧光光谱、紫外吸收光谱研究了盐酸普罗帕酮与人血清白蛋白的结合作用机制；并从热力学参数推得了药物分子与人血清白蛋白分子间作用力类型等分子间相互作用信息。第叁节高效毛细管电泳—激光诱导荧光检测格列吡嗪的研究建立了毛细管电泳-激光诱导荧光法测定格列吡嗪的新方法。采用异硫氰酸荧光素(FITC)为衍生剂，考察了衍生缓冲溶液类型、浓度、pH、反应计量比、衍生温度以及背景缓冲溶液类型、pH值、浓度、进样时间、电压等对测定格列吡嗪效果的影响。使用未涂层的毛细管柱(47cm×50μmi．d．，有效柱长40 cm)，10mmol／LNaHCO_3—Na_2CO_3(pH=9.6)为衍生缓冲溶液，在25℃时，异硫氰酸荧光素与格列吡嗪计量比40：1条件下闭光反应12h后，以40mmol／L Na_2B_4O_7—NaHCO_3(pH=9.4)为背景缓冲溶液，在激光波长488 nm、运行电压14kV条件下，血浆样品微超滤除蛋白后直接测定。线性范围为2.24×10~(-10)～1.12×10~(-8)mmol／L(r=0.9986)。检出限为1×10~(10)mmol／L。结论：在所选择的条件下，此方法灵敏度高，可以用于血液样品中含量检测。第四节毛细管区带电泳法快速检测食品中苏丹红建立了毛细管区带电泳快速分离检测食品中四种苏丹红的新方法。考察了背景缓冲溶液类型、pH值、浓度、进样时间等对分离测定苏丹红效果的影响。结果表明，在紫外检测波长214nm，运行电压23kV条件下，以50mmol／LNa_2B_4O_7—K_2HPO_4(pH=8.3)为背景溶液，使用未涂层的毛细管柱(47cm×50μm i．d．，有效柱长40cm)，检出限为1～5μg／ml。该方法成功的应用于苏丹红含量的测定。
赵玉清[6]2009年在《白藜芦醇、补骨脂及熊果酸与蛋白质的相互作用》文中提出蛋白质是生物体的重要组成物质,也是体内药物的重要运输载体。蛋白质与药物的相互作用不仅影响药物在体内的吸收、分布、而且影响药物在体内的代谢与排泄方式等;也是很多药物的作用耙点,尤其是抗肿瘤药物;它是很多药物作用的靶点。药物分子与蛋白质的作用(结合与分离)情况从一定程度上也就预示了药物作用的发生、发展和消除,反映药效和药物毒性。研究小分子与生物大分子相互作用情况对于筛选药物,指导药物设计及合成有重要的现实意义。本课题选择血清白蛋白(BSA)和牛血红蛋白(BHb)作主要模型大分子,选择我国资源丰富天然药物小分子:抗肿瘤药物(熊果酸)、抗癌药物(白藜芦醇),中药活性单体化合物(补骨脂)小分子作靶向分子。主要通过荧光光谱法结合紫外光谱法及毛细管电泳分析方法研究天然药物小分子与蛋白质的相互作用力的大小。本论文共分五章:第一章:主要综述了血清白蛋白与生物活性小分子相互作用的研究进展。包括血清白蛋白的结构、生理功能、各种方法的应用情况及蛋白质荧光猝灭类型与机理判断方法和亲和毛细管电泳法检测的原理。确立了课题的立论依据,阐述了研究小分子化合物与蛋白质相互作用的重要意义及主要创新点。第二章:利用荧光光谱、紫外光谱和圆二色谱方法研究了白藜芦醇与血清白蛋白和牛血红蛋白的相互作用,探讨了体系的猝灭机理;计算了两体系反应的结合常数、结合位点数及热力学参数等;研究了白藜芦醇在血清白蛋白和牛血红蛋白上的作用位置;通过同步荧光光谱和圆二色谱,考察了白藜芦醇对血清白蛋白和牛血红蛋白二级结构的影响。第叁章:利用荧光光谱和紫外光谱详细研究了药补骨脂与牛血清白蛋白和牛血红蛋白的相互作用,测定了蛋白质与补骨脂作用体系的结合常数、结合位点数、结合距离、结合的热力学参数、作用机理、补骨脂的结合对蛋白质构象所产生的变化,为该类药物的研究提供了一些基础性的参数。第四章:利用荧光光谱和紫外光谱方法研究了近似生理条件下熊果酸与牛血清白蛋白的相互作用,探讨了熊果酸与牛血清蛋白的相互作用体系的荧光猝灭机理;计算并讨论了反应的结合常数、结合位点数及结合模式等。第五章:利用毛细管电泳的亲和性,模拟生物体系相互作用环境分析测定了补骨脂与牛血清蛋白的作用情况。论文对常规前沿分析法进行改进,即改进型前沿分析法测定了补骨脂与牛血清白蛋白的相互作用结合常数,该方法保证了绘制工作曲线的配体的峰高与平衡体系中游离配体峰高的一致性,减小了实验误差,提高了测定结果的准确度。考察了两种方法在计算补骨脂与牛血清白蛋白相互作用结合常数方面的差异,并获得两者的结合常数。两种方法求得的结果比较一致,并与前面的光谱法相比较,验证了的毛细管电泳对天然药物分子与生物大分子相互作用的可行性。
何新亚[7]2003年在《以DNA为一方的分子间相互作用的毛细管电泳研究》文中研究指明生命科学的研究与生物技术的发展同步，近年来成效显着。构成生命过程的基本单元是生物体内的生物分子之间的复杂的相互作用，从分子水平上探究生命的本质即是对相应的生物分子间相互作用的表征。相互作用研究是现代高通量药物筛选的重要基础，而毛细管电泳是研究分子间相互作用的重要技术平台。 本论文着重以DNA分子参与的相互作用体系为出发点，将毛细管电泳应用到DNA和大分子(如蛋白质)、DNA和小分子(如药物)结合体系的表征。特别是进一步将毛细管电泳应用到了DNA对药物对映体的手性识别领域，首次采用毛细管电泳考察了DNA对非金属-有机络合物类手性药物的对映体选择性。在操作模式的选择上，考虑到现代高通量药物筛选过程中许多用作药靶的生物大分子稀有难得的实际状况，强化了对样品消耗量最少的区带毛细管电泳模式用于弱相互作用研究的可行性论证，在认识上突破了国际学术界传统上认为区带毛细管电泳只能用于考察强相互作用体系的观念。并以大分子一大分子、大分子—小分子两种实际体系，分别证明了区带毛细管电泳用于弱相互作用体系的可行性，因此，拓宽了毛细管电泳用于高通量大规模药物筛选的前景。
佚名[8]2004年在《生命科学中的分析化学》文中提出10-I-001 四种电化学分析仪器的研制汪尔康中国科学院长春应用化学研究所电分析化学目家重点实验室,长春,130022,ekwang@ciac.jl.cn 本报告介绍我们实验室以原有研究工作为基础,结合国家十五科技攻关课题,适应市场需要,研发的生化需氧量(BOD)快速监测仪、溶氧(DO)在线检测仪、毛细管电泳电化学发光检测仪(CE/ECL)、USB插头式超微型电化学研究系统(uECS)等四种电化学分析仪器。BOD、DO仪采用纳米、自组装等技术制作电化学探头,可实现对水体中的BOD、DO的快速、灵敏的检测,所得结果与使用传统的方法相一致,而所需时问报短,可以实时、在线监测;CE/ECL仪系结合了毛细管电泳的高分离能力和电化学发光的高灵敏度的特点开发出的整体仪器:uECS突破了原有电化学分析仪器的概念,结合了先进的USB2.0技术,整个系统体积小巧(如U盘),通过计算机的USB接口提供电源并进行高速数据传输,具有一般研究型电化学仪的各项功能,并且具有较强的可扩展性。
孙晓君[9]2017年在《生物医药中糖胺聚糖结构分析新方法研究》文中指出糖胺聚糖是一类广泛存在于动物细胞表面和细胞间基质的线性多糖,是一种复杂的糖类大分子。一般通过共价键连接在核心蛋白上,以蛋白聚糖的形式存在。由于发现糖胺聚糖在黏液分泌过程中具有一定的粘性并具有润滑功能,因此又被称为粘多糖。各种不同组织中所含有的糖胺聚糖各不相同,可以通过结合或者调控等方式在生理及病理过程中与多种蛋白产生相互作用,包括趋化因子、细胞因子、生长因子、成型素、酶和粘附分子等相互作用。另外糖胺聚糖也被认为与许多重要疾病,如炎症、肿瘤等,有密切关系。除了作为生物体内重要的功能物质,糖胺聚糖也是一类重要的生物药物,例如抗凝血药物、抗血栓药物、治疗缓解关节炎的药物等等。肝素作为一种抗凝血药物,被广泛认为是一种具有重要生物功能和独特化学性质的糖胺聚糖多糖。上世纪30年代首次发现肝素可以有效的防止手术后血栓的生成,继而发现可以治疗静脉血栓、肺栓塞、深静脉栓塞等。但是对肝素的使用也引起了一系列不良副反应,如出血并发症或者肝素诱发的血小板减少等等。通过对这些并发症的研究,对凝血机理有了更好的了解,从而引出了对分级肝素——低分子肝素的开发,可以对化学结构和生物特性有更好的了解。低分子肝素的定义为硫酸化的糖胺聚糖盐平均分子量在8000 Da以下,且至少有60%的分子量分布在8000Da以下。低分子肝素是通过控制的化学法或者酶法降解使肝素分子量降低,且抗Xa因子的效价应大于70unit/mg,抗Xa因子活性与抗Ⅱa因子活性的比值应大于等于1.5。目前低分子肝素的生产工艺有以下几类,β-消除降解法、亚硝酸降解法、酶降解法、过氧化物降解法。利用β-消除降解法生产的低分子肝素主要为依诺肝素钠;利用亚硝酸降解法生产的低分子肝素主要品种根据分子量不同分别称为达肝素钠和那屈肝素钙;利用酶降解法生产的低分子肝素主要为汀肝素钠;利用过氧化物降解法生产的低分子肝素有帕肝素钠。对每种低分子肝素各个国家都有明确的要求,包括平均分子量、分子量分布、抗Xa因子与抗Ⅱa因子的效价及其比值、末端结构、硫酸化程度等等。市场份额最高的叁种低分子肝素为依诺肝素钠、达肝素钠和那屈肝素钙。在美国的肝素市场超过叁亿美元的份额当中,70%来自于依诺肝素钠的销售。除了肝素与低分子肝素,还有一类化学合成的超低分子肝素,主要有磺达肝癸钠和艾卓肝素钠。受疯牛病、肝素污染事件等因素的影响,寻找新的肝素产品生产途径一直是各国科学家努力的方向,使用化学合成法生产肝素产品是首选的代替途径。磺达肝癸钠肝素寡糖药物是基于肝素中与抗凝血酶Ⅲ相互结合的作用位点核心五糖的结构合成的最简洁的肝素产品。磺达肝癸钠与肝素最大的区别即为磺达肝癸钠仅特异性的与抗Xa因子结合,并没有药用肝素的众多重要的药理学特性。另外磺达肝癸钠的半衰期比肝素要更长,但是过量的抗凝血活性不能被鱼精蛋白所中和。糖胺聚糖通过结合或者调控的方式在各项生理功能和疾病的发展过程中发挥着重要的作用。对各种不同来源的糖胺聚糖的研究可以从分子水平上对功能和病理研究给予支持。对健康个体与疾病个体糖胺聚糖含量、种类、组成等方面的差异的研究有助于对生物标志物的探索,进而实现对疾病诊断的辅助作用,同时对于新药开发、药物代谢动力学研究也有极大的帮助。因此对糖胺聚糖的提取、分离及纯化技术的需求也日益强烈。较常见的糖胺聚糖样品来源有各种生物组织、各类细胞以及各种体液。由于不同来源糖胺聚糖的存在形式各有差异,因此针对物理化学性质的差异,对于不同来源糖胺聚糖的提取、分离及纯化技术的开发也有所不同。随着对糖胺聚糖生物功能和生物制药等生物医药方面越来越深入的研究,对糖胺聚糖的分析技术提出了越来越高的要求。对生物样本中糖胺聚糖的研究可以为功能和疾病研究提供分子水平的信息支持,对糖胺聚糖药物结构的表征对药物安全性评估至关重要。如何提高分析的灵敏度和准确度,如何更好更深入的对糖胺聚糖结构进行表征是分析工作者面临的一大挑战。利用高效液相色谱法、毛细管电泳色谱法、凝胶电泳法、核磁共振波谱法以及质谱法可以实现对糖胺聚糖结构的表征。本论文利用亲水相互作用色谱、反相色谱与毛细管电泳色谱等分离技术在线串联各种质谱实现了生物医药相关的糖胺聚糖类药物以及生物样本中提取的糖胺聚糖的定性、定量分析。为糖胺聚糖类药物结构确证提供了简单可靠的分析方法,为生物样品中糖胺聚糖的种类、含量、组成、健康与疾病个体差异等方面的研究提供了有效的技术手段,进而为寻找生物标志物以及新药开发开拓了道路。本论文的主要研究成果如下:1.建立了一种针对依诺肝素钠结构确证的方法我们采用酶法降解与化学法降解相结合的样品处理方法将非还原端、还原端及骨架结构进行区分,并利用亲水相互作用色谱串联多反应监测二级质谱技术对目前已报道的依诺肝素钠所有组成单元结构及部分新发现的结构进行了有效的分离并实现了全面的定性及相对定量分析。共鉴定到并定量了酶解产生的组成单元超过30种,包括天然存在及化学修饰后的各种肝素组成单元,及2个新结构;利用化学氧化及还原鉴定到11种末端结构。本方法经过重复性评价,有较好的稳定性及线性。在依诺肝素钠注射液样品分析中的应用表明本方法在LMWH相似性评价方面有着很高的应用价值。2.建立了一种针对亚硝酸降解制备低分子肝素的结构确证的方法我们使用了一种麦芽糖修饰的亲水相互作用色谱柱对复杂酸性二糖及寡糖的分离进行了优化。使用高分辨串联质谱共清晰的鉴定到亚硝酸降解制备的低分子肝素的36种基本组成单元。同时建立并验证了多反应监测二级质谱定量分析方法对达肝素钠和那屈肝素钙样品进行了对比研究。鉴定并定量的每一部分组成单元都可以揭示这一类低分子肝素不同方面的特性,如具有抗凝血活性的功能区域、来源于原料肝素的结构、降解反应的切割位点以及由于副反应产生的经过修饰的特殊结构等。3.介绍了一种新型串联质谱Interface在低分子肝素药物分析中的应用介绍了一种电动泵毛细管电泳色谱串联质谱方法,适用于分析糖胺聚糖寡糖,并使用了一种新型的interface实现了毛细管电泳色谱与质谱间的完美串联。毛细管电泳色谱分离与电喷雾效果分别使用挥发性的电解质碳酸氢铵与含有甲醇/甲酸的鞘流液进行了优化。实现了对肝素二糖到低分子肝素等各种高硫酸化的肝素寡糖的在线分析,且分析时间均在10分钟左右,为高通量分析提供了可能性。使用该方法,肝素糖链经正向电泳分离后在线串联正离子模式质谱分析,Bottom-up 与 Top-down 两种研究策略均有良好的重现性和较高的灵敏度。4.建立了一种快速分析人尿液中糖胺聚糖成分的方法通过对样品回收率、酶解处理和二糖分析技术等进行优化,建立了一种可以快速对人尿液中含量极低的糖胺聚糖进行定性定量分析的高效液相色谱串联质谱的方法。本方法利用多反应监测技术对经过重组肝素酶和硫酸软骨素酶降解的尿样中的糖胺聚糖进行研究。这一快速灵敏的方法实现了检测尿样中低水平的糖胺聚糖含量和二糖组成,可以检测到比患有如粘多糖病等代谢疾病的患者尿样中含量低10倍到100倍的糖胺聚糖成分。本方法可以检测到正常人尿样中含量极低(ng/mL)的糖胺聚糖,同时还可以检测到炎症、癌症等疾病病人尿样中糖胺聚糖含量和组成细微的差异。5.建立了一套研究新来源糖胺聚糖药物的提取及结构分析的方法建立了一套提取鸡蛋蛋清中硫酸角质素的方法及对所提取到的硫酸角质素进行色谱串联高分辨质谱分析的方法。我们使用商品化的鸡蛋蛋清作为原料,提取硫酸角质素,并利用色谱串联质谱、核磁共振波谱等技术进行结构鉴定,以开拓硫酸角质素的来源。对这种糖胺聚糖的研究对科学研究和药物研发均有重要的意义。另外,本章节中介绍的方法为研究各种组织中糖胺聚糖的结构提供了研究思路。将化学降解、酶解等样品处理方法和色谱、质谱、核磁共振波谱等分析技术相结合,可以对未知结构的、新来源的糖胺聚糖进行全面的结构表征,为功能研究提供有力的结构信息。
黄灿[10]2009年在《龙血竭化学成分分析及其与牛血清白蛋白相互作用研究》文中指出本文主要围绕龙血竭的化学成分及其有效成分与牛血清白蛋白的相互作用。借助多种现代仪器分析手段对龙血竭的部分化学成分的进行了定性、定量分析,并研究了龙血竭两个有效成分剑叶龙血素A(CA)、龙血素B(LB)与牛血清白蛋白(BSA)相互作用。本文共分四章。第一章主要综述了血竭的植物学来源及研究现状,主要涉及血竭的化学成分及相关药理活性研究。此外还概述了小分子与大分子相互作用的研究进展。并简明介绍了本论文的研究意义、主要内容及特色。第二章主要包括龙血竭化学成分的定性定量分析。首先借助液质联用仪对龙血竭提取物的酚类化合物进行了快速定性分析,共鉴定出11种酚类化合物。该方法无需借助对照品,结合文献报道,适合对龙血竭中已知化合物的快速定性分析。同时还建立了龙血竭中龙血素B(指标性成分)的毛细管电泳定量分析方法。采用毛细管胶束电泳模式,在优化的电泳条件下成功地对龙血竭中龙血素B进行了定量测定,供试品中龙血素B含量测定为4.116mg/g。第叁章采用光谱法(主要包括荧光、圆二色谱、紫外光谱法)研究了龙血竭中两个活性组分剑叶龙血素A、龙血素B与牛血清白蛋白的相互作用。探讨了两个体系(CA-BSA、LB-BSA)的荧光猝灭机理,计算了反应的结合常数、结合位点数及结合模式,结合距离等,并研究了两个药物小分子对牛血清白蛋白构象的影响。第四章利用亲和毛细管电泳法研究了剑叶龙血素A、龙血素B与牛血清白蛋白的相互作用。电泳结果表明两个药物小分子在电泳过程中与牛血清白蛋白发生了相互作用,并通过淌度移动法分别测定了CA、LB与BSA亲和作用的结合常数。本文以龙血竭为研究对象,采用多种分析手段对龙血竭的化学成分进行了定性定量研究,并选取龙血竭包含的复杂化学组分中两个活性小分子剑叶龙血素A、龙血素B,通过光谱法和毛细管电泳法研究了二者与牛血清白蛋白的相互作用。综合利用现代仪器分析方法,加强对龙血竭的化学成分和小分子活性研究,有利于提高龙血竭这一名贵中药的质量标准和更进一步阐明其治病机理,这也是中药现代化研究的重要方向。
参考文献：
[1]. 药物与蛋白和细胞相互作用的毛细管电泳研究[D]. 郭宝元. 重庆大学. 2003
[2]. 相互作用分析的毛细管电泳方法研究与应用[D]. 肖尚友. 重庆大学. 2006
[3]. 提取方法及毛细管电泳法在中药研究中的应用[D]. 周新. 吉林大学. 2005
[4]. 药物分子与生物相关物质相互作用的方法学研究及其在药物分析中的应用[D]. 高苏亚. 西北大学. 2012
[5]. 毛细管电泳在药物分析和食品安全检测中的应用[D]. 吴鸿伟. 陕西师范大学. 2007
[6]. 白藜芦醇、补骨脂及熊果酸与蛋白质的相互作用[D]. 赵玉清. 中南民族大学. 2009
[7]. 以DNA为一方的分子间相互作用的毛细管电泳研究[D]. 何新亚. 中国科学院研究生院（大连化学物理研究所）. 2003
[8]. 生命科学中的分析化学[C]. 佚名. 中国化学会第二十四届学术年会论文摘要集. 2004
[9]. 生物医药中糖胺聚糖结构分析新方法研究[D]. 孙晓君. 山东大学. 2017
[10]. 龙血竭化学成分分析及其与牛血清白蛋白相互作用研究[D]. 黄灿. 中南民族大学. 2009
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