鹅细小病毒反向遗传学操作系统搭建及其在衣壳蛋白核定位信号定向改造中的应用

论文摘要

小鹅瘟是由鹅细小病毒（Goose parvovirus,GPV）感染引起的鹅病毒血症及肠道栓塞的传染病。鹅细小病毒感染性克隆的构建是研究鹅细小病毒致病和复制机制的重要技术平台。经典核定位信号（Nuclear localization signal,NLS）是一段由精氨酸和赖氨酸组成的一段特殊序列,含有经典NLS序列的蛋白可以被细胞质的內输蛋白识别并协助该蛋白通过核孔复合体（Nuclear pore complex,NPC）进入细胞核。NLS对细小病毒完成生命周期具有关键性作用,但GPV NLS仍未被揭示。本研究将以临床分离GPV RC16株为模板构建其感染性克隆,并基于此平台探讨病毒衣壳蛋白核定位功能的氨基酸在病毒增殖中的作用,为GPV致弱疫苗的研发奠定基础。首先本研究以临床分离GPV RC16株病毒为模板,通过对其基因组进行扩增、亚克隆片段测序、拼接,并基于拼接的基因组序列绘制分子系统进化树,分子系统进化树分析结果表明该分离的毒株为鹅细小病毒。在此基础上,通过同源重组的方法依次连接亚克隆片段,构建了含有GPV RC16株全长基因组的质粒并命名为pIGPV RC16;通过脂质体转染的方法将pIGPV RC16转染原代鹅胚成纤维细胞（Goose embryo fibroblasts,GEF）以拯救病毒,并通过间接免疫荧光、遗传标记的鉴定及PCR产物测序的方法,证实病毒拯救成功;对第2代重组病毒的生长曲线进行测定,结果表明第2代病毒可在GEF细胞上进行复制。本研究基于PSORT II在线预测软件,对GPV结构蛋白（VP）1进行NLS序列预测,结果表明,在VP1第160位到171位氨基酸序列之间存在富含赖氨酸的基础区域（Basic region,BR）,该BR(160YPVVKKPKLTEE171)区疑似NLS。基于此预测,本研究构建了pEGFP-GPV NLS并转染细胞,以直接观察GFP蛋白定位的方法,证实BR(160YPVVKKPKLTEE171)可以将小分子量蛋白（GFP,分子量27 kDa）携带入细胞核;同时,本研究构建了pEGFP-GPV NLS-β-Gal并转染细胞,以SV40强核定位信号PKKKRKV构建pEGFP-SV40 NLS转染细胞为阳性对照,以直接观察GFP融合蛋白定位的方法,证实BR(160YPVVKKPKLTEE171)无法将大分子量蛋白（β-Gal,分子量100kDa）携带入细胞核。综上,GPV结构蛋白的BR(160YPVVKKPKLTEE171)具备核定位功能,但并非强核定位信号。进一步,本研究分别构建VP1中164K,165K和167K氨基酸位点丙氨酸突变的GFP融合蛋白真核表达质粒,转染细胞并观察荧光的细胞定位情况,发现第164位、165位和167位赖氨酸在将VP1定位到细胞核的过程中发挥关键作用。为了揭示VP1第164位、165位和167位赖氨酸在鹅细小病毒增殖中的作用,本研究通过重叠PCR方法构建NLS突变的感染性克隆并命名为pIGPV RC16K164A、pIGPV RC16K165A和pIGPV RC16K167A,将其转染GEF后发现无法拯救突变病毒,表明NLS关键位点164K、165K和167K是子代病毒复制所必需的。本研究首先构建了GPV RC16株感染性克隆,并在GEF上成功拯救重组病毒;鉴定了鹅细小病毒NLS为160YPVVKKPKLTEE171,并揭示其关键氨酸位点为164K、165K和167K;基于感染性克隆操作平台,构建了NLS关键位点164K、165K和167K突变的病毒,并证明164K、165K和167K三位点是子代病毒的增殖所必需的。本研究为进一步获得GPV弱毒疫苗候选株奠定基础。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘鹏

导师: 陈舜,方鹏飞

关键词: 鹅细小病毒,衣壳蛋白,核定位信号,感染性克隆,病毒增殖

来源: 四川农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 四川农业大学

分类号: S852.65

DOI: 10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.000928

总页数: 63

文件大小: 2411k

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