细叶百合LpWRKY20基因的克隆及其对烟草的遗传转化

细叶百合LpWRKY20基因的克隆及其对烟草的遗传转化

论文摘要

细叶百合(Lilium pumilum 花下垂、花被片反卷、花朵娇艳。是一种重要的观赏性花卉,是百合抗性育种的重要亲本。本研究从细叶百合转录组中筛选出WRKY转录因子家族,分析该家族在休眠解除过程中的表达情况;从中选取对休眠解除具有调控作用的基因,分析其对非生物胁迫的响应;克隆该基因并对其进行生物信息学分析;构建植物表达载体转化到烟草中;对转基因植株进行干旱胁迫,通过对干旱胁迫下的表型观察及生理指标测定,明确该基因是否具有抗旱功能。本文主要研究结果如下:1.通过分析细叶百合休眠解除转录组中的WRKY转录因子家族,从中共分离出了40个WRKY转录因子,其中GroupⅠ共有6个基因、GroupII共有28个基因、GroupⅢ有6个基因。随着休眠解除LpWRKY20基因的相对表达量逐渐升高,证明其参与了休眠解除的过程。2.在休眠过程中往往伴随着非生物的胁迫,荧光定量分析表明在不同的非生物胁迫中LpWRKY20表达量存在差异且在不同的组织器官中表达模式也不相同。干旱胁迫下LpWRKY20在鳞茎中出现了明显的上调表达,推测基因对干旱的响应较为敏感。3.该基因开放阅读框(ORF)为1899bp,预测编码632个氨基酸。保守结构域分析显示,LpWRKY具有两个高度保守的WRKY结构域属于GroupⅠ组基因。生物信息学分析显示蛋白相对分子量为68.36kDa,理论等电点为5.45,为亲水性蛋白,不含信号肽且没有跨膜结构;亚细胞定位预测显示该基因在细胞核中表达;蛋白二级结构主要以“mixed”型蛋白存在。4.用双酶切法构建pBI121-LpWRKY20-GFP植物表达载体,经农杆菌介导叶盘法将其转入烟草中并获得抗性植株。利用基因枪法将融合表达载体和pBI121-GFP植物表达载体轰入洋葱表皮细胞进行亚细胞定位分析,结果显示融合表达载体只在细胞核中表达。5.转基因植株在干旱胁迫中的SOD活性、CAT活性均高于对照,且随着时间的延长这种清除体内自由基的能力在显著升高,而MDA含量均低于对照,说明转基因植株细胞膜受损程度较低,其具有较强的自我修复能力。干旱条件下生理指标的变化反应了转基因植株抗性要强于对照,初步推断LpWRK具有抗旱的功能。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 1 绪论
  •   1.1 百合研究进展
  •     1.1.1 百合休眠解除研究进展
  •     1.1.2 百合抗性研究
  •   1.2 WRKY转录因子研究进展
  •     1.2.1 WRKY转录因子的结构及分类
  •     1.2.2 WRKY转录因子的生物学功能
  •   1.3 研究的目的及意义
  • 2 低温储藏期间WRKY转录因子家族的分析
  •   2.1 实验方法
  •     2.1.1 细叶百合低温储藏期间转录组构建
  •     2.1.2 WRKY转录因子的筛选
  •     2.1.3 细叶百合WRKY转录因子家族保守序列分析
  •     2.1.4 细叶百合WRKY转录因子表达模式聚类分析
  •     2.1.5 荧光定量分析LpWRKY基因在休眠解除过程中的相对表达水平
  •   2.2 结果分析
  •     2.2.1 WRKY转录因子的筛选
  •     2.2.2 细叶百合WRKY转录因子保守序列分析
  •     2.2.3 细叶百合WRKY转录因子表达模式聚类分析
  •     2.2.4 低温储藏不同时期LpWRKY20相对表达量分析
  •   2.3 本章小结
  • 3 LpWRKY20基因在非生物胁迫下表达模式
  •   3.1 实验材料
  •     3.1.1 植物材料
  •     3.1.2 主要试剂
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 幼苗处理
  •     3.2.2 RNA提取
  •     3.2.3 cDNA合成
  •     3.2.4 引物设计与合成
  •     3.2.5 qRT-PCR反应
  •     3.2.6 基因相对表达量计算
  •   3.3 结果与分析
  •     3.3.1 干旱胁迫对LpWRKY20的表达影响
  •     3.3.2 盐胁迫对LpWRKY20的表达影响
  •     3.3.3 低温对LpWRKY20的表达影响
  •     3.3.4 脱落酸对LpWRKY20的表达影响
  •   3.4 本章小结
  • 4 LpWRKY20基因的克隆及其生物信息学分析
  •   4.1 实验材料
  •     4.1.1 植物材料
  •     4.1.2 菌株及主要试剂
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 细叶百合总RNA的提取
  •     4.2.2 cDNA第一条链的合成
  •     4.2.3 目的片段扩增反应
  •     4.2.4 目的片段胶回收
  •     4.2.5 3'端的dA附加反应
  •     4.2.6 PCR产物与pTA2 Vector载体连接
  •     4.2.7 连接产物转化大肠杆菌DH5a及质粒提取
  •   4.3 结果与分析
  •     4.3.1 目的片段的PCR扩增
  •     4.3.2 目的条带胶回收
  •     4.3.3 菌落PCR鉴定
  •     4.3.4 细叶百合LpWRKY20序列分析
  •     4.3.5 细叶百合LpWRKY20蛋白多序列比对及系统进化分析
  •     4.3.6 细叶百合LpWRKY20保守结构域分析
  •     4.3.7 细叶百合LpWRKY20蛋白特性分析
  •   4.4 本章小结
  • 5 LpWRKY20对烟草遗传转化及亚细胞定位
  •   5.1 实验材料及试剂
  •     5.1.1 植物材料
  •     5.1.2 菌株及主要试剂
  •     5.1.3 所需培养基
  •   5.2 实验方法
  •     5.2.1 中间表达载体的构建
  •     5.2.2 植物表达载体的构建
  •     5.2.3 植物表达载体转化农杆菌
  •     5.2.4 叶盘法转化烟草
  •     5.2.5 转基因植株的分子水平鉴定
  •     5.2.6 亚细胞定位
  •   5.3 结果与分析
  •     5.3.1 中间表达载体的构建
  •     5.3.2 植物表达载体构建
  •     5.3.3 农杆菌重组质粒的PCR鉴定
  •     5.3.4 洋葱表皮亚细胞定位
  •     5.3.5 转基因烟草外植体分化
  •     5.3.6 转基因烟草分子水平检测
  •     5.3.7 转LpWRKY20基因T1代植株获得
  •   5.4 本章小结
  • 6 转基因烟草抗旱功能分析
  •   6.1 实验材料及试剂
  •     6.1.1 实验材料
  •     6.1.2 主要试剂和仪器设备
  •   6.2 实验方法
  •     6.2.1 转LpWRKY20基因烟草CAT的测定
  •     6.2.2 转LpWRKY20基因烟草SOD的测定
  •     6.2.3 转LpWRKY20基因烟草MDA的测定
  •   6.3 结果与分析
  •     6.3.1 转基因植株在干旱胁迫中表型观察
  •     6.3.2 转基因烟草在干旱胁迫中生理指标的变化
  •   6.4 本章小结
  • 7 讨论
  •   7.1 细叶百合WRKY家族的分析
  •   7.2 LpWRKY20基因与休眠的关系
  • 结论与建议
  • 参考文献
  • 攻读学位期间发表的学术论文
  • 致谢
  • 附件
  • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 杨柳慧

    导师: 周蕴薇

    关键词: 细叶百合,转录因子,克隆,烟草转化,抗旱

    来源: 东北林业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,生物学,园艺

    单位: 东北林业大学

    基金: 国家自然科学基金面上项目(31470698)

    分类号: S682.29;Q943.2

    DOI: 10.27009/d.cnki.gdblu.2019.000784

    总页数: 74

    文件大小: 7362K

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    • [1].细叶百合LpWRKY20基因对非生物胁迫的响应及抗旱性分析[J]. 草业学报 2020(01)
    • [2].细叶百合LpWRKY20基因的克隆和表达分析[J]. 西北林学院学报 2019(03)

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