论文摘要
细叶百合(Lilium pumilum 花下垂、花被片反卷、花朵娇艳。是一种重要的观赏性花卉,是百合抗性育种的重要亲本。本研究从细叶百合转录组中筛选出WRKY转录因子家族,分析该家族在休眠解除过程中的表达情况;从中选取对休眠解除具有调控作用的基因,分析其对非生物胁迫的响应;克隆该基因并对其进行生物信息学分析;构建植物表达载体转化到烟草中;对转基因植株进行干旱胁迫,通过对干旱胁迫下的表型观察及生理指标测定,明确该基因是否具有抗旱功能。本文主要研究结果如下:1.通过分析细叶百合休眠解除转录组中的WRKY转录因子家族,从中共分离出了40个WRKY转录因子,其中GroupⅠ共有6个基因、GroupII共有28个基因、GroupⅢ有6个基因。随着休眠解除LpWRKY20基因的相对表达量逐渐升高,证明其参与了休眠解除的过程。2.在休眠过程中往往伴随着非生物的胁迫,荧光定量分析表明在不同的非生物胁迫中LpWRKY20表达量存在差异且在不同的组织器官中表达模式也不相同。干旱胁迫下LpWRKY20在鳞茎中出现了明显的上调表达,推测基因对干旱的响应较为敏感。3.该基因开放阅读框(ORF)为1899bp,预测编码632个氨基酸。保守结构域分析显示,LpWRKY具有两个高度保守的WRKY结构域属于GroupⅠ组基因。生物信息学分析显示蛋白相对分子量为68.36kDa,理论等电点为5.45,为亲水性蛋白,不含信号肽且没有跨膜结构;亚细胞定位预测显示该基因在细胞核中表达;蛋白二级结构主要以“mixed”型蛋白存在。4.用双酶切法构建pBI121-LpWRKY20-GFP植物表达载体,经农杆菌介导叶盘法将其转入烟草中并获得抗性植株。利用基因枪法将融合表达载体和pBI121-GFP植物表达载体轰入洋葱表皮细胞进行亚细胞定位分析,结果显示融合表达载体只在细胞核中表达。5.转基因植株在干旱胁迫中的SOD活性、CAT活性均高于对照,且随着时间的延长这种清除体内自由基的能力在显著升高,而MDA含量均低于对照,说明转基因植株细胞膜受损程度较低,其具有较强的自我修复能力。干旱条件下生理指标的变化反应了转基因植株抗性要强于对照,初步推断LpWRK具有抗旱的功能。
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摘要Abstract1 绪论 1.1 百合研究进展 1.1.1 百合休眠解除研究进展 1.1.2 百合抗性研究 1.2 WRKY转录因子研究进展 1.2.1 WRKY转录因子的结构及分类 1.2.2 WRKY转录因子的生物学功能 1.3 研究的目的及意义2 低温储藏期间WRKY转录因子家族的分析 2.1 实验方法 2.1.1 细叶百合低温储藏期间转录组构建 2.1.2 WRKY转录因子的筛选 2.1.3 细叶百合WRKY转录因子家族保守序列分析 2.1.4 细叶百合WRKY转录因子表达模式聚类分析 2.1.5 荧光定量分析LpWRKY基因在休眠解除过程中的相对表达水平 2.2 结果分析 2.2.1 WRKY转录因子的筛选 2.2.2 细叶百合WRKY转录因子保守序列分析 2.2.3 细叶百合WRKY转录因子表达模式聚类分析 2.2.4 低温储藏不同时期LpWRKY20相对表达量分析 2.3 本章小结3 LpWRKY20基因在非生物胁迫下表达模式 3.1 实验材料 3.1.1 植物材料 3.1.2 主要试剂 3.2 实验方法 3.2.1 幼苗处理 3.2.2 RNA提取 3.2.3 cDNA合成 3.2.4 引物设计与合成 3.2.5 qRT-PCR反应 3.2.6 基因相对表达量计算 3.3 结果与分析 3.3.1 干旱胁迫对LpWRKY20的表达影响 3.3.2 盐胁迫对LpWRKY20的表达影响 3.3.3 低温对LpWRKY20的表达影响 3.3.4 脱落酸对LpWRKY20的表达影响 3.4 本章小结4 LpWRKY20基因的克隆及其生物信息学分析 4.1 实验材料 4.1.1 植物材料 4.1.2 菌株及主要试剂 4.2 实验方法 4.2.1 细叶百合总RNA的提取 4.2.2 cDNA第一条链的合成 4.2.3 目的片段扩增反应 4.2.4 目的片段胶回收 4.2.5 3'端的dA附加反应 4.2.6 PCR产物与pTA2 Vector载体连接 4.2.7 连接产物转化大肠杆菌DH5a及质粒提取 4.3 结果与分析 4.3.1 目的片段的PCR扩增 4.3.2 目的条带胶回收 4.3.3 菌落PCR鉴定 4.3.4 细叶百合LpWRKY20序列分析 4.3.5 细叶百合LpWRKY20蛋白多序列比对及系统进化分析 4.3.6 细叶百合LpWRKY20保守结构域分析 4.3.7 细叶百合LpWRKY20蛋白特性分析 4.4 本章小结5 LpWRKY20对烟草遗传转化及亚细胞定位 5.1 实验材料及试剂 5.1.1 植物材料 5.1.2 菌株及主要试剂 5.1.3 所需培养基 5.2 实验方法 5.2.1 中间表达载体的构建 5.2.2 植物表达载体的构建 5.2.3 植物表达载体转化农杆菌 5.2.4 叶盘法转化烟草 5.2.5 转基因植株的分子水平鉴定 5.2.6 亚细胞定位 5.3 结果与分析 5.3.1 中间表达载体的构建 5.3.2 植物表达载体构建 5.3.3 农杆菌重组质粒的PCR鉴定 5.3.4 洋葱表皮亚细胞定位 5.3.5 转基因烟草外植体分化 5.3.6 转基因烟草分子水平检测 5.3.7 转LpWRKY20基因T1代植株获得 5.4 本章小结6 转基因烟草抗旱功能分析 6.1 实验材料及试剂 6.1.1 实验材料 6.1.2 主要试剂和仪器设备 6.2 实验方法 6.2.1 转LpWRKY20基因烟草CAT的测定 6.2.2 转LpWRKY20基因烟草SOD的测定 6.2.3 转LpWRKY20基因烟草MDA的测定 6.3 结果与分析 6.3.1 转基因植株在干旱胁迫中表型观察 6.3.2 转基因烟草在干旱胁迫中生理指标的变化 6.4 本章小结7 讨论 7.1 细叶百合WRKY家族的分析 7.2 LpWRKY20基因与休眠的关系结论与建议参考文献攻读学位期间发表的学术论文致谢附件
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 杨柳慧
导师: 周蕴薇
关键词: 细叶百合,转录因子,克隆,烟草转化,抗旱
来源: 东北林业大学
年度: 2019
分类: 基础科学,农业科技
专业: 生物学,生物学,园艺
单位: 东北林业大学
基金: 国家自然科学基金面上项目(31470698)
分类号: S682.29;Q943.2
DOI: 10.27009/d.cnki.gdblu.2019.000784
总页数: 74
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相关论文文献
- [1].细叶百合LpWRKY20基因对非生物胁迫的响应及抗旱性分析[J]. 草业学报 2020(01)
- [2].细叶百合LpWRKY20基因的克隆和表达分析[J]. 西北林学院学报 2019(03)
标签:细叶百合论文; 转录因子论文; 克隆论文; 烟草转化论文; 抗旱论文;
细叶百合LpWRKY20基因的克隆及其对烟草的遗传转化
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