董晓慧[1]2004年在《赤拟谷盗热激蛋白70基因的竞争定量PCR系统的构建》文中研究指明利用RT-PCR技术构建了赤拟谷盗（Tribolium castaneum）热激蛋白70基因的竞争定量PCR系统.竞争性对照模板的构建方法是：利用计算机辅助优选设计引物，在合适的退火温度下，得到单一的特异性强的赤拟谷盗的热激蛋白70靶标基因的条带，而后降低退火温度，从几条非靶标的条带中选择一条，后经胶回收纯化、连接、转化，最后得到纯的质粒。此质粒就是在赤拟谷盗的竞争定量PCR系统中的竞争性对照模板，它与赤拟谷盗的热激蛋白70靶标基因的两端都含有PCR引物DNA序列，但是它们的PCR产物的分子量不同，并且能通过琼脂糖凝胶电泳区分开来。在竞争PCR中，利用系列浓度稀释后的竞争性对照模板与靶标DNA在同一试管中反应，由于它们互相竞争PCR引物的结果，靶标PCR产物和竞争性对照模板PCR产物的量呈线性相关。利用光密度分析仪得到竞争性对照模板PCR产物和靶标PCR产物的相对量，并可以得到它们之间的比值。由它们之间的比值，我们绘制了竞争性对照模板的初始浓度与竞争性对照模板PCR产物和靶标PCR产物比值之间的标准曲线，并得到它们之间的线性方程为Y=1.032X-1.618，其中相关系数r2=0.975。 本研究利用降低退火温度的方法得到了对赤拟谷盗热激蛋白70基因进行竞争PCR定量的内部竞争物，通过内部竞争物和目的基因共同竞争底物和引物，得到它们的PCR产物的比值，绘制它的标准曲线，建立了它的竞争定量PCR系统，为它的热激蛋白70基因定量提供了方便，并为研究热激蛋白在转录水平上的表达规律奠定了基础。同时，为在昆虫中构建竞争定量PCR系统的理论提供了依据。
苏丽娟, 董晓慧, 尹新明[2]2011年在《赤拟谷盗HSP70基因克隆和竞争定量PCR检测》文中进行了进一步梳理为研究赤拟谷盗Tribolium castaneum受到热胁迫后高度保守的热激蛋白70(heat shock protein70,HSP70)基因的表达变化,本研究扩增了681bp的赤拟谷盗hsp70片段,编码227个氨基酸残基,GenBank登录号为HM345948。同源性分析表明:赤拟谷盗hsp70核苷酸序列与马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata的hsp70(GenBank登录号:AF322911.1)同源性最高,为97%;其推测的蛋白序列与马铃薯甲虫、甘蓝夜蛾Mamestra brassicae、黑腹果蝇Drosophila melanogaster和美洲斑潜蝇Liriomyza sativae的HSP70蛋白均有94%以上的同源性。利用RT-PCR技术得到与赤拟谷盗hsp70进行竞争定量的内部竞争物,以等量的目标cDNA和一系列稀释的竞争模板进行竞争PCR扩增,构建了hsp70的竞争定量PCR检测体系,该体系标准曲线的线性方程为Y=1.032X-1.618(r2=0.975)。这些结果为赤拟谷盗的hsp70定量检测提供了方便,并为热控技术防治害虫提供了基础资料。
参考文献：
[1]. 赤拟谷盗热激蛋白70基因的竞争定量PCR系统的构建[D]. 董晓慧. 河南农业大学. 2004
[2]. 赤拟谷盗HSP70基因克隆和竞争定量PCR检测[J]. 苏丽娟, 董晓慧, 尹新明. 昆虫学报. 2011