EV71通过促进ACOX1蛋白降解和ROS积累诱导神经细胞凋亡和自噬的初步研究

论文摘要

肠道病毒71型（Enterovirus 71,EV71）感染引起手足口病（hand,foot,and mouth disease,HFMD）,部分病例伴有神经系统并发症,甚至导致死亡。然而,关于EV71感染导致神经炎症及神经细胞死亡的机制还不完全清楚。本研究中,我们发现了一种EV71感染导致神经细胞凋亡和自噬的新机制。我们使用人类全基因组cDNA文库进行酵母双杂交筛选,发现EV71聚合酶3D蛋白（RNA-dependent RNA polymerase,RdRp）与过氧化物酶体酰基辅酶A氧化酶1蛋白（Acyl-coenzyme A oxidase 1,ACOX1）相互作用,并通过蛋白质免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）验证了两者的相互作用,进一步的实验发现3D蛋白通过其手掌结构域与ACOX1的N端结构域相互作用。我们还发现,EV71感染下调ACOX1蛋白水平的表达,但不影响其mRNA水平的表达。在人星形胶质细胞瘤细胞（U251）中稳定表达的3D蛋白也使ACOX1蛋白下降,并且这种下调部分依赖蛋白酶体途径。ACOX1是过氧化物酶体（Peroxisome）的重要组成部分,是过氧化物酶体中长链脂肪酸（very long chain fatty acid,VLCFA）β氧化过程的关键限速酶。文献报道,ACOX1蛋白的缺失会造成过氧化物酶体数量减少、血液中VLCFA积累、神经细胞脱髓鞘和神经炎症的发生。我们的研究发现,使用siRNA敲低ACOX1的表达会使U251细胞中过氧化物酶体数量减少。并且,EV71感染使RD细胞和U251细胞中过氧化物酶体的数量减少。过氧化物酶体的组成型蛋白ABCD1的缺失也会造成过氧化物酶体β氧化功能障碍、VLCFA积累和神经细胞脱髓鞘并导致神经细胞发生凋亡;因此我们推测,ACOX1表达量下降可能也会造成神经细胞的凋亡。我们使用CCK8细胞增殖和毒性检测实验发现,在神经细胞细胞系SK-N-SH和U251中,干扰ACOX1会使活细胞数量减少,而在RD细胞中干扰ACOX1,活细胞数量无明显变化。进一步检测死细胞和受损细胞释放的LDH发现,在SK-N-SH细胞中干扰ACOX1会时间依赖地导致细胞损伤和死亡。U251细胞中稳定表达的3D蛋白也使活细胞减少。接着我们检测了细胞凋亡和自噬的标志蛋白的表达,结果证明在神经细胞SK-N-SH和U251细胞系中干扰ACOX1导致细胞凋亡和自噬,而在RD细胞中干扰ACOX1不会导致细胞凋亡。在人星形胶质细胞瘤细胞（U251）中干扰过氧化物酶体组成蛋白PEX19也导致细胞凋亡和自噬。我们假设EV71可通过下调ACOX1蛋白导致神经细胞病变。使用稳定干扰ACOX1的U251和SK-N-SH细胞系进行实验发现:对照细胞中EV71感染会显著造成细胞病变（Cytopathic Effect,CPE）、细胞凋亡指示剂Hoechst 33258染色加深、活细胞数量减少（CCK8实验）和LDH释放增加;而在稳定干扰ACOX1的细胞中,EV71造成的以上细胞病变现象显著减弱,说明在SK-N-SH和U251细胞中,EV71感染是通过下调ACOX1造成细胞病变的。我们进一步探究EV71通过调控ACOX1导致细胞病变的机制。已有文献报道ACOX1缺失和过氧化物酶体功能障碍会导致细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平升高,而ROS升高与细胞凋亡有关。EV71感染RD细胞和U251细胞均导致ROS水平升高,而干扰ACOX1只会在U251细胞中使ROS升高。EV71感染和干扰ACOX1均诱导RD细胞中抗氧化蛋白血红素加氧酶1（heme oxygenase1,HO-1）的表达,而降低U251细胞中HO-1的表达。并且,EV71感染和干扰ACOX1通过DJ-1/NRF2通路调控HO-1表达;此外U251细胞中稳转EV71的3D蛋白也通过DJ-1/NRF2通路降低HO-1的表达。在RD细胞和U251细胞中,加入抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）和α-硫辛酸（α-lipoic acid,LA）均能保护EV71感染的细胞,说明EV71感染可通过诱导ROS的积累导致细胞病变。最后,我们发现干扰ACOX1可促进EV71的复制,并且这种抑制作用在神经细胞U251中是部分通过诱导ROS来实现的,加入抗氧化剂能抑制EV71复制。综上所述,我们发现了一种EV71感染导致神经细胞凋亡和自噬的新机制。EV71感染可通过其3D蛋白下调过氧化物酶体中ACOX1蛋白的表达并使过氧化物酶体数量减少。在EV71感染和ACOX1蛋白减少的神经细胞中,一方面ROS大量产生,另一方面细胞内抗氧化通路被抑制,导致细胞内ROS的积累和凋亡/自噬的发生;而抗氧化剂一方面能减少ROS,另一方面能抑制EV71复制,进而达到保护细胞的作用。

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摘要

Abstract

第一章研究背景

1.1 手足口病和肠道病毒71型

1.1.1 肠道病毒71 型的发现和流行病学

1.1.2 肠道病毒71 型的分子病毒学

1.1.3 肠道病毒71 型的致病机制

1.1.4 肠道病毒71 型感染的预防和治疗

1.2 过氧化物酶体和ACOX

1.2.1 过氧化物酶体的生成

1.2.2 过氧化物酶体的功能

1.2.3 过氧化物酶体功能异常和相关疾病

1.2.4 酰基辅酶A氧化酶1（ACOX1）

第二章实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 细胞系以及病毒株

2.1.2 质粒、引物和siRNA

2.1.3 抗体、试剂和试剂盒

2.2 实验方法

2.2.1 克隆构建

2.2.2 细胞培养及细胞转染

2.2.3 细胞总RNA提取及RT-PCR

2.2.4 Western-blot

2.2.5 免疫共沉淀（Co-IP）

2.2.6 病毒扩增、浓缩及滴度测定

2.2.7 免疫荧光

2.2.8 细胞增殖和毒性检测

2.2.9 活性氧检测

第三章实验结果

3.1 EV713D蛋白与ACOX1 蛋白相互作用

3.2 EV71 感染下调ACOX1 蛋白的表达并使过氧化物酶体数量减少

3.2.1 EV71 感染下调ACOX1 蛋白水平的表达

3.2.2 EV71 感染使细胞内过氧化物酶体的数量减少

3.3 干扰ACOX1 诱导神经细胞凋亡和自噬

3.4 EV71 感染通过下调ACOX1 导致神经细胞死亡

3.5 EV71 感染和ACOX1 下调诱导ROS导致神经细胞死亡

3.5.1 EV71 感染和ACOX1 下调诱导ROS

3.5.2 EV71 感染和ACOX1 下调抑制DJ-1/Nrf2/HO-1 信号通路导致神经细胞死亡

3.6 在神经细胞中ACOX1 的下调通过诱导ROS促进EV71 复制

3.6.1 ACOX1 下调促进EV71 复制

3.6.2 神经细胞中ACOX1 下调通过诱导ROS促进EV71 复制

第四章讨论

参考文献

研究生期间发表的论文

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 游蕾

导师: 刘映乐

关键词: 肠道病毒型,活性氧,血红素氧化酶,抗氧化剂

来源: 武汉大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 武汉大学

分类号: R373

总页数: 65

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EV71通过促进ACOX1蛋白降解和ROS积累诱导神经细胞凋亡和自噬的初步研究

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